行動経験に続いて脳試料からの転写動態の網羅的解析
August 26th, 2014
この原稿は、行動パラダイムに従ってげっ歯類の特定の脳核に誘導される転写プログラムの分析に包括的なプロファイリングを適用するプロトコルについて説明しています。ここでは、このアプローチを、マイクロ流体qPCRアレイを利用して、急性コカイン曝露後にマウスの側坐核(NAc)に誘導される遺伝子のプロファイリングの文脈で示します。
次の実験の全体的な目標は、行動経験後のマウスの転写ダイナミクスと定義された脳核を研究することです。これは、最初に動物を慣れさせ、生理食塩水注射後の自発運動活動を記録することによって達成されます。一度慣れると、コカインの単回投与後に自発運動活動が記録され、側坐核からのサンプルが収集され、RNA単離とCDNA調製に使用されます。
次に、行動によって誘発される遺伝子発現を研究するために、QPCR解析を行います。最終的に、コカイン体験後の転写動態を示す結果が得られます プロトコルを実証するのは、ラボマネージャーのハトゥ博士、ラボの大学院生であるダム・ミューア、ラボの学部生であるデュランが3日間連続で行います。各マウスは、実験を開始する前にマウスをケージに整理し、マウスをケージに整理し、取り扱いおよび注入手順に慣れているため、将来マウスがケージ間で移動することはなく、マウスが長期間隔離されたまま放置
されることもありません。試験開始の30分前に、動物が環境に順応できるように、すべての試験ケージを行動室に移す必要があります。注射の直後に250マイクロリットルの生理食塩水を腹腔内注射し、マウスを行動チャンバーに入れて自発運動活動を15分間監視します。マウスをビヘイビアチャンバーに20分間置くことができます。
2 分から 17 分まで監視されたアクティビティ。次の 2 日間、これらの手順を 1 日の同じ時間に繰り返します。4日目に、グループに応じて、コカインまたは生理食塩水の単回注射を投与し、すぐにマウスをチャンバーに入れて、コカイン曝露後の選択された時点での局所的な運動活動を20分間監視し、脳を抽出して氷冷し、CSF溶液を1〜2分間冷やして固めます。
小脳を取り除き、余分な水分を吸い取った後、吻側部分を上に向けて脳をビブラムのステージに接着します。チャンバーに氷冷したA CSFを充填し、側坐核が明確に識別されるまで200ミクロンの切片をスライスします。切断中は、脳梁の形状、前交連と心室の位置と形状に細心の注意を払ってください。
正しい領域が特定されたら、側坐核をステレオスコープで解剖する400ミクロンの2つのセクションをスライスします。細かい刃を使用して、側坐核をスライスから離剖します。ブレードを正しい領域に4回すばやくパスすると、適切な組織をすぐに分離する必要があります。
単離した組織を900マイクロリットルの溶解試薬に入れ、RNA抽出が始まるまでマイナス80°Cで保存し、チューブを37°Cで解凍して均質化します。25ゲージの針を使用すると、最初の数ラウンドは難しく、組織をチューブの壁に押し付けて組織を細かく均質化する必要があります。適切な均質化を確保するには、ライセートをkayaシュレッダーミニスピンカラムにピペットで移し、遠心分離します。
ライセートを新しいマイクロ遠心チューブにピペットで移し、製造元の指示に従ってRNAを抽出します。RNA精製に続いて、CDNAへの逆転写を行い、解析用に選択した遺伝子群に対するプライマーを用いたサンプルの標的特異的なプレエム増幅を行います。これらの手順は、プロトコルのテキストバージョンで説明されています。
包括的なQPCR解析用の市販のマイクロ流体チップは、48 x 48で入手できます。48個のプローブセットで48個のサンプルを分析できる形式、または96個のプローブで96個のサンプルを分析できる96 x 96形式のフォーマット。ほとんどの場合、チップの選択は主に分析するサンプルの数に依存します。
まず、実験用に選択したチップに従ってサンプルミックスを準備します。20 XDNA結合色素サンプルローディング試薬をピペッティングする際には注意してください。サンプルミックス溶液を最低20秒間撹拌し、少なくとも30秒間遠心分離します。
調製した反応は、チップがロードできるようになるまで、摂氏4度で短時間保存できます。次に、アッセイミックスを調製し、サンプルミックスを十分に撹拌し、遠心分離してすべての成分をスピンダウンします。先に示したように、ダイナミックアレイIFCチップには、サンプルとアッセイ用のインレットと、マイクロ流体チャンバーの加圧に使用される制御ライン流体用の指定されたインレットがあります。
まず、チップ上の各アキュムレータに制御ライン液を注入します。次に、チップをIFCコントローラーに配置し、適切なスクリプトを実行してプライミングします。スクリプトが終了したら、プライミングされたチップをIFCコントローラーから取り出し、各アッセイの5マイクロリットルをピペットで掴みます。
チップに混ぜます。各サンプルミックスの5マイクロリットルをインレットに加え、IFCコントローラーソフトウェアを使用してチップをIFCコントローラーに戻します。スクリプトを実行して、サンプルとアッセイをチップにロードします。
ロードミックススクリプトが終了したら、ロードされたチップをIFCコントローラーから取り外します。次に、サーマルサイクラーにチップをロードし、融解曲線解析を含む新しいチップランを作成します。サーマルサイクラーソフトウェアを使用すると、反応チャンバーが適切に認識され、反応が完了まで実行できるようになります。
自発運動活動の増加は、1回の急性コカイン注射後に明らかでした。この冠状切片では、側坐核の境界を定義するために行われた切り込みの位置を太い白い線で示しています。解剖中、CFOおよびphos Bに対するプライマーの増幅曲線は、プライマーペアが約100%の効率で標的転写産物を増幅することを示しています。
すべてのサイクルで、コカインは側坐核におけるCFOとphos Bの発現を誘導し、曝露後1時間と2時間後に最も高かったという結果が出ています。この手順に続いて、新しい未特徴の転写産物を同定するために、次世代シーケンシングなどの他の方法を実行できます。
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概要
この原稿は、行動パラダイムに続いて、げっ歯類の特定の脳核での転写プログラムを分析するためのプロトコルを説明しています。この手法は、急性コカイン曝露後のマウスの核accumbens（NAc）で誘導された遺伝子のプロファイリングを通じて説明されています。
主要な研究要素
科学の領域
- 神経科学
- 行動分析
- 遺伝子発現プロファイリング
背景
- 転写ダイナミクスは、行動に対する脳の反応を理解する上で重要です。
- 核accumbensは、報酬と中毒に関与する重要な領域です。
- コカイン曝露は脳の遺伝子発現を変化させます。
- マイクロフリューイディックqPCRアレイにより、詳細な遺伝子プロファイリングが可能になります。
研究目的
- コカイン曝露後の核accumbensにおける転写変化を研究すること。
- RNA分離と遺伝子発現分析のためのプロトコルを確立すること。
- げっ歯類における遺伝子発現に対する行動の影響を理解すること。
使用した方法
- マウスの取り扱いと生理食塩水注射への慣れ。
- コカイン投与後の運動活動の記録。
- RNA分離のための核accumbensサンプルの収集。
- 遺伝子発現変化を評価するためのQPCR分析。
主要な結果
- コカイン曝露後に転写ダイナミクスが観察されました。
- NAcで誘導された特定の遺伝子が特定されました。
- このプロトコルは遺伝子発現の効果的なプロファイリングを実証しました。
- 結果は中毒の分子基盤の理解に貢献します。
結論
- この研究は、行動刺激に対する反応として遺伝子発現を分析するための堅牢なプロトコルを提供します。
- 結果は中毒研究における転写反応の知識を強化します。
- このアプローチは神経科学における他の行動パラダイムにも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively assess transcriptional dynamics in defined brain regions following behavioral or pharmacological perturbations, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By providing reproducible, quantitative gene expression readouts from limited tissue samples, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic studies and informs go/no-go decisions for CNS-targeted therapeutics. The approach is particularly valuable for de-risking hypotheses related to addiction, reward pathways, and behavioral phenotypes prior to investment in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional programs in nucleus accumbens to validate functional relevance of genes implicated in cocaine-induced behavioral responses.
- Operational Value: Supports robust target hypothesis testing using microfluidic qPCR to quantify gene expression changes with high sensitivity from limited brain tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by establishing baseline transcriptional profiles following acute pharmacological challenge.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through standardized RNA isolation, reverse transcription, and microfluidic qPCR workflows applicable across multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant transcriptional readouts in a well-established model of psychostimulant response, supporting biomarker alignment and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by delivering quantitative, multiplexed gene expression data suitable for cross-platform confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and assay development prior to lead identification efforts in CNS drug discovery programs.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of transcriptional dynamics following behavioral experience, supporting pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Generates quantitative, multiplexed outputs that support assay readiness and reproducibility for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers normalized gene expression measurements from microfluidic qPCR arrays, enabling statistical comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects acute behavioral responses to molecular signatures in reward circuitry, supporting translational validity in addiction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptional profiling platform applicable across diverse behavioral paradigms and pharmacological challenges in neuroscience research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking behavioral phenotypes to defined transcriptional responses in key brain regions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of gene expression analysis through standardized microfluidic qPCR protocols suitable for multi-sample processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets through mechanistic insight before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by providing quantitative evidence of pathway engagement following pharmacological challenge.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience techniques including behavioral testing, brain dissection, and RNA handling.
- Depends on access to microfluidic qPCR platforms and associated instrumentation for high-throughput gene profiling.
- Necessitates standardized protocols for sample collection, RNA isolation, and cDNA synthesis to ensure cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, species, or behavioral paradigms beyond cocaine-induced nucleus accumbens responses.
- Practical limitations include tissue yield constraints from small brain nuclei and the need for careful normalization to account for sample variability.
