マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固

本手順の全体的な目的は、マウスの中大脳動脈遠位部を永久的に閉塞させ、主に皮質に位置し、かつヒトの脳卒中と同程度の大きさの梗塞を誘発することです。まず、手術前に肢の使用の非対称性のベースラインを測定します。次に、中大脳動脈遠位部の電気凝固による脳卒中誘発手術を行います。

手術後、4肢の使用非対称性をスコア化することで、局所的な感覚運動機能欠損を検査します。最終ステップとして、クリスタルバイオレット染色を用いて梗塞体積を解析します。最終的に、得られる皮質病変はばらつきが少なく中程度の大きさとなり、この手法は基礎的およびトランスレーショナルな脳卒中研究において価値のあるモデルとなります。

他の一般的な脳卒中モデルと比較した本手法の主な利点は、死亡率が極めて低く、梗塞体積および局在が制御できることです。新皮質はヒトの脳卒中の大部分を占めており、本モデルは高い再現性を示します。一般的に、この手法に慣れていない人は、機械的な損傷を最小限に抑えるための慎重な頭蓋骨除去にまず苦労することになります。

第二に、このモデルにおいては、遠位中大脳動脈を正確に同定し、適切に相関させることが極めて重要です。まず、手術開始の30分前に鎮痛剤を投与します。マウス用の加温ブランケットのスイッチを入れ、手術中の温度を37 °Cに設定します。

次に、70%窒素、30%酸素、およびイソフルランで構成される麻酔ガスを準備します。その後、マウスを導入チャンバー内で4%イソフルランにさらし、動きが止まるまで待ちます。続いてマウスをヒートパッドの上に配置し、4%イソフルランをさらに1分間投与します。

1分後、イソフルランの投与率を1.5%に変更します。次に、足指をつまんでマウスが十分に麻酔されているか確認し、問題がなければ、眼球にダファンエタノールを塗布します。耳と眼の間を1cm切開して手術を開始します。皮膚を剥離し、側頭筋を同定します。

次に、高周波発生器の機能を凝固に、モードをバイポーラに、出力を 12 watts に設定し、鉗子を取り付けます。準備として、露出した側頭筋に生理食塩水を一滴滴下します。その後、電気凝固鉗子を用いて、側頭筋の先端部および遠位部を頭蓋骨から剥離します。

これにより、筋肉フラップが緩んだ状態になります。次に、透明な頭蓋骨の下にある中大脳動脈（MCA）を確認します。これは側頭領域の吻側、眼窩後静脈洞の背側に位置しています。

ドリルを用いて、この動脈の直上の骨が薄くなり、貫通するまで削ります。穿孔中は生理食塩水を用いて頭蓋骨を湿らせた状態に保ってください。次に、非常に精密なピンセットを用いて慎重に骨を取り除き、MCA分枝を露出させます。

高周波発生装置を7Wに設定します。次に、電気凝固鉗子で動脈を軽く触れるようにし、把持せずに凝固させます。動脈の中大脳動脈（MCA）分岐部の近位側と遠位側の両方を凝固させます。MCAに分岐がない解剖学的変異がある場合は、可能な限り近位側で、凝固後に約1mmの間隔を空けて2か所を凝固させます。

30秒間待機した後、鈍端鉗子で動脈にそっと触れます。次に、筋肉を元の位置に戻して穿孔部を覆います。創部を縫合し、動物を32°Cに設定した保温箱に入れ、麻酔から回復させてからケージに戻します。

一般的に、動物が麻酔から回復するまでには5〜10分かかります。シリンダーテストでは、一方の肢をもう一方よりも優先して使用しているかを確認します。動物を、直角に配置された2枚の鏡に囲まれた透明なアクリルガラス製シリンダーに入れます。

シリンダーの反対側にある2枚の鏡の頂点に向かい合わせに動物を5分間ビデオ撮影します。各試行後、シリンダーとテーブルトップを60% ethanolで拭き取ります。その後、フレームごとの解析を行います。

完全に立ち上がった状態で、4肢のうち1肢がシリンダーに接触した回数と、4肢のうち1肢で着地した回数をカウントしてアッセイをスコア付けします。完全に立ち上がった回数をスコア付けした後、試験あたりの凍結切片につき、少なくとも20回の1肢による接触を確認します。脳を20 µm厚の切片に連続的に切断し、切断間隔は400 µmとします。切片をスライドガラスに回収し、-20 °Cで保存します。

この切片作成プロトコルを用いることで、1つの脳から得られた梗塞領域を含むすべての切片を1枚のスライドに配置することが可能です。標準的なクリスタルバイオレット染色プロトコルを用いて切片を染色し、各脳切片における梗塞組織の領域を明確にします。その後、スライドを封入し、スキャンして、Swanson法を用いて浮腫の解析を行います。

MCA閉塞術による矯正死亡率は5%未満であり、主な原因はくも膜下出血または麻酔不全であった。観察期間中の死亡例はなかった。PA利用のための本解析では、脳卒中誘発後にシリンダーテストを用いて非対称性を測定し、MCA閉塞前のベースライン値と比較した。その結果、24時間後に有意な肢の非対称性が検出され、それは脳卒中後1週間の間に部分的に回復した。

クリスタルバイオレット染色による脳梗塞の誘導および評価の結果、平均梗塞体積は15.4 cubic millimetersであり、これは脳半球の約12%に相当した。本モデルの標準偏差は非常に低く、さらに梗塞部位のばらつきも最小限であった。

適切に実施すれば、この操作は10分以内に完了させることができます。実演したシリンダーテストやクリスタルバイオレット染色以外にも、確立された他の行動テストや組織学的手法を用いることで、結果をさらに詳細に特性評価し、特定の研究課題に取り組むことが可能です。このビデオを視聴することで、マウスにおける永続的な遠位MCA閉塞の手法について十分に理解できたはずです。

本手法の再現性を維持するために、標準作業手順書（SOP）の使用と詳細な記録を強く推奨します。