Name: マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶマウスにおける遠位中大脳動脈の永久凝固法。電気凝固により皮質梗塞を誘導し、感覚運動欠損と梗塞体積を評価します。再現性が高く死亡率が低いため、基礎および臨床応用の脳卒中研究に有用なモデルです。

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この作品は、ドイツの研究財団」システム神経（相乗作用）のためにミュンヘンクラスター」の優秀クラスタによっておよびALにダイムラーベンツ財団によって資金を供給された

倫理声明このビデオで報告された実験は、実験動物の使用に関する国のガイドラインに従って行ったとプロトコルは、ドイツ政府の委員会（RegierungフォンOberbayern、ミュンヘン、ドイツ）によって承認された。 10週齢の雄性C57BL/6Jマウスをこの研究で使用されている。動物は、12時間の明暗周期と地方政府の委員会によって承認された。鎮痛および鎮静プロトコルが記述されてペレット化食料と水を自由にアクセスできるように、制御された温度（22±2℃）で飼育されたが、異なる場合があります他の研究室で使用されるプロトコルから。 1。材料の作製と楽器<ol><li>暖かい操作領域を維持し、麻酔中のマウス体温（37℃）を維持するために、熱ブランケットを接続する。 </li><li>準備オートクレーブ処理ハサミ、ピンセットや綿、dexpanthエノール眼軟膏や縫合材料。水和さ動作領域を維持するために、（針なし）食塩水の注射器を準備します。麻酔ガス（70％のN 2 O + 30％のO 2 +イソフルラン）を準備します。 </li><li>腹腔内に鎮痛剤を注入：メタミゾール200 mg / kgを、カルプロフェン4 mg / kgのとブプレノルフィン0.1 mg / kgのを。 </li><li>自発的な身体の動きや鼻毛停止するまでそれを麻酔4％のイソフルラン流量で導入チャンバーにマウスを置きます。 </li><li>麻酔マスクに鼻と横方向の位置でマウスを移し、さらに約分間4％イソフルラン濃度を維持し、適切な麻酔を維持するためにapprox.1.5％でそれを削減し、。 </li><li>両眼にデクスパン眼軟膏を適用します。 </li></ol> 2遠位MCAOモデル<ol><li>手術部位の資料を使のaseptical調製後少し操作ハサミを使用して、耳と目の間の1cmの皮膚切開を作るGの皮膚消毒剤。 </li><li>皮膚を分離し、側頭筋をローカライズ。 </li><li>高周波発生器で凝固機能、バイポーラモードを選択し、12 Wを選択して、ケーブルで電気凝固鉗子を接続します。 </li><li>生理食塩水の滴を追加し、完全に筋肉を取り外すことなく、筋肉のフラップを作り、それによって、その先端および背部分の頭蓋骨から側頭筋を分離するために鉗子を使用しています。 </li><li> 、時間領域の吻側部分的には、透明な頭蓋骨の下に眼窩洞（ 図2A）に背をMCAを特定します。 MCAの分岐が（解剖学的正常な変動に起因して）表示されていない場合は、容器の最も頭側を識別します。 </li><li>それは薄く、半透明テクスチャ（ 図2B）を持つまで右MCAの枝上のドリルで骨外頭蓋骨と薄い上のいくつかの生理食塩水を追加します。 </li><li>慎重に、非常に薄い、鉗子で動脈の上に骨を撤回。 </li><li>バイポーラモードを選択してIW. 7のn高周波発生器分岐（ 図2C）の近位および遠位の電気凝固鉗子で動脈を凝固させる。分岐による解剖学的バリアントに表示されていない場合には、およその2箇所（上記参照）が正しく識別されたMCA枝を凝固。 1ミリメートルの距離。それは上から両側の鉗子で注意深く動脈に触れる、凝固用鉗子で動脈を把握する必要がないことは十分であり、より少ない機械的損傷を誘発する。 </li><li> 30秒待ってから、ゆっくりと自発的な再疎通のために任意の血流を確認するために鈍い鉗子で動脈をタッチします。再疎通の場合、一度電気凝固を繰り返します。 </li><li>バーホールをカバーし、その位置に頭筋を変える。 </li><li>傷口を縫合し、麻酔から回復してケージに戻し、32℃での看護ボックスに動物を配置します。一般に、anesthから回復するために、動物のための5〜10分かかりますESIA。 </li><li>カルプロフェン4 mg / kgの第5の術後の日まで毎日、24時間後に術後鎮痛（IP）を注入し。 </li></ol> 3。仮手術公開される動脈を凝固ない以外は - 頭蓋骨とその除去の薄化を含む - 上述した動作と同一にすべての手順を実行します。 4シリンダのテスト13 <ol><li>透明なアクリルガラスシリンダーに動物を置き（直径：10センチメートル、高さ：25センチメートル）5分間2ミラーおよびビデオテープの前で。最適なビデオ（ 図3A）を得るために2ミラーとシリンダーの前に集中的にカメラを調整します。 </li><li>独立した前肢の使用を評価するためのスコア（1）フルリアと全リア後床に一つだけの前肢と（2）着陸中1前肢とシリンダー壁との接触。スローモーションやフレームごとのFRを使用して1前肢のために少なくとも20の接点を数えるビデオLANクライアントのAME機能（VLC）フリーソフト（ <a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a> ）。 </li><li>手術前のベースライン解析のために：試験間1時間の休憩で、マウスあたり二回の試験を行う。前肢の使用は、左側の/右、独立した前肢の使用割合として表される。 </li><li> MCA凝固後：上に示したように試験間で1時間の休憩で、マウス二回再度テストを実行します。 </li></ol> 5。灌流<ol><li>動物を麻酔し（ 例えば、それぞれ、ケタミンおよびキシラジン16分の120 mg / kg体重、による）。 </li><li>仰臥位で動物を固定し、中央値カットで腹腔を開きます。リッピングと胸骨を削除します。右心房に小さな切開を行います。左心室に灌流カニューレを挿入し、徐々に生理食塩水20mlで灌流。 </li><li>動物の首を頭蓋冠を開き、ゆっくりと頭蓋底からの脳を切り離す。 </li><li&gt; 10分間-40℃の寒冷イソペンタン中で脳をフリーズします。その後-80℃でさらに分析までイソペンタン、店舗からの脳を削除</li></ol> 6。梗塞容積測定<ol><li>凍結切片：20μmの厚さの切片をクリオスタットで連続的にスライド上のすべての400μmで脳をカットし、-20℃でスライドを保存する</li><li>クレシルバイオレット（CV）染色。 <ol><li>染色溶液を調製：500 mlのH 2 OにCVの酢酸0.5グラムを混ぜる結晶が溶解するまで撹拌し、熱（60℃）。ソリューションは、冷ますと暗い瓶の中に保管してください。すべての使用前に60℃、フィルタに再加熱。 </li><li>室温で30分間スライドを乾燥する。次いで1分間50％エタノール中で15分間、その後95％エタノール中に置き、次いで70％エタノール中で1分間、そして。 </li><li>蒸留水を更新し、1分のためにそれらを中に置き、2分間蒸留水にスライドを置きます。その後、染色溶液（60°C）からfスライドを配置するまたは10分、1分間蒸留水で二度、それらを洗ってください。 </li><li> 2分間、95％エタノールでスライドを配置します。その後、5分間100％エタノールにそれらを配置し、100％エタノールを更新し、2分のためにそれらを中に配置します。その後封入剤でスライドをカバーしています。 </li><li>分析： スライドをスキャンし、浮腫を補正するために、スワンソン法14による間接梗塞容積を分析します。 （虚血領域）=（対側の皮質の面積） - （同側の非虚血性皮質エリア）（ 図4A）。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することなく、競合する利害関係はありません。

いわゆる「凝固モデル」 - この議定書は、経頭蓋電気凝固による遠位、永久MCAOの実験的脳卒中モデルについて説明します。このモデルは、一方の実験的脳卒中研究12の中で最も頻繁に使用される動物モデルの一つとなっている。他の局所脳虚血モデルと比較して、この動画で示されたように凝固モデルは、訓練された科学者によって実行される、約10分の非常に短い動作時間という利点を有する。従って、短時間の麻酔時間が神経保護及び脳卒中転帰に対する麻酔薬の影響は15周知であるため、実験的脳卒中モデルの有利な特徴であり、このモデルで達成することができる。遠位MCA永久凝固は、ヒトの大部分において虚血性脳病変に対応する後さらに、以前にカーマイケルらによって記載されるように、図11は、得られた梗塞体積および局在ことを裏付ける脳の大きさに比例してストローク。人間のストロークは、前の集団研究と臨床イメージング試験16〜18に基づいて、半球の約5〜15％で病変を有するサイズは主に小さく、10％未満の中で発生する圧縮脳浮腫との広範なストローク病変とは対照的に、臨床ストローク19。これにより、提示されたモデルによって達成半球の約12％のMCA領域における脳卒中病変は、翻訳関連の拍出量とみなすことができる。しかしながら、異なるマウス系統または使用される麻酔プロトコルは結果として生じる病変体積20に影響を与える可能性があることを考慮に入れなければならない。 このモデルにおける卒中誘導後の観察期間中の死亡率は実質的に不在である。除外基準に達するための5％未満の全死亡率が原因anesthesiological合併症や犠牲の動作中に死亡から主に構成されている。低Vを保証するためには、運転中の1）すべてのくも膜下出血：このモデルとその優れた再現性ariabilityは、我々は以下の除外基準を提案する。 2）運転時間が15分を超える。唯一の過渡MCAOと電気凝固のための2回の試行後、MCAの3）再疎通。さらに、動物は、痛み、不快感又は疾病行動をコントロールするためにMCAO（塩基性の生理的挙動、毛皮の外観および体重）の後に毎日検査する必要がある。 いくつかの対策がレーザスペックル測定、磁気共鳴イメージング、行動試験または組織学的分析のような脳卒中の結果の分析のために実施してもよい。このプロトコルでは、行動分析、および梗塞体積分析のための例示的な方法を提供する。局所脳虚血後の行動分析のためのいくつかのテストを開発し、実験的な脳卒中の研究に用いられてきた。以前にこのストロークモデル21,22の我々に我々のグループで使用される感覚運動機能障害に適しテストロータロッド試験23、付箋ラベルテスト24、コーナーテスト25と、このビデオで実証されたシリンダのテスト13、再。円筒試験は、一貫して、遠位永久MCAO後の急性期における運動の非対称性を示しているとも運動機能の回復連続で検出します。 明白な利点にもかかわらず、この脳卒中モデルのいくつかの制限を考慮しなければならない。まず、頭蓋骨の穿孔は手術創、側頭筋や脳自体の細菌感染が、自分自身が検出されたことはないが、それによって、脳の周囲の運用感染の潜在的なアクセスを生産、動脈を凝固するために必要であるまたは、このモデルを使用して他の人が文書化された。また、準備および凝固時の皮質への機械的な損傷を除外することはできませんが、慎重に掘削し、頭蓋骨の除去、手術部位の一定加湿し、最小限のNEによって制限することができます<html> cessary電気凝固（除外基準を参照してください）​​。 図2に示すように、MCAの経過は、C57BL / 6マウスの大多数において見出されているが、モデルの変動性を最小限にするために、血管のコースの通常の変動に進行する方法をプロトコールに記載している。さらに、我々は複数の使用を示唆している（分岐の場合は3を、MCAの分岐点のない2）閉塞部位は、我々の経験では、このモデルの多様性のための重要な要因であるMCAの部分再疎通のリスクを最小限に抑えるため。 行動試験の点で、わずかな行動障害は、上述した行動試験および機能的再生に検出することができる脳卒中後1週間以内に観察することができる。したがって、より高い感度と熟練到達テスト27のような定性試験パラメータと、より高度なテストシステムは、このモデルでは、長期的な機能予後を検出する方が適しているかもしれません。 ontent &quot;&gt;最後に起因するMCAの永久凝固にノーと再灌流は、自発的な血餅溶解または治療28に脳卒中患者のかなりの割合で観察された特徴である、得ることが可能であるが、前に説明した血栓塞栓脳卒中モデル26が提供するにより、最小限の死亡率と人間のストロークに対する匹敵相対梗塞体積とローカリゼーションへの皮質の脳虚血再灌流と無料の脳卒中モデルのためのオプション。まとめると、高い再現性、可能性、長期的な観察が「凝固モデル」を区別する基本および翻訳脳卒中研究のための貴重なモデルとして。

脳卒中は死因の3番目の最も一般的な原因であり、先進国の1、取得した成人の障害の1主な理由である。約15％が脳内出血2によって引き起こされている間、この急性神経疾患の約80％が脳血流の閉塞に起因する脳虚血により引き起こされる。現在進行中の研究にもかかわらず、組織プラスミノーゲン活性化因子の静脈内投与は、脳卒中発症後の3,4、これまでと脳卒中患者の少数派だけが利用できるため、4.5時間の短い認可されたタイムウィンドウの虚血性脳卒中の唯一の承認薬理学的な治療法です。きちんとストローク中脳、血管系および全身病態生理学的メカニズムとの間の複雑な相互作用をモデル化できないin vitroモデルは、存在しないように、動物モデルは、前臨床脳卒中研究に不可欠である。 したがって、いくつかの虚血性脳卒中モデルは、変数が開発されている種のETY。最も一般的に使用される脳卒中モデルの一つは、縫合フィラメント一過内頸動脈に導入し、先端部が血流の停止をもたらす、中大脳動脈（MCA）の起点を閉塞するまで転送される「フィラメントモデル」であるおよび皮質下や長時間の閉塞例においても皮質領域5,6のその後の脳梗塞。虚血性脳卒中の光血栓のモデルでは、照射された皮質血管の光化学閉塞は、小さな、ローカルに外接病変7、その結果光増感剤の注射の後に達成される。 lenticulostriatal動脈の遠位MCAの永久閉塞は動脈の結紮、その一過性または永続的な圧縮によって凝固8,9によって達成することができる。このモデルにおけるMCAの閉塞が静水に対して遠位であるため、このモデルでの結果の梗塞は、主に新皮質10に影響を与えます大脳基底核を供給ulostriatal動脈。 人間の脳卒中病変の大部分は、中大脳動脈の領域に位置しているので、一般的なストロークモデルのすべてがMCAの閉塞またはその分枝11の1に似ている。 MCAは、脳への血液供給を提供する主要動脈の一つであり;それは、横方向溝に沿って内頸動脈、ルートから発生する場所、それが、その後基底核と前頭葉、頭頂葉、一次運動および感覚皮質を含む側頭葉の側面に分岐し、プロジェクト。左右のMCAはウィリス（ 図1）の輪を作る、前大脳動脈と後大脳動脈に接続する動脈を、通信後部に接続されている。 以前にカーマイケルら 11により報告された、遠位中大脳Arでモデル化さ梗塞マウスでのバッテリ閉塞（MCAO）モデルは、それによって皮質MCA領域11,12に配置されている人間の脳卒中病変の大部分を模倣し、半球の約10〜15％を包含する。 1981年に、田村らは 、ラット8永久、経頭蓋MCAO凝固モデルを説明した。しかし、田村によって記述されたモデルは、動脈の分岐部より遠位のを回避するために、MCA閉塞の近位に関与する。したがって、元の「タムラ·モデルは、「6」フィラメントモデル」によって得られた病変に類似していないだけでなく、皮質線条体病変を誘導する。ここでは、マウスでの経頭蓋電気凝固による永久遠位MCAOモデルについて説明します。さらに、我々は、このモデルでは、ストロークの結果を分析するために、関連する組織学的および機能的な方法を報告している。すべてのメソッドが開発され、私たちの研究室で使用される標準的な操作手順に基づいています。

<table><tbody><tr><td>カメラ Canon Eos 500D</td><td>Canon</td><td></td><td>Optics: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 ビデオ機能</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Kristallform</td><td>2677089</td><td>30 x 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>透明アクリルガラス</td><td>シリンダーH&S Kunststofftechnik</td><td></td><td>直径: 8 cm,&nbsp; 高さ: 25 cm</td></tr><tr><td>加熱ブランケット</td><td>FHC DC 温度コントローラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細かいはさみ</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>メイヨーはさみ</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>綿</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>ブラウン</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthenポマード</td><td>バイエル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン用麻酔システム</td>DrägerStereomikroskop<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>ステミDV4</td><td></td></tr><tr><td>電気手術装置</td><td>ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&auml;t</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>Proxxon</td><td>D-34343</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラシン</td><td>アルブレヒト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml 注射器&nbsp;</td><td>ブラウン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水PH:7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit 実装媒体</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6Jマウス</td><td>Charles River</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

脳卒中は死因の3番目の最も一般的な原因であり、先進国における後天大人の身体障害の主要な原因である。非常に限られた治療上のオプションは、急性期脳卒中患者のごく一部のために用意されています。現在の研究は、集中的に新たな治療戦略を探索していると、より多くの患者が長期の時間窓における治療的介入の対象となる可能性があるため、ますます脳卒中後の亜急性および慢性期に焦点を当てている。これらの遅れのメカニズムは、脳卒中後の炎症、血管新生、神経可塑性や再生などの重要な病態生理学的経路を含む。これらのメカニズムを分析し、その後、新規の薬物標的を評価するために、臨床的関連性、低死亡率および再現性の実験的脳卒中モデルが求められている。さらに、マウスは、焦点脳卒中病変が誘発される可能なトランスジェニックモデルの広いスペクトルがある最小の哺乳動物である利用できる。そこで、ここでは経頭蓋のマウスモデル、lenticulostriatal動脈、いわゆる「凝固モデル」の電気凝固先端を経由して中大脳動脈の永久的な凝固を説明します。このモデルで生じた梗塞は主に大脳皮質に位置しています。脳の大きさとの関係で相対梗塞体積は、人間のストロークの大半に対応している。また、このモデルは再現性と低死亡率の上記の基準を満たしています。このビデオでは、「凝固モデル」における脳卒中誘導の外科的方法を示し、組織学的および機能的な解析ツールを報告する。

が短い麻酔時間と適度な脳の損傷のため、約10分をケージに転送後、すべての動物が自由にケージに移動させ、同腹仔との相互作用、目を覚ました。 MCAO手術中の死亡率は、主に、偶発的なくも膜下出血または不適切な麻酔の結果として、5％未満であった。脳卒中誘発後7日間の観察期間中の死亡率は、動物の約1〜2％とごくまれにしか発生しません。このレポートのために10匹の動物の一連の動作において、全ての動物は、それらのどれもが原因の除外基準に除外されることがなかった、動作および7日間の観察期間生存した。 MCA凝固後の行動欠損は前足使用非対称性を分析する円筒試験13により評価した。この試験では、独立した左右の前足の使用割合は、脳卒中誘発後示した時点で測定し、24を得たベースライン値と比較するMCAO（ 図3B）には、HR。動物は、試験のシリンダ24時間での組合せ壁探査四肢使用の非対称の有意な変化を示した（1.72±0.326であり、p &lt;0.05）および3日（1.36±0.17であり、p &lt;0.05）MCAO後。比が1週間の観察期間中に改善したが、モータの非対称性は、7日MCAO後でも有意であった（1.35±0.29であり、p &lt;0.05）、ベースライン値と比較した。 我々は7日間ストローク誘導（ 図4B）の後にシリアル冠状脳切片を染色し、クレシルバイオレットを使用して、梗塞容積測定を行った。意味梗塞容積は、それによって1脳半球（ 図4C）の12％に相当、15.4ミリメートル3であった。この脳卒中モデルの変動性は、約10％の標準偏差が非常に低い。病変領域は、皮質下構造のわずかな愛情と体性感覚·運動皮質を包含する。さらに、梗塞の局在回路図分布図（ 図4D）のように面積が最小限の変動性の高い予測可能である。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。ウィリス輪の模式図。ウィリス動脈円は内頸動脈（ICA）からの分岐だけでなく、することにより、中大脳動脈（MCA）と前大脳動脈（ACA）によって形成されている脳動脈（PCA）と後交通動脈（PComA）を後方。 MCAは、大脳皮質には枝の横溝に実行されます。 BA =脳底動脈;; SUCA =優れた小脳体性感覚皮質の運動野と部品の大部分を供給して支配的なMCAの枝が永続的に実証されたモデル（アコマ=前交通動脈に吸蔵されているLAR動脈）。 <img alt="図2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" /> 図2。頭筋およびMCA閉塞の模式図を除去した後の経頭蓋ビュー。 （A）側頭筋を除去した後皮質動脈は（8〜12週齢のマウスで）部分的に半透明のマウスの頭蓋骨を通して見ることができます。支配のMCAの分岐は、時間的視野の吻側部分だけでなく、尾の部分に、MCAおよびPCAから分岐、さらに皮質動脈内で識別することができます。分岐部との主な変動の支配的なMCA枝の（B）の概略図を横側頭皮質にバーホールを開け、頭蓋骨を除去した後、（C）は黒い四角は、分岐の近位および遠位側にMCA凝固部位を表す。 図3。行動障害の分析。 （A）シリンダテストは、セットアップ：マウスは、垂直シリンダ内に配置され、ミラーは、ビデオカメラを用いて動きの全てを登録するために背後に配置されている（B）前肢用非対称性は、シリンダテストを用いて分析した。独立した前肢の使用の左/右の比率は、MCAO前、脳卒中誘導後示した時点で24時間を算出した。 Nは、指示された時及びベースライン（対照）の値との間に0.05 *はp &lt;= 10。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。遠位MCAO後の梗塞分析および梗塞の転帰体積。クレシルバイオレット染色冠状ブラジャー（A）の代表画像セクションのMCAO後7日間。黄色の線は、対側（右）皮質が選択されたことを示すされており、赤線は同側の脳の非梗塞（染色）皮質を選択している。左半球の薄い領域は、梗塞組織領域を示している。（B）の梗塞容積の10の脳の分析（それぞれが1個々の脳を表すドット）24時間、3日間および遠位MCA凝固後の7日間。横の赤線は、平均、エラーバーは標準偏差を示す。（C）代表クレシルバイオレットは、MCA凝固後7日目の冠状脳切片ごとに400μmで染色した。（D）7日、MCAO後、梗塞脳組織の概略分布を表す。各スライドはブレグマ（。：;オックスフォード大学出版の許可を得てLiesz A ら 、脳、2011年からイメージを変更された）との関係で一定の部分で梗塞分布（示されているように色分けさ）の蓄積された情報を示している。 &lt;HREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg&quot;ターゲット= &quot;_blank&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

中大脳動脈閉塞（MCAO）の種々のマウスモデルが広く実験的脳研究において使用される。ここでは、人間の虚血性脳卒中の過半数によって課さ被害に対応する大き​​さの一貫した皮質梗塞を生成し、経頭蓋永久遠位MCAOのモデルを示しています。

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

本手順の全体的な目的は、マウスの中大脳動脈遠位部を永久的に閉塞させ、主に皮質に位置し、かつヒトの脳卒中と同程度の大きさの梗塞を誘発することです。まず、手術前に肢の使用の非対称性のベースラインを測定します。次に、中大脳動脈遠位部の電気凝固による脳卒中誘発手術を行います。手術後、4肢の使用非対称性をスコア化することで、局所的な感覚運動機能欠損を検査します。最終ステップとして、クリスタルバイオレット染色を用いて梗塞体積を解析します。最終的に、得られる皮質病変はばらつきが少なく中程度の大きさとなり、この手法は基礎的およびトランスレーショナルな脳卒中研究において価値のあるモデルとなります。他の一般的な脳卒中モデルと比較した本手法の主な利点は、死亡率が極めて低く、梗塞体積および局在が制御できることです。新皮質はヒトの脳卒中の大部分を占めており、本モデルは高い再現性を示します。一般的に、この手法に慣れていない人は、機械的な損傷を最小限に抑えるための慎重な頭蓋骨除去にまず苦労することになります。第二に、このモデルにおいては、遠位中大脳動脈を正確に同定し、適切に相関させることが極めて重要です。まず、手術開始の30分前に鎮痛剤を投与します。マウス用の加温ブランケットのスイッチを入れ、手術中の温度を37 °Cに設定します。次に、70%窒素、30%酸素、およびイソフルランで構成される麻酔ガスを準備します。その後、マウスを導入チャンバー内で4%イソフルランにさらし、動きが止まるまで待ちます。続いてマウスをヒートパッドの上に配置し、4%イソフルランをさらに1分間投与します。1分後、イソフルランの投与率を1.5%に変更します。次に、足指をつまんでマウスが十分に麻酔されているか確認し、問題がなければ、眼球にダファンエタノールを塗布します。耳と眼の間を1cm切開して手術を開始します。皮膚を剥離し、側頭筋を同定します。次に、高周波発生器の機能を凝固に、モードをバイポーラに、出力を 12 watts に設定し、鉗子を取り付けます。準備として、露出した側頭筋に生理食塩水を一滴滴下します。その後、電気凝固鉗子を用いて、側頭筋の先端部および遠位部を頭蓋骨から剥離します。これにより、筋肉フラップが緩んだ状態になります。次に、透明な頭蓋骨の下にある中大脳動脈（MCA）を確認します。これは側頭領域の吻側、眼窩後静脈洞の背側に位置しています。ドリルを用いて、この動脈の直上の骨が薄くなり、貫通するまで削ります。穿孔中は生理食塩水を用いて頭蓋骨を湿らせた状態に保ってください。次に、非常に精密なピンセットを用いて慎重に骨を取り除き、MCA分枝を露出させます。高周波発生装置を7Wに設定します。次に、電気凝固鉗子で動脈を軽く触れるようにし、把持せずに凝固させます。動脈の中大脳動脈（MCA）分岐部の近位側と遠位側の両方を凝固させます。MCAに分岐がない解剖学的変異がある場合は、可能な限り近位側で、凝固後に約1mmの間隔を空けて2か所を凝固させます。30秒間待機した後、鈍端鉗子で動脈にそっと触れます。次に、筋肉を元の位置に戻して穿孔部を覆います。創部を縫合し、動物を32°Cに設定した保温箱に入れ、麻酔から回復させてからケージに戻します。一般的に、動物が麻酔から回復するまでには5〜10分かかります。シリンダーテストでは、一方の肢をもう一方よりも優先して使用しているかを確認します。動物を、直角に配置された2枚の鏡に囲まれた透明なアクリルガラス製シリンダーに入れます。シリンダーの反対側にある2枚の鏡の頂点に向かい合わせに動物を5分間ビデオ撮影します。各試行後、シリンダーとテーブルトップを60% ethanolで拭き取ります。その後、フレームごとの解析を行います。完全に立ち上がった状態で、4肢のうち1肢がシリンダーに接触した回数と、4肢のうち1肢で着地した回数をカウントしてアッセイをスコア付けします。完全に立ち上がった回数をスコア付けした後、試験あたりの凍結切片につき、少なくとも20回の1肢による接触を確認します。脳を20 µm厚の切片に連続的に切断し、切断間隔は400 µmとします。切片をスライドガラスに回収し、-20 °Cで保存します。この切片作成プロトコルを用いることで、1つの脳から得られた梗塞領域を含むすべての切片を1枚のスライドに配置することが可能です。標準的なクリスタルバイオレット染色プロトコルを用いて切片を染色し、各脳切片における梗塞組織の領域を明確にします。その後、スライドを封入し、スキャンして、Swanson法を用いて浮腫の解析を行います。MCA閉塞術による矯正死亡率は5%未満であり、主な原因はくも膜下出血または麻酔不全であった。観察期間中の死亡例はなかった。PA利用のための本解析では、脳卒中誘発後にシリンダーテストを用いて非対称性を測定し、MCA閉塞前のベースライン値と比較した。その結果、24時間後に有意な肢の非対称性が検出され、それは脳卒中後1週間の間に部分的に回復した。クリスタルバイオレット染色による脳梗塞の誘導および評価の結果、平均梗塞体積は15.4 cubic millimetersであり、これは脳半球の約12%に相当した。本モデルの標準偏差は非常に低く、さらに梗塞部位のばらつきも最小限であった。適切に実施すれば、この操作は10分以内に完了させることができます。実演したシリンダーテストやクリスタルバイオレット染色以外にも、確立された他の行動テストや組織学的手法を用いることで、結果をさらに詳細に特性評価し、特定の研究課題に取り組むことが可能です。このビデオを視聴することで、マウスにおける永続的な遠位MCA閉塞の手法について十分に理解できたはずです。本手法の再現性を維持するために、標準作業手順書（SOP）の使用と詳細な記録を強く推奨します。

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JoVE Journal

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遠位中動脈閉塞法を用いたマウスにおける急性虚血性脳卒中の誘発

学ぶマウスにおける遠位中大脳動脈の永久凝固法。電気凝固により皮質梗塞を誘導し、感覚運動欠損と梗塞体積を評価します。再現性が高く死亡率が低いため、基礎および臨床応用の脳卒中研究に有用なモデルです。

マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固

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