生きたマウスにおける大腿骨髄吸引
2014年7月5日
このプロトコルは、マウスを犠牲にすることなく大腿骨骨髄(BM)の連続サンプリングの手順を説明しています。この手順により、マウスのBM組成の経時的な縦断的研究が容易になり、ex vivoおよび移植研究のためにBM内の細胞への連続アクセスが可能になります。
この手順の全体的な目標は、生きているマウスの大腿骨髄腔から骨髄造血細胞の内容物を安全に吸引することです。これは、最初の結婚式、PBS入りのツベルクリン注射器によって達成されます。2番目のステップでは、マウスの脚を骨髄回収に最適な角度で慎重に配置します。
その後、造血細胞は大腿骨骨髄腔から吸引され、赤血球は枯渇します。最終的に、骨髄内容物の成功した吸引は、フローサイトメトリーおよび細胞学的分析によって視覚化できます。手順を実演するのは、私たちの研究室の非常に才能のある技術者である若いRockChungです。
この技術が従来の骨髄採取のような既存の方法よりも優れている点は、骨髄の造血細胞の一部を回収しながら、動物を生きたまま観察し、連続的に分析することができることです。Fは、つま先つまみによる鎮静を確認した後、麻酔をかけたマウスの目に眼軟膏を塗布して角膜の乾燥を防ぎ、脚を剃って皮膚を露出させます。次に、皮膚の滅菌外科的準備は、クロルヘキシジン消毒剤でその領域をこすり、続いてアルコール綿棒でこすることによって行われます。
このプロセスは3回完了し、各動物に新鮮な未開封の滅菌注射器と針が使用されます。適切な麻酔面が達成されたことを確認します。次に、滅菌PBSで0.5ミリリットルのツベルクリン注射器を湿らせ、次に吸引し、すぐに生理食塩水の200〜500ミリリットルを2〜3回消去します。
次に、片方の手から最後の2本の指のいずれかを使用して、脛骨を大腿骨からそっと曲げて、大腿骨の顆状腔の露出と針の挿入を容易にします。次に、膝蓋腱に針を挿入して、大腿骨の2つの顆の間にしっかりと留まるようにします。もう一方の手の親指と人差し指を使用して、骨幹幹を大腿骨の骨端に近づけて、針を骨の軸に簡単に挿入できるようにします。
注射器に血液が見られない場合は、針に小さな骨や組織の破片が詰まっている可能性があります。これは、PBSでプランジャーを上下に動かすことで針から取り外すことができます。組織をシリンジから取り出せない場合は、新しい針とシリンジを使用してください。
再度、シリンジを200〜500マイクロリットルのPBSで濡らします。次に、針を時計回りと反時計回りに回転させながら、顆頭腔に押し付けて、大腿骨の軸と平行になるようにします。大腿骨シャフトからの骨髄内容物の回収を容易にするため。
針を時計回りと反時計回りに回しながら、ゆっくりと大腿骨髄腔に押し込みます。シリンジを横方向にゆっくりと動かして、針の正しい位置を確認します。次に、ニードルプランジャーをゆっくりと引き戻し、骨髄腔内で針を前後に動かしながら負圧を作り出します。
吸引の成功は、注射器の基部にある針の上部に血液が現れることによって確認されます。骨髄が大腿骨から正常に吸引されたら、骨から針を取り外し、吸引された骨髄を氷上に500マイクロリットルのPBSを事前に充填したマイクロフージに移します。鎮痛剤を投与した後、マウスをハウジングエリアに戻す前に、マウスをヒートランプの下で回復させます。.
彼らが歩き回り、食べ物や水に到達できることを確認してください。その後、マウスをケージに戻し、次の24時間、処置後の苦痛や感染の兆候がないか動物を観察します。その間に、骨髄細胞をスピンダウンし、PBSを慎重に吸引し、ペレットを再懸濁します。
10分後に500マイクロリットルの赤血球溶解緩衝液で、1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。ペレットには、実験分析に使用できる単核細胞の骨髄が含まれています。これらの最初の図は、大腿骨骨髄穿刺または従来の骨髄採取を用いた形態学的およびフローサイトメトリー解析により、バルク細胞と造血幹細胞および前駆細胞の類似したタイプと比率がどのように観察されるかを示しています。
ここでは、系統陰性、SKA、1陽性、Cキット陽性、および骨髄系前駆細胞亜集団の割合を、3つの独立した吸引および従来の骨髄収穫における全生細胞の頻度として示しています。これらのデータは、従来の骨髄採取と比較して、大腿骨吸引によって収集された骨髄からの系統陰性SKA1、陽性Cキット陽性、および骨髄前駆細胞の亜集団の減少を明らかにしています。この差は、人口に対して統計的に有意ではありませんでした。
しかし、系統陰性ska one 陽性 cki 陽性細胞の選別と、続いてメチルセルロースでの ex vivo 培養を行うと、大腿骨骨髄吸引によって得られるコロニー数と細胞型が類似しています。従来の骨髄採取と同様に、両培養において観察され列挙されるコロニー型には、顆粒球、赤血球、単球、および巨核球のコロニー形成単位、顆粒球および単球のコロニー形成単位、および赤血球バースト形成単位が含まれる。この手法は、この手順に従って適切に実行すれば、マウスあたり10分で実行できます。
大腿骨骨髄内注射などの他の方法を実行して、免疫不全マウスへのヒト造血細胞の異種移植の影響など、追加の質問に答えることができますか?
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概要
このプロトコルは、マウスの犠牲を必要とせずに大腿骨骨髄（BM）の連続サンプリングの手順を説明しています。この方法により、BM組成の縦断的研究が可能となり、生体外および移植研究のための細胞へのアクセスが提供されます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 血液学
- 移植生物学
背景
- 骨髄は造血にとって重要です。
- 従来のサンプル採取方法では、安楽死が必要なことがよくあります。
- 縦断的研究は、疾患の進行に関する洞察を提供できます。
- 生体へのアクセスは、研究結果の関連性を高めます。
研究の目的
- 骨髄サンプリングの非致死的方法を開発すること。
- 時間の経過に伴う骨髄の繰り返し評価を容易にすること。
- 造血細胞集団の詳細な分析を可能にすること。
使用される方法
- 大腿骨髄腔から骨髄を吸引すること。
- 手順にPBSを使用したツベルクリン注射器を使用する。
- 最適なアクセスのためにマウスの脚を位置決めすること。
- 結果を視覚化するためのフローサイトメトリーと細胞学的分析。
主な結果
- 骨髄内容物の吸引が成功しました。
- 赤血球はサンプルから効果的に除去されました。
- フローサイトメトリーにより造血細胞の存在が確認されました。
- 熟練した技術者が手順を成功裏に実証しました。
結論
- この方法により、倫理的で効果的な骨髄サンプリングが可能になります。
- 動物実験を犠牲にすることなく、継続的な研究をサポートします。
- 将来の研究は、この技術をさまざまな応用に活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Serial access to bone marrow without animal sacrifice enables longitudinal tracking of hematopoietic dynamics, a critical capability for preclinical hematology and transplantation research. This method supports mechanistic de-risking by providing repeated, quantitative readouts of stem and progenitor cell populations in vivo, reducing reliance on terminal endpoints. It enhances predictive confidence in xenograft and engraftment studies by allowing direct comparison of aspirated versus harvested marrow from the same subject over time.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) kinetics under experimental conditions without confounding effects of acute tissue disruption.
- Operational Value: Supports repeated sampling from the same animal, reducing inter-animal variability and improving statistical power in target validation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized source of mononuclear bone marrow cells for flow cytometric and cytological assay development.
- Operational Value: Enables consistent preparation of HSPC-enriched fractions for downstream functional assays such as colony-forming unit (CFU) culture.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant longitudinal modeling of hematopoietic engraftment, mobilization, or depletion in xenograft and syngeneic systems.
- Operational Value: Supports serial monitoring of therapeutic effects on the hematopoietic compartment, informing dose scheduling and safety assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows as a reusable tool for generating longitudinal hematopoietic data, bridging early target validation with preclinical efficacy and safety assessment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of genes or compounds affecting HSPC frequency, differentiation, or mobilization through repeated in vivo sampling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular inputs for assay standardization, including flow cytometry panels and CFU assays.
- Analytics: Generates longitudinal datasets on lineage-negative, Sca-1+, c-Kit+ (LSK) and myeloid progenitor frequencies, supporting statistical comparison across time points or treatment groups.
- Translational Research: Connects in vivo HSPC dynamics to functional outcomes such as multilineage reconstitution capacity, supporting biomarker-aligned go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a serial sampling capability applicable across multiple studies, reducing redundant surgical procedures and animal usage.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hematopoietic target modulation by enabling direct, repeated measurement of stem and progenitor cell responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and reduces variability through within-subject longitudinal design.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per animal and reducing need for large cohort sizes in longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, serial biomarkers of hematopoietic toxicity or efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse handling, anesthesia, and microsurgical techniques to ensure animal welfare and sample quality.
- Dependent on sterile tuberculin syringes, PBS, and red blood cell lysis buffer for mononuclear cell isolation.
- Necessitates standardized training across technicians to maintain consistent aspiration success rates and cell viability.
- Must be adapted to mouse strain, age, and health status, with post-procedure monitoring for ambulation and distress.
- Limited by aspirate volume per session, which may restrict downstream multiplex assays without pooling or sequential sampling.
