Name: ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学ぶスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いた初代ラット新生児心筋細胞の生細胞タイムラプスイメージング手法。レンチウイルスとアデノウイルスによる形質導入後のタンパク質動態をリアルタイムで可視化し、心筋細胞の細胞内プロセスを詳細に観察できます。

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レンチウイルス包装についてのアドバイスをいただいたAlengo Nyamay'antu博士とIlse Timmerman博士に感謝いたします。この研究は、米国心臓協会の科学者開発助成金10SDG4170137によってサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

新生児ラットから単離された初代心筋細胞は、長いin vitroで心筋細胞の機能を研究するために使用されてきた。このプロトコルは、第4℃でトリプシンO / Nで消化し、次いで精製されたコラゲナーゼ、二段階の酵素消化法を用いて、仔ラットから新生児の心筋細胞を単離するための方法が記載されている。精製されたコラゲナーゼ工程を用いる利点の一つは、酵素の同じグレードの全ての単離のために使用されることである。このように、単離された細胞の品質と量は実験から実験と一致している。 細胞培養物の形質導入の高い効率は、所定の実験が必要である場合には、アデノウイルスに関連したより高い形質導入効率を考えると、アデノウイルスを使用することをお勧めします。高レベルの形質導入が不要な場合は、レンチウイルスベクターを使用することができる。アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターのいずれかを使用するオプションを持つことが容易適切なtransdを達成することを可能にする遺伝子の異なるタイプのはじめ発​​現レベル。共焦点スピニングディスク顕微鏡またはICCを用いて生細胞イメージングにより検出された蛍光強...

初代ラット新生児の心筋細胞は、長い試験管 1 に心筋細胞の機能を調べるために用いられてきた。彼らはいくつかのよく確立された方法2-4でラットの子から隔離するのは簡単です。最も一般的な方法は、従来の細胞分離に対する心臓の結合組織を消化するコラゲナーゼまたはトリプシンを採用しています。研究者はまた、大人のげっ歯類5-8だけでなく、新生仔マウス9,10から心筋細胞を単離する方法を開発した。 このプロトコルは、2段階の酵素消化手順を用いて、新生仔ラットから心筋細胞を単離するための方法を記載している。トリプシンは最初に、4℃でO / Nを使用し、次いで、37℃で、精製されたコラゲナーゼ4℃でのトリプシンのO / Nと心臓組織のインキュベーションは、温かい酵素液2シーケンシャルインキュベーションを用いる方法に比べて収穫細胞に必要な手順を軽減します。加えて、精製されたCOを使用して、むしろ粗酵素よりllagenase、ロット間変動は、このように強化された再現性を提供し、排除することができる。 特定のタンパク質の機能的研究は、多くの場合、アデノウイルス11-13および/ ​​または14-16レンチウイルスを用いたタンパク質発現系を使用する。 [注意事項]ウイルス産生および操作は、NIHガイドラインに従って実施されるべきである。 アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれない。これは、分裂細胞​​および非分裂細胞を含めたほとんどの細胞型、ならびに初代細胞および樹立細胞株における形質導入の非常に高い効率を有する。これは、アデノウイルスの遺伝子発現のための信頼性のベクトルになります。アデノウイルスベクターによってコードされるタンパク質の高レベルの形質導入後48時間以内に発症し、それらは数週間続く ​​ことができる17。しかし、タンパク質発現のためのアデノウイルスを使用して1つの欠点は、組換えADEの開発novirusは複雑で時間がかかるの両方です。多くの研究者は組換え遺伝子発現のためのレンチウイルスに目を向けてきたのはこの欠点は、部分的に説明しています。アデノウイルス構築とは異なり、レンチウイルスコンストラクトを生成することは、迅速かつ簡単です。レンチウイルスは、一般に、アデノウイルス形質導入のより低い効率を有するが、分裂および非分裂細胞の両方において、それらは、宿主ゲノムに組み込まない。その結果、形質導入された遺伝子の発現は、アデノウイルス、レンチウイルスに対するよりも、より安定である。 による顕微鏡の分野における技術の進歩のために、組換えタンパク質を発現する細胞の生細胞画像を取り込むことがはるかに簡単である。これは、さらに、取得ビデオレート速度で成り立つ。これは研究者は、目的のタンパク質の特定の改変は、機能的に、リアルタイムで細胞に影響を与える方法を決定することができます。共焦点回転ディスク顕微鏡は、LIVのための最適な手法にするいくつかの重要な機能を持っているEセルイメージング18,19。同時に、点走査型共焦点顕微鏡よりもはるかに少ないレーザーパワーを利用して横河スピニングディスクは、はるかに迅速な画像取得を可能にする。これらの特別な機能の両方は、レーザがサンプルに同時に通過する多数の孔を含有する共焦点スピニングディスク、によるものである。収集中に、ディスク自体は、迅速かつ継続的に18〜20を回転させる。顕微鏡のオートフォーカスシステムを使用することにより、安定したフォーカスが長期間にわたって維持される。これは研究者が十分に焦点を当てた生細胞の画像を撮影することができます。取得した画像を動画ファイルとして再生されます。画像は、ImageJの21,22、フィジー23、又は他の市販のソフトウェアなどの画像解析ソフトウェアを用いて分析する。

<table><tbody><tr><td>斬首用ハサミ</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>1 心臓の隔離とチョッピングのための細いハサミ</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>2 細かい鉗子(デュモンNo.5)</td> <td>シグマ</td><td>F6521</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>3 滅菌済み10cmプラスチック皿</td><td>シグマ</td><td>CLS430165</td><td>心臓の隔離用</td></tr><tr><td>3.5cm ガラス底培養皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>将来の生細胞イメージングのための心筋細胞の最終めっき用。ibidiのMicro-Dishesは、許容できる代替品です。</td></tr><tr><td>3.5 cm ガラス底培養皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>TIRFまたは高解像度画像用</td></tr><tr><td>エタノール溶液、水中70%(v / v) シ</td><td>グマ</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2%ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 滅菌済み10cmプラスチック皿</td><td>シグマ</td><td>CLS430165</td><td>トリプシン化用</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>シグマ</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>2つの10 cmプラスチック細胞培養皿</td><td>シグマ</td><td>CLS430165</td><td>選択用</td></tr><tr><td>オートピペット ドラ</td><td>モンドサイエンティフィック</td><td>4-000-300</td><td>トリチュレーション用</td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セロメータ、自動セルカウンター</td><td>ネクセロム</td><td></td><td>細胞のチェックとカウントに</td></tr><tr><td>顕微鏡と血球計算計</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>細胞のチェックとカウント</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>三洋</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーションオービタルシェーカー</td><td>シグマ</td><td>Z673129</td><td>コラゲナーゼで心臓組織を37°Cで振る。C 170-200 rpm</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU 溶液</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>invitrogen</td><td>41965039</td><td>ミックス培地 プロトコルに示されているように温め、使用前に温め</td></tr>てください <tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>プロトコルに示されているように培地を混合し、使用前に温め</td></tr>てください <tr><td>ウシ胎児血清</td><td>invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>セクション 2 レンチウイルス形質導入</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 パッケージングプラスミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス転写ベクター、pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM(無血清培地)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyethyleneimine」Max", (MW 40,000) - 高効力線形PEI(遊離塩基形でMW 25,000に相当)&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>RocheのX-tremeGENE 9で代用可能 Roche</td></tr>の<tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>トランスフェクション試薬としてPEIの代替品</td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>水に溶解し、100mMのストック溶液を作ります。エンドソーム酸性化の抑制は、10-100 &mu;Mクロロキン。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Luer-Lokシリンジ、滅菌済み</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;mフィルター</td><td>シグマ</td><td>F8677</td><td>酢酸セルロースまたはポリエーテルスルホン(PES)(低タンパク質結合)フィルターのみを使用してください。ニトロセルロースフィルターは使用しないでください。ニトロセルロースはレンチウイルスエンベロープ上の表面タンパク質に結合し、ウイルスを破壊します。</td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>水に溶かして8mg/mlの原液を作り、ろ過して滅菌します。</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 6,000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td></td><td>ΣS5881</td><td></td></tr><tr><td>セクション3 アデノウイルス形質導入</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>約10cm細胞培養皿</td><td>Σ</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>蓋付き96ウェルマイクロプレート、平底、組織培養、滅菌BD</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>滴定用</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット、10-100 &mu;l、8チャンネル</td><td>エッペンドルフ</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>セクション4 ライブセルイメージング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点マイクロスポピー</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>温度制御チャンバー</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>温度を37°に保つために;C</td></tr><tr><td>A CO2環境システム</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>CO2濃度を維持するためのオプション 最適な</td></tr><tr><td>CO2 独立した培地、グルタミンなし</td><td>invitrogen</td><td>18045-054&nbsp;&nbsp;</td><td>長時間のタイムラプス撮影に</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>長時間のタイムラプスイメージング用</td></tr></tbody></table>

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

彼らは簡単に単一のプロシージャで大量に単離することができるので、初代ラット新生児心筋細胞では、基本的なin vitroでの心血管系の研究に有用です。原因顕微鏡技術の進歩には、細胞への毒性に関する最小限の懸念をリアルタイムに細胞事象を調査する目的で生細胞の画像をキャプチャすることは比較的容易である。このプロトコルは、細胞の性質を調節するためのレンチウイルスおよびアデノウイルス形質導入後の共焦点回転ディスク顕微鏡を用いて、初代ラット新生児心筋細胞の生細胞タイムラプス画像を撮影する方法を説明します。ウイルスは二つの異なるタイプのアプリケーションは、簡単に2つの異なる遺伝子のための適切な伝達率および発現レベルを達成することができる。ウェル集束生細胞画像が長期間にわたって安定したフォーカスを維持し、顕微鏡のオートフォーカスシステムを用いて得ることができる。この方法は、外因的にエンジニアの機能を適用すること初代培養細胞において発現編タンパク質は分析することができる。さらに、このシステムは、siRNAの使用を介して、並びに化学モジュレーターの遺伝子の機能を調べるために使用することができる。

技術は、レンチウイルスをコードするEGFP（強化緑色蛍光タンパク質）タグ化Cx43の（コネキシン43）又は細胞におけるEGFP-タグ融合タンパク質を発現するために使用された変異したCx43 32、およびアデノウイルスをコードFGFR1DN（線維芽細胞増殖因子受容体1ドミナントネガティブを説明するために）セル33-35においてFGFシグナリングをシャットダウンするために使用した。心筋細胞の単離後三日間は、孤立した心筋細胞は、細胞中のEGFP標識タンパク質を発現させるためにレンチウイルスを形質導入した。次に、レンチウイルス形質導入の3日後に、孤立した心筋細胞は、さらに細胞内のFGFシグナル伝達を排除するためのアデノウイルスのエンコーディングFGFR1DNで形質導入した。形質導入された外因性遺伝子を発現するように細胞のための十分な時間を与えた後、スピニングディスク共焦点顕微鏡は、生細胞の画像をキャプチャするために使用した。取得された画像は、動画ファイルとして再生し、画像解析ソフトウェアを用いて分析する。より詳細なrepresenta用TIVE結果は、桜井ら 32を</su...

このプロトコルは、共焦点回転ディスク顕微鏡を用いたレンチウイルスおよびアデノウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞を用いた生細胞イメージングの方法を説明しています。これにより、生きた心筋細胞の細胞過程を詳細に観察することができます。

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

この手順の全体的な目的は、共焦点回転ディスク顕微鏡を用いて、レンチウイルスおよびアデノウイルスによる形質導入後のラット新生児初代心筋細胞のタイムラプス画像を取得することです。まず、ラットの仔から心筋細胞を採取し、ガラスボトムディッシュに播種します。次に、レンチウイルスを用いてEGFPタグ付きConexion 43を形質導入し、続いてアデノウイルスを用いてドミナントネガティブfgfrを心筋細胞に形質導入します。最終ステップは、共焦点回転ディスク顕微鏡を用いてタイムラプス画像を取得することです。最終的に、取得したタイムラプス画像から再生される動画を得ることができます。これにより、アデノウイルスで発現させたドミナントネガティブfgfr oneにより細胞条件を変化させた生きた初代心筋細胞において、レンチウイルス遺伝子により発現したEGFPタグ付きタンパク質の分布が示されます。この手法の主な利点の一つは、アデノウイルスまたはその後開発されたトランスフェクションによる遺伝子発現誘導後の任意の条件下で、回転円盤共焦点顕微鏡を用いて生細胞のタイムラプスイメージングが行えることです。したがって、この方法は新生ラット心筋細胞に関する知見を提供することが可能です。また、マウス新生一次心筋細胞、マウス成体一次心室心筋細胞、およびその他の培養細胞などの他のシステムにも適用できます。一般的に、顕微鏡操作に慣れていない方は、時間の経過とともにステージがわずかにドリフトするため、適切にピントを合わせた画像を撮影することに苦労します。装置のオートフォーカス機能を使用することで、安定したフォーカスを維持でき、研究者はより簡単にピントの合った画像を撮影することが可能になります。本手順で使用する新生児心筋細胞は、生後1〜2日のラット幼仔から単離したものです。滅菌した器具を用いて、安楽死させた動物から拍動中の心臓をできるだけ速やかに摘出し、50 mLコニカルチューブに入れた30 mLの氷冷C-M-F-H-B-S-Sに心臓を入れます。通常、合計10個の心臓を2本の50 mLコニカルチューブに回収し、各チューブに5個の心臓を30 mLの氷冷C-M-F-H-B-S-Sと共に保存します。撮影用には、2〜3個の心臓を回収します。チューブを swirling させて心臓を洗浄します。すべての操作は、氷上およびラミナーフローフード内で行ってください。ここから、上清を捨て、心臓を氷上の新しい滅菌済み 10 centimeter プラスチックディッシュに移します。アスピレーターで心臓を吸引しないように注意してください。心臓から大きな血管や不要な組織を取り除きます。ディッシュに氷冷したC-M-F-H-B-S-Sを10 milliliters加え、心臓を洗浄します。次に、すべての心臓を氷上の新しい滅菌済み10 centi

live-cell-imaging-primary-rat-neonatal-cardiomyocytes-following

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。...

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

ここでは、のために必要なツールを開発...

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。...

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

新生児ラット心筋細胞の分離は時間がかかり、予測不可能な手順です。...

新生児ラット心筋細胞の単離と凍結保存

このプロトコルは、成体マウス心筋細胞の再現性のある単離と長期培養のための段階的な方法を説明しています。これは、高収率、純度、および生存率を備えています。...

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。...

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。...

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。...

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

ここでは、成体マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、および長期培養のためのプロトコルを提示する。...

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。...

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

学ぶスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いた初代ラット新生児心筋細胞の生細胞タイムラプスイメージング手法。レンチウイルスとアデノウイルスによる形質導入後のタンパク質動態をリアルタイムで可視化し、心筋細胞の細胞内プロセスを詳細に観察できます。

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

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