行動経験に続いて脳試料からの転写動態の網羅的解析

本実験の全体的な目的は、行動経験後のマウスにおける転写ダイナミクスおよび特定の脳核を研究することである。まず、動物を順化させ、生理食塩水注入後の自発的な運動活性を記録する。順化後、コカインを単回投与した後の運動活性を記録し、次に側坐核からサンプルを採取して、RNA抽出およびcDNA調製に用いる。

次に、行動によって誘導される遺伝子発現を調べるため、QPCR解析を行います。最終的に、コカイン投与後の転写動態を示す結果が得られます。プロトコルの実演は、ラボマネージャーのDr.Hatu、大学院生のDum Muer、および学部生のDuranが担当します。3日間連続で、各マウスをハンドリングと注射の手順に慣れさせます。実験開始前にマウスをケージに割り当て、今後ケージ間の移動が発生しないようにし、またマウスが長時間にわたって単独で放置されないようにします。

試験開始の30分前に、すべての試験ケージを行動解析室に移動させ、動物を環境に慣れさせます。生理食塩水を250 µL腹腔内投与し、直後にマウスを行動解析チャンバーに入れ、15分間自発運動性を観察します。マウスを行動解析チャンバーに20分間留置することも可能です。

2分から17分まで活動量をモニタリングします。翌2日間、1日の同じ時間帯にこれらの手順を繰り返します。4日目に、群に応じてコカインまたは生理食塩水を単回投与し、直ちにマウスをチャンバーに入れ、コカイン曝露後の指定した時間において20分間、局所的な運動活動をモニタリングします。その後、脳を摘出し、冷却および硬化させるため、氷冷したA CSF溶液に1〜2分間浸します。

小脳を除去し、過剰な液体を吸い取った後、脳の吻側側が上を向くようにVibratomeのステージに固定します。チャンバーに氷冷したA CSFを満たし、側坐核が明確に確認できるまで200 micronの厚さで切片を作成します。切断中は、脳梁の形状、前交連の位置と形状、および脳室に十分注意してください。

適切な領域を特定したら、400 µmの厚さで2枚の切片を作成し、実体顕微鏡下で側坐核を切り出します。細いブレードを用いて、切片から側坐核を切り離します。適切な領域をブレードで素早く4回切断することで、目的の組織を速やかに単離できます。

単離した組織を900 µLの溶解試薬に入れ、RNA抽出まで-80 °Cで保存します。チューブを37 °Cで解凍し、ホモジナイズします。25Gの針を使用しますが、最初の数回は困難な場合があるため、組織をチューブの壁に押し付けて細かくホモジナイズしてください。適切にホモジナイズされていることを確認するため、溶解物をKaya Shredder Mini Spin Columnにピペットで移し、遠心分離します。

溶解物を新しいマイクロ遠心チューブにピペッティングし、製造元の指示に従ってRNAを抽出します。RNA精製後、cDNAへの逆転写を行い、さらに解析用に選択した遺伝子群に対するプライマーを用いて、サンプルの標的特異的プレ増幅を行います。これらの手順は、プロトコルのテキスト版に記載されています。

包括的なQPCR解析用の市販マイクロ流体チップには、48サンプルを48種類のプローブセットで解析可能な48×48フォーマットと、96サンプルを96種類のプローブで解析可能な96×96フォーマットがあります。多くの場合、チップの選択は主に解析するサンプル数によって決まります。

まず、実験に選択したチップに応じてサンプルミックスを調製します。20 XDNA 結合染料サンプルロード試薬をピペッティングする際は注意してください。サンプルミックス溶液を最低 20 秒間撹拌し、その後少なくとも 30 秒間遠心分離します。

調製した反応液は、チップへのロード準備が整うまで、4 °Cで短期間保存できます。次に、アッセイミックスを調製し、サンプルミックスを十分に攪拌した後、遠心分離してすべての成分を沈殿させます。前述の通り、ダイナミックアレイIFCチップには、サンプル用およびアッセイ用のインレットのほか、マイクロ流体チャンバーを加圧するために使用するコントロールライン液用の指定インレットがあります。

まず、チップ上の各アキュムレーターにコントロールライン液体を注入します。次に、チップをIFCコントローラーにセットし、適切なスクリプトを実行してプライミングを行います。スクリプトが完了したら、プライミング済みのチップをIFCコントローラーから取り出し、各アッセイを5 µLずつピペッティングします。

チップ上で混合します。各サンプル混合液 5 µLをそれぞれのインレットに添加し、IFCコントローラーのソフトウェアを使用してチップをIFCコントローラーに戻します。スクリプトを実行して、サンプルとアッセイをチップにロードします。

ロードミックススクリプトが終了したら、ロード済みのチップをIFCコントローラーから取り出します。次に、チップをサーマルサイクラーにロードし、融解曲線分析を含む新しいチップランを作成します。サーマルサイクラーのソフトウェアを使用して、反応チャンバーが正しく認識されていることを確認し、反応を完了させます。

1回の急性コカイン投与後、自発的な運動量の増加が認められました。この冠状断切片において、太い白線は側坐核の境界を定義するために行われた切断部位を示しています。解剖中のc-fosおよびphos Bを標的としたプライマーの増幅曲線により、これらのプライマーペアが標的転写物をほぼ100%の効率で増幅することが示されています。

すべてのサイクルにおいて、コカインによる側坐核でのCFOsおよびphos Bの発現誘導は、曝露から1時間後および2時間後に最大となることが結果から示されています。この手順に続き、次世代シーケンシングなどの他の手法を実施することで、未特性の新規転写物を同定することが可能です。