Name: MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: 学ぶMALDI-TOF質量分析法による血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速同定法。遠心分離と精製ステップで細菌を濃縮し、従来培養法より早期に種同定が可能です。臨床微生物検査の診断速度向上に貢献します。

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<html> 「陽性」として1。血液培養ブロス旗<ol><li>継続的な監視のインキュベーションキャビネットから合図血液培養ボトルを取り外し、生物学的安全キャビネットに入れてください。注：ボトルは、危険な微生物を含むことができ、ユニバーサル予防措置に従わなければする必要があります。サンプリングによるエアロゾル中の感染リスクに、すべてのサンプリング手順は、バイオセーフティクラスII層流キャビネット内で実行する必要があります。 </li></ol> 2。グラム染色を用意する<ol><li>地元の制度的なプロトコルに従って合図血液培養液からグラム染色を準備します。注：グラム陰性生物は、顕微鏡で同定されている場合、血液培養液を以下の方法に従って処理される。グラム陽性菌が特定される場合には、遺伝的同定と耐性マーカーを対象とした代替分子法は（この記事で扱われていない）培養液13に適用されます。 </li></ol>血清分離管にフラグ付きの血液培養ブロスのE &quot;&gt; 3。転送<ol><li>ゆっくりと2〜3倍を反転させることにより血液培養ボトルを混ぜる。 </li><li>バイオセーフティキャビネット内での安全性の血液搬送装置に10ミリリットルの注射器を取り付けます。 </li><li>血液培養ボトルに血液転送装置を取り付け、注射器にスープの5ミリリットルを撤回。血清分離チューブに吸引BCブロスを転送します。 </li></ol>血液培養ブロスの4。濃度<ol><li>赤血球の大容積を除去する15分間1,250×gで血清分離管を遠心分離する。 </li><li>吸引し、直ちにゲル/流体界面の上に軟膜の約1ミリリットルを残すように注意して、無菌トランスファーピペットを用いて上清を捨てる。注：好気性ボトルはゲル/流体界面が、不透明な白色に現れると、チューブの底部に赤血球の明確な分離を示す。対照的に、時ゲル/流体界面に起因上清中に懸濁したままで溶解した赤血球成分に深赤色で表示され、溶解性嫌気性血液培養ブロスに適用した。 </li></ol> 5。遠心洗い手順を繰り返します<ol><li>優しく滅菌ピペットでゲル界面上軟膜流体の最後の1ミリリットルを混合し、次いで1.5mlのマイクロチューブにボリューム全体を転送します。 30秒288×gで新しいチューブを遠心分離する。 </li><li>新しい1.5 mlマイクロチューブにプラスチックの使い捨て1ミリリットルのホールピペットを用いて上清を移し、ペレットとチューブは捨てる。注意：これは注意がペレットの転送を避けるために注意され、この段階で重要である。これは上清色素沈着残り、ペレットを常に明確に示されていないように嫌気紀元前ボトルから処理されている標本のために特に重要です。 </li></ol> 6。残留細胞の溶解を</p&gt; <ol><li> 1分間遠心した後、吸引（および廃棄）のための18407×gで試料ペレットを中断することなく、可能な限り少ない残液を残して細かいな先端のホールピペットを用いて上清。 </li><li>上下にピペッティングにより無菌DNaseおよびRNA分解酵素を含まない水1ミリリットル中の残留ペレットを再懸濁。注：一部の著者は、非生存細菌をレンダリングペレットを再懸濁するために滅菌水の代わりにアルコール溶液の使用が記載されている。 </li><li> 1分間18407×gで再懸濁ソリューションを遠心分離する。 </li></ol>細菌タンパク質の7。抽出<ol><li>吸引し、再び、できるだけ多くの液体が除去されることを確実に先の細いピペットで吸引を使用して、上清を捨てる。 </li><li> 10μlのギ酸（70％v / v）の中にペレットを再懸濁。注：それが吸入される場合は、それが皮膚と接触するとギ酸が身体に影響を与えることができる。溶液を調製するか、操作するとき、それはrとスタッフは個人用保護具の他に、ヒュームのキャビネットを使用することをecommended。 </li><li>均質な再懸濁ソリューションを確実にするためにピペットを用いてよく混ぜる。物理的にペレットを破壊するためにピペットチップを使用すると、より均質な溶液を確保するために必要であり得る。 </li></ol> MALDI-TOFターゲットプレート8の調製<ol><li>ターゲットスポットあたり調製した懸濁液の2μlでクリーンなMALDI-TOFターゲットプレートに接種。読み込み失敗の時々の問題を克服するために、各サンプルの3標的部位を準備します。 </li><li> MALDI-TOFターゲットプレートを乾燥させる。乾燥速度は、プレートを横切る空気の流れを最大にするために、ヒュームフードの端に板を配置することによって増加させることができる。 </li><li>マトリックス溶液（10 mg / mlのα-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸（HCCA）、50％アセトニトリル、2.5％トリフルオロ酢酸）1μlを各々乾燥させたスポットを重ねる。注：それが吸入されている場合、またはそれがコンタに入ってくる場合は、マトリックス溶液が体に影響を与えることができる皮膚とCT。溶液を調製するか、操作するときには、スタッフが個人用保護具の他に、ヒュームのキャビネットを使用することをお勧めします。 </li><li>前述したように、MALDI-TOFターゲットプレートはヒュームフードの端に乾燥させます。均質な製剤は、プレート上の標的スポットのそれぞれを満たすことを確認してください。 </li></ol>質量分析計に9か所、MALDI-TOFターゲットプレート<ol><li> MALDI-TOF質量分析計へのMALDI-TOFターゲットプレートを挿入する。プレートはスプリング式のプレートと同一面に座っていることを確認します。注意：ターゲットのすべてのスポットが乾燥するまで、ターゲットプレートを挿入しないでください。 </li><li>ゴム製のシールが必要な真空状態を作成することができますができるように糸くず、ほこりや髪の毛の汚れていないことを確認してください。 </li><li> MALDI-TOFステージふたを閉めてから、機器の前面にある「IN / OUT」ボタンを押してください。蓋は現在ロックして、必要な真空が作成できるようになります。 </li></ol> 10。MALDI-TOF MS Spectra買収<ol><li> MALDI BiotypingとFlexControlソフトウェアを起動します。 </li><li>タイピングソフトウェア内の「ファイル」というタイトルのドロップダウンメニューから「新しい分類」を選択します。プロジェクトに名前を付けてから、「新規作成」を選択します。タイピングソフトウェア内のセットアップを完了するために、「次へ」を選択します。 </li><li>制御ソフトウェアのウィンドウ内でターゲットプレートの画面上のグラフィックを識別します。マウスの左ボタンを押しながら接種したスポットの上にマウスを移動して使用されているMALDI-TOFターゲットスポットを強調表示します。 </li><li>選択された目標位置の任意の場所をクリックし、ドロップダウンメニューから「検体を追加」を選択し、マウスの右ボタンを使用してください。 </li><li>対象スポットのそれぞれについて、「ID」欄に血液培養識別の詳細を追加、完了したら「次へ」をクリックします。 </li><li>商業「分類」スペクトルのデータベースを選択し、「次へ」を選択します。注意：ラボratoriesは、基準スペクトルの数を増加させるため、社内の追加または商用データベースを利用することができる。 </li><li> 「完了」をクリックし、MALDI-TOF MSは、スペクトルを生成開始します。注：MALDI-TOFの設定は、製造者の設定（リニアポジティブモード、60Hzのレーザー周波数、20kVの加速電圧、16.7 kVのをIS2電圧は、170ナノ秒の抽出遅延、および2,000-20,137 m / z範囲）あたりの通りであった。 </li><li> MALDI制御ソフトウェアはピークを生成するために失敗した場合は、スペクトルの手動取得する（メソッドが記述されていない）を行ってもよい。 </li></ol> MALDI-TOF MSスコアの11。ポスト解析の解釈<ol><li>スペクトルを取得し、分析が完了したら、各ターゲットの識別リストを展開しタイピングソフトウェア、種の識別の横の「+」ボタンを選択します。 </li><li>トップ5が類似している場合には注意して、トップ5の同定を研究。スコア同じターゲットの≥1.7と不調和トップ5属スポットは、混合ブロスの可能性を提起した。注：MALDI-TOF技術は、混合ブロスの検出のための貧弱な感度を有する。たとえば、培養液が混合種を含む場合に、高い信頼度スコアは、混合種のほんの一例について同定され得る。 </li><li>スコア≥2.0がターゲット場で最高の試合のために注意されると、種を報告している。 </li><li>ときにターゲットスポットが≥1.7での最高スコアが&lt;2.0のみ属を報告します。トップ5識別の追加基準が一致している場合には、種レベルに報告する。 </li></ol> 12。MALDI-TOFターゲットプレートの削除を<ol><li>すべてのスペクトルは、MALDI-TOFマシンの「IN / OUT」ボタンを押して完了している場合。 </li><li> MALDI-TOFターゲットプレートレセプタクルを開いて、MALDI-TOFターゲットプレートを取り外します。 </li><li>アルコールを使用して、クリーンなすべてのターゲットスポットを再利用可能な、MALDI-TOFターゲットプレートを使用している場合、それを清潔で乾いたら、RTで、MALDI-TOFプレートを格納します。 </li></ol>

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<li>Novel,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((improved+sample+preparation+for+rapid%2C+direct+identification+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+%28MALDI-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.</a> J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).</li>
<li>Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Bacteria+and+Yeasts+from+Positive-Blood-Culture+Bottles+by+Using+a+Lysis-Filtration+Method+and+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrum+Analysis+with+the+SARAMIS+Database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database.</a> J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ポストの遠心操作は分離された成分をリミックスしない十分な注意を払って行われた血液培養液にMALDI-TOF MSを適用するときには重要です。これは、MALDI-TOFスペクトルに干渉スパイクを生成することができる、ヘモグロビンを含む血液培養成分およびヒト細胞タンパク質を除去することが特に重要である。 MSは種のための≥2.0のスコアのカットや属同定のための≥1.7を推奨し製造していますが、他のレポートは、BCブロス10,12,14-18に適用した場合に実施することができる低対数スコア（≥1.4 1.6≥には範囲）を示唆している。臨床微生物検査室で低MS同定スコアの実装は、適切な地域の規制と検証の手順に従って考慮されるべきである。 時折貧弱なスペクトルは、どちらか一致していないこの方法で生成される、またはLと報告されているOW信頼度。各分離株のために回または3回のスポットを実行すると、単一のスポットが失敗したときに、実験を繰り返す不便を減らすことができます。まれに、すべての重複スポットが識別のために十分に...

原因細菌に血流感染（BSI）の患者は、6〜48％1に至るまで、高い院内死亡率を持ち続ける。適切な経験的抗生物質の送達は、生存を促進し、重症敗血症の患者のサブセットでは、適切な治療への各時間の遅延が生存2,3の低下と相関する。従って、臨床検査室の主な目的は、迅速に検出、同定および臨床決定を通知するために、血液培養物中の細菌の存在を伝えることである。これは、微生物学研究室は、グラム染色4を報告し、最近時の抗菌療法に最も大きな影響を与える、観察研究は、飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間を実証したことが実証されている血液培養ブロス上で直接実行グラム陰性菌5に起因するBSIの三分の一以上で処方に影響する。 6,7の同定のための有効な実験室ツールにつながっている。技術は、現在十分に確立されており、固体培地の6,8で単離した微生物の迅速かつ正確な同定のための多くの研究所に統合されました。血液培養のための低コストでの微生物の初期の識別を取得する可能性の両方の臨床医や研究室の管理者への微生物のアピールのために「陽性」合図している（BC）ブロスにMALDI-TOF MSの直接適用。 血液培養ブロスへのMALDI-TOF MSの直接適用の臨床的有用​​性は、47から98.9の範囲のグラム陰性細菌の同定の成功の報告と、識別の標準的な表現型の培養ベースの方法と比較した場合に観察される感度の広い範囲によって制限されてきた％9月11日 。感度の変動性が高いBCブロス組成物、初期細菌濃度、サンプル調製法の変動ならびに試験集団9において遭遇するグラム陰性生物体のアレイに関する。これらの他の公開されたプロトコルと比較して、ここで提示した方法は、エタノール、塩化アンモニウムまたは追加の（非マトリックス）アセトニトリルの使用を回避する。その結果、細菌ペレットは、潜在的な表現型感受性試験法は培養液中で、これらの生物に直接適用することを可能にする（タンパク質抽出の時点まで）の実行可能なままになります。また、提示された方法は、時間12最小限の&#39;実践&#39;で、血液培養グラム染色結果の25分以内に利用可能な細菌同定と、安価で信頼性が高く、迅速であることが示されている。 この方法では、ギ酸抽出を利用した単純な社内スピン溶解プロトコルは、グラム負のbを同定するために陽性の血液培養液に直接適用さMALDI-TOF MS技術とacteria。

<table><tbody><tr><td>BACTEC Plus Aerobic/F ミディアム</td><td>ベクトン ディキンソン;BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州、米国 <td>442192</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium</td><td>Becton Dickinson;BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州、米国 <td>442265</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Peds Plus Medium</td><td>Becton Dickinson;BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州、米国 <td>442194</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer - 血液移送装置</td><td>ベクトン・ディキンソン;BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>364880</td><td>針刺し傷害のリスクを低減するシングルユースサンプリング装置</td></tr><tr><td>Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus</td><td>Becton Dickinson;BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td>州、<td>米国 367954</td><td>血清分離チューブ</td></tr><tr><td>シリンジ 10 ml</td><td>ベクトン ディキンソン;BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>302143</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>Samco, USA</td><td>222-20S</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット (先端が細い)</td><td>Samco, USA</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (2.0 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>0030.120.094</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水 (DNAse and RNAse free)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, California, USA</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>マトリックス溶液&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics, Bremen Germany</td><td></td><td>285074 10 mg/ml &-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸, 50% アセトニトリル, 2.5% トリフルオロ酢酸</td></tr><tr><td>Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics, ブレーメン ドイツ</td><td></td><td>BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software</td></tr></tbody></table>

maldi-tof質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

臨床微生物学研究室の重要な役割は、血流感染を引き起こす細菌の迅速な同定を提供することです。伝統的な識別は、固体寒天上のコロニーが成熟した後でのみ利用可能な識別を合図血液培養液の継代培養を必要とします。 MALDI-TOF MSは、固体培地上のコロニーに適用される臨床的に関連する大部分の細菌の同定のための信頼性のある、迅速な方法である。それは、細菌の種の同定を促進し、臨床管理を改善する可能性を有するとして直接血液培養ブロスへのMALDI-TOF MSの適用は魅力的なアプローチである。しかし、克服すべき重要な問題は、除去されない場合、MSスペクトルに干渉し、不十分なまたは低判別識別スコアをもたらすことができる血液培養検体中に含まれる樹脂の妨害、タンパク質、およびヘモグロビンの分析前の除去である。それに加えてバクターを濃縮する必要があるIA十分な品質のスペクトルを開発する。提示された方法は、濃縮、精製、及び合図血液培養液からの細菌の早期発見を可能にし、グラム陰性菌の抽出について説明します。

生成されたMALDI-TOF MSスペクトルは、スペクトルの集積参照データベースと比較される。対数スコアは、試験分離株の間の一致の信頼のために割り当てられ、参照データベースは分離し、種への可能性を識別するための属レベル（ 図1）と≥2.0に足りる相当の識別（ 図に必要なスコア≥1.7の勧告にされている2）。スコア≥1.7と入力ソフトウェアで一致した最初の5識別します（ 図1）12一貫している種のレベルにレポート。 図3に、この場合は大腸菌やセラチアに、混合種の血液培養液を分析して結果を示していますマルセッセンス 。トップ5マッチスペクトルが耳障りであることに注意してください。これは、以前に、混合属のみ混合ブロス12の約​​30％において、この方法によって同定されることが実証されている。これは、混合培養でそれが可能であることを認識することが重要である。 表1は...

直接血培養液への航空券のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間（MALDI-TOF）質量分析（MS）の適用は、細菌の同定を促進。提示した方法は、血液培養ブロスから直接、グラム陰性細菌の同定のための迅速かつ信頼できる方法である。

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

この手順の全体的な目的は、Maloff法を用いて血液培養ブイヨンからグラム陰性菌を直接同定することです。このため、陽性となった血液培養ブイヨン5 mLを血清分離管に移し、遠心分離にかけます。遠心後、細菌を含む液層をマイクロ遠心チューブに移し、低速で遠心分離を行います。その後、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、高速で遠心分離します。得られたペレットをギ酸で再懸濁し、MALDIを用いて分析し、存在する細菌種を特定します。従来の培養法などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、グラム陰性菌をより早期に特定できることです。菌血症の診断は臨床医による抗菌薬の選択に影響を与えるため、この手法の意義は臨床微生物学にまで及びます。本手順の実演を行うのは、当部門で日常的にこの操作を担当している技術者のLeonardo Bascuです。発熱性疾患などの状況において臨床スタッフの判断で採取された好気性または嫌気性の血液培養ボトルは、細菌の増殖を継続的にモニタリングする自動培養装置で培養されます。血液培養ボトル内で増殖が認められた場合、装置がそのボトルを特定し、通知します。陽性サインが出た血液培養ボトルをインキュベーターから取り出すことからこの手順を開始します。これを生物学的安全キャビネット内に配置してください。施設の規定プロトコルに従って、陽性となった血液培養液からグラム染色標本を作成し、グラム陰性菌が同定された場合は顕微鏡で鏡検します。ここでの方法に従って培養液を処理してください。グラム陽性菌が同定された場合は、別の迅速分子生物学的手法を用いることができます。血液培養ボトルを2〜3回転倒混和して混ぜ合わせます。次に、バイオセーフティキャビネット内で操作を行います。10 mLのシリンジを安全血液転送デバイスに取り付けます。この血液転送デバイスを血液培養ボトルに接続し、5 mLの培養液をシリンジに吸引します。吸引した血液培養液を血清分離管に入れ、1,250 ×gで15分間遠心分離して赤血球を除去します。遠心分離後、好気性ボトルからの血液培養液では、赤血球が管の底に明確に分離し、ゲル界面が不透明な白色になります。対照的に、溶菌性の嫌気性血液培養液からは、ゲル界面に深い赤色が見られます。どちらの吸引タイプであっても、溶血した赤血球成分が上清中に懸濁したままとなるため、滅菌転送ピペットを用いて上清を廃棄します。その際、ゲル界面の直上にあるバフィーコートを約1 mL残すように注意してください。次に、滅菌ピペットを用いてゲル界面上の最後の1 mLのバフィーコート液を静かに混ぜ合わせ、その全量をマイクロ遠心チューブに移します。新しいチューブを288 ×gで30秒間遠心分離し、プラスチック製使い捨て1 mL転送ピペットを使用します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、ペレットの入ったチューブは廃棄します。このステップでは、ペレットを移さないようにすることが極めて重要です。特に嫌気性血液培養検体では、上清に色素が残っており、ペレットが常に明確に見えるとは限らないため、十分な注意が必要です。検体を18,407 ×gで1分間遠心分離し、その後、細いチップの転送ピペットを用いて、ペレットを乱さないように上清を吸引し、残液が最小限になるまで除去します。1 mLの滅菌済みDNAおよびRNAフリー水を加え、ピペッティングして残ったペレットを再懸濁します。再懸濁した溶液を18,407 ×gで1分間遠心分離します。遠心分離後、ファインチップピペットを使用して上清を吸引し、除去します。この際、可能な限り多くの液体を取り除くように注意してください。ペレットを10 µLの70%ギ酸に再懸濁します。大きなペレットの場合、ギ酸の量を50〜100%増やす必要がある場合があります。ピペットを使用してよく混ぜ、均質な溶液にします。必要に応じて、ピペットチップでペレットを物理的に分散させてください。得られた溶液には、血液培養ブロスから分離された濃縮細菌が含まれており、ヒト細胞や血液培養ボトルの樹脂が比較的排除されています。ピペットを使用して、清潔なMALDI-TOFターゲットプレートの各ターゲットスポットに、調製した懸濁液を2 µLずつ接種します。読み取りエラーが発生する場合があるため、各サンプルにつき3箇所のターゲットサイトを用意してください。プレートをドラフトチャンバーの端に置き、気流を最大限に利用して速やかに乾燥させます。乾燥した各スポットに、マトリックス溶液を1 µLずつオーバーレイします。MALDIターゲットプレートをドラフトチャンバーの端で乾燥させます。前述と同様に、プレート上の各ターゲットスポットに均質な調製液が満たされていることを確認してください。ターゲットプレートをMALDI質量分析計に挿入します。プレートがバネ付きプレートにぴったりと密着していることを確認してください。すべてのターゲットスポットが完全に乾燥するまで、ターゲットプレートを挿入しないでください。ゴム製のシールを確認し、糸くず、ほこり、髪の毛などが付着していないことを確かめます。これにより、必要な真空条件を作成することが可能になります。次に、マロフステージの蓋を閉じ、装置前面にあるイン・アウトボタンを押します。蓋がロックされ、真空状態になります。typソフトウェア内のMALDI-typおよびFlexコントロールソフトウェアを開きます。「ファイル」というタイトルのドロップダウンメニューから「新規分類」を選択し、プロジェクト名を指定して、「新規」を選択します。「Next」を選択します。flexコントロールソフトウェアのウィンドウ内でセットアップを完了させるには、マウスの左ボタンを押し下げたまま、画面上のターゲットプレートのグラフィックを特定します。マウスを接種スポット上に移動させ、使用するターゲットスポットをハイライトします。選択したターゲット位置の任意の場所を右クリックし、ドロップダウンメニューから「add analytes」を選択します。各ターゲットスポットについて、ID列に血液培養同定の詳細を入力し、「next」をクリックします。完了後、「Commercial Taxonomy」スペクトルデータベースを選択して「next」を選択します（研究施設によっては、参照スペクトルの数を増やすために、追加の院内データベースや商用データベースを利用する場合があります）。「finish」をクリックすると、MALDI TOF MSによるスペクトル生成が開始されます。Flex Controlソフトウェア内でMALDI-TOFスペクトルの手動取得を行うことで、より高いMALDI-TOFスコアが得られる場合があります。スペクトルの取得およびステレオタイピングソフトウェアでの解析が完了したら、「Species Identification（種同定）」の隣にあるプラスボタンを選択します。各ターゲットの同定リストを展開し、上位5つの同定結果が類似しているかを確認しながら検討してください。同一のターゲットスポットにおいて、上位5つの属が不一致であり、かつスコアが1.7以上である場合は、複数種の混在が考えられます。なお、OV技術は混在種の検出感度が低いことに注意してください。ターゲットスポットのレポートにおいて、最高一致スコアが2.0以上である場合は種名を報告し、最高スコアが1.7以上2.0未満である場合は遺伝子名を報告してください。上位5つの同定結果の追加基準が一致する場合にのみ、種レベルで報告します。すべてのスペクトル測定が完了したら、MALDI TOF装置のインアウトボタンを押し、ターゲットプレート収納部を開けてプレートを取り出します。再利用可能なMALDI TOFターゲットプレートを使用する場合は、アルコールを用いてすべてのターゲットスポットを洗浄し、洗浄して乾燥させた後、MALDI TOFプレートを室温で保管します。血液培養液からグラム陰性菌を同定するため、スピン洗浄サイクルを用いて細菌を濃縮および単離し、その後、MALDI TOF質量分析により解析を行いました。このビデオ記事で説明されている通り、ここに示されているのはlog score 1.86のeureka coliで生成されたMALDI TOF MSスペクトルです。右側にあるのは、タイピングソフトウェアによって特定された上位5つの一致結果です。種が1.861のスコアで一貫してre coliと報告されていることに注目してください。上位5つのマッチが E. coli であるため、種レベルでの同定は信頼できると考えられます。ここでは、Pseudomonas aerogen の MALDI-TOF MS により生成されたスペクトルを示します。対数スコアは 2.216 であり、右側にはタイピングソフトウェアによって同定された上位5つのマッチが表示されています。当該菌種はpseudomonas aerogenとして一貫して報告されており、スコアは2.216と高い値を示していることに留意してください。これにより、種レベルでの同定は信頼できると考えられます。右側に示されているのは、esia coliとSIO marsensを含む混合血液培養液に対してMALDI-TOF MSで得られたスペクトルであり、タイピングソフトウェアによる上位5つのマッチング結果にはReiki coliとSIO marsanの両方が報告されています。最初の5つの一致したスペクトルにおいて。この混合遺伝子は、混合ブロス培養の約3分の1でしか同定されません。この表は、本法の検証研究から得られた既報の結果をまとめたものであり、単一微生物ブロスの91.8%が1.7未満のMALDIスコアを達成し、属および種との一致率はそれぞれ100%および97%でした。このビデオを視聴することで、MALDI-TOFを用いた同定のために陽性血培ボトルをどのように調製するかについて、十分に理解できるはずです。この方法に従うことで、細菌同定のために調製した同じペレットを用いて、自動薬剤感受性試験のためのより標準化された接種源を調製することができます。例えば、この手法を用いることで、臨床医に早期診断を提供でき、治療管理に影響を与える可能性があります。血液培養ボトルを取り扱う際は危険が伴う可能性があるため、血液培養ボトルの操作時には常に生物安全キャビネットの使用を含む予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶMALDI-TOF質量分析法による血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速同定法。遠心分離と精製ステップで細菌を濃縮し、従来培養法より早期に種同定が可能です。臨床微生物検査の診断速度向上に貢献します。

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

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