Name: フォーカス形成：細胞ベースのアッセイ遺伝子の発癌性を決定するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶフォーカス形成アッセイを用いたマウス線維芽細胞における遺伝子の発癌性評価法。レトロウイルスベクター導入と結晶紫染色により細胞変形を定量化し、がん研究におけるオncogeneスクリーニングに有用です。

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この作品は、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラム（ED）からの助成金によってサポートされていました。 AAは国立がん研究所、国立科学財団からの学部賞によって部分的にサポートされていました。

1.ウイルスベクターを作る目的の遺伝子、ならびに陽性および陰性対照のためのコード配列は、従来のクローニング法（PCR増幅、制限消化およびライゲーション）によってpBABEpuroに挿入される。 BamHIでSnaBIで、EcoRIおよびSalIで：DNAを挿入することができるベクター上の4つの制限部位がある。 <ol><li> QIAGENプラスミドミディキットを使用してコンピテント細胞からトランスフェクショングレードのプラスミドDNAを準備します。 </li><li> NanoDrop2000分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。 </li></ol> 2.レトロウイルス生産のPlat-Eパッケージング細胞株は、NIH 3T3細胞に目的のcDNAを送達するエコトロピックレトロウイルスを産生するために使用される。 <ol><li>凍結細胞からのPlat-Eの文化の確立<ol><li>すぐに37℃の水浴中でのPlat-E細胞を解凍し、15mlのコニカルチューブに移す。ゆっくりとのPlat-E培地9ml（デュを追加lbecco改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FBS）+ペニシリン及びストレプトマイシン）。 </li><li> 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。 </li><li>再懸濁のPlat-E培地及び10cmの培養皿に移し、10 mlの細胞。 </li><li>それらは80〜90％コンフルエント（約2日）になるまで37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートする。 </li></ol></li><li>セル分割<ol><li>メディアを吸引除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。 </li><li> 0.05％トリプシンEDTAの2ミリリットルを加え、室温で1分間インキュベートする。 </li><li>指タッピングによって細胞を剥離、ぷらっと-E培地10mlを追加し、15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。 </li><li>ぷらっと-E培地10mlで細胞を再懸濁し、1から新しい料理でそれらをシード：4-1：6の希釈。 </li></ol></li><li> PLAT-Eシードおよびトランスフェクション<ol><li>シード2×10 6任意の抗生物質を含まないのPlat-E培地を用いて10cmの培養皿当たり細胞。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をO / Nでインキュベートする。 </li><li>翌日、1.5mlマイクロチューブにのOpti-MEM300μlのを転送する。 </li><li>のOpti-MEMでプリペアチューブに、ポリエチレンイミンの27μL（PEI）、費用対効果の高いトランスフェクション試薬12を追加します。指タッピングにより穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 、のOpti-MEM / PEIチューブにトランスフェクショングレードのプラスミドDNAの9μgのを追加し、ボルテックスにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートする。 </li><li>追加DNA / PEIのPlat-E皿に、37℃でO / Nインキュベート複雑なワイズドロップ、5％のCO 2。 </li><li>翌日、トランスフェクション試薬を含む培地を吸引し、（抗生物質を含まない）新鮮なのPlat-E培地10mlを追加します。 </li><li>インキュベーターにセルを返します。 </li></ol></li></ol> 3. NIH 3T3細胞と感染<ol><li> NIHの確立3T3文化や播種<ol><li>すぐに37℃の水浴中でNIH 3T3細胞を解凍し、15mlチューブに移す。ゆっくりとNIH 3T3培地（DMEM + 10％FBS）の9ミリリットルを追加します。 </li><li> 180 xでのチューブを遠心 gで5分間、上清を捨てる。 </li><li> 10cmの培養皿にNIH 3T3媒体と転送10mlで細胞を再懸濁。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートする。これは、自発的な変換（および病巣形成の、したがって基礎レベル）の周波数として文化がコンフルエントに達すると増加、NIH 3T3細胞は常にunderconfluent（百分の50から60）を保持していることが非常に重要です。 </li><li>シード3×10 10 cmディッシュあたり5個の細胞と、翌日感染のためにO / Nインキュベートする。 </li></ol></li><li>感染<ol><li>孔径0.45μmのナイロン膜フィルターを介して濾過する10mlの使い捨てシリンジを使用し、そして15mlにそれを転送することによってのPlat-E皿からレトロウイルス上清を収穫チューブ。 </li><li> （抗生物質を含まない）を細胞に新鮮なのPlat-E培地10mlを追加し、インキュベーターに戻す。 </li><li>感染していることがNIH 3T3細胞ディッシュから培地を吸引し、ウイルス含有濾過した上清の5の正規NIH 3T3培地1mlと5ミリリットルを追加します。 </li><li> 610μg/ mlの濃度で、皿にポリブレンを追加します。 </li><li> 37℃、5％CO 2で細胞をO / Nでインキュベートする。 </li><li>感染の第二ラウンドのために3.2.5 - 次の日、繰り返して3.2.1を繰り返します。 </li><li>定期的なNIH 3T3培地でウイルス含有培地を交換してください。 </li><li> NIH 3T3細胞は、必要に応じて培地を交換、2-3週間成長できるようにします。レプリカプレートから全細胞溶解物に従来のタンパク質電気泳動およびイムノブロットにより、目的のタンパク質の発現を確認してください。 </li></ol></li></ol> 4.染色および定量<ol><li>クリスタルバイオレット染色<ol><li> NIH 3T3培地を吸引し、食器を置く氷の上で。 </li><li>氷冷PBSで2回皿を洗う。 </li><li> 10分間氷冷メタノールで細胞を固定します。 </li><li>氷から皿を外し、メタノールを吸引し、25％のメタノール（RT）で行われた、0.5％クリスタルバイオレット溶液の3ミリリットルを追加します。 </li><li> RTで5分間皿をインキュベートする。 </li><li>クリスタルバイオレット溶液を吸引し、色がリンスに外れなくなるまで注意深くのMilli-Q H 2 Oとの皿をすすぐ。 </li><li>料理はベンチトップ（発見）にO / Nを乾燥することができます。 </li></ol></li><li>病巣の定量<ol><li>料理が乾燥したら、プレート上の細胞の暗色コレクションを測定するために定規を使用しています。として、直径5ミリメートルよりも大きくされているもののみをカウント &quot;巣&quot;を病巣の数を記録し、対照と比較して平均値と有意性を計算。 </li></ol></li></ol>

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<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

FFAは、in vitroでの悪性形質転換を評価するための迅速かつ容易な方法を提供する。これは、候補遺伝子の比較的多数のスクリーニングに適用され、その控えめな技術的要件は、費用対効果を高める。さらに、2つ以上の遺伝子を共発現させることができる組み合わせの腫瘍形成能を評価するために（時には「協力」アッセイと呼ばれる）。このアッセイの利点は、その単純な手法、定量化の容易さと、その比較的短いターンアラウンドタイムに依存​​している。それは、すべてのインビトロアッセイの限界をもたらすないことが強調されなければならない。アッセイは、癌細胞の一つの表現型特性を測定することにより、発癌性形質転換を評価する、すなわち、それらの能力は、培養皿で単層を越えて成長する。陰性の結果は、したがって、この特定のphenotypを促進することなく、形質転換を誘導することができる特定の癌遺伝子として、慎重に解釈されるべきであるeまたは別の遺伝子（ すなわち 、協力は、上述した）との共発現が必要な場合があります。この場合には、例えば、軟寒天アッセイにより増殖速度の決定及び血清要件および/ ​​または足場非依存性増殖...

腫瘍細胞は、遺伝子発現のパターンの形態学的および増殖性の変化にエピゲノミクスに、変化の広い範囲によってそれらの正常な対応物と区別することができる。後者の中では、、、接触の損失（密度）阻害を血清への依存を軽減足場非依存性増殖の取得と、最終的には、動物に注射した場合に腫瘍を形成する能力は、悪性形質転換3の有効、測定可能な指標である。 in vitroおよびin vivoアッセイにおけるいくつかの細胞の形質転換のために開発されてきた。 インビトロアッセイは、（成長速度、飽和密度）及び増殖因子（低血清成長）、培養形態（フォーカス形成アッセイ）の変化を識別し、測定時に培養ダイナミクスを目指すまたは要件アンカレッジ（ソフトアガーでの成長）。細胞型の悪性の性質を決定するためのゴールドスタンダードは、実験動物における腫瘍形成（異種移​​植片）のままである。しかし、T彼は、コストとのインビボ研究の長さは、常に候補癌遺伝子の最初の検証ステップまたはスクリーニング、それらに正当ことはありません。何のin vitroアッセイは、遺伝子の発癌性の明確な評価を提供していないが、これらは、生体内の研究で未来を絞り込むことが発癌性への洞察を提供します。 インビトロでの発癌性を評価するための最も広く使用されているシステムの一つはフォーカス形成アッセイ2である。このアプローチは、NIH 3T3マウス線維芽細胞、強く接触阻害を示し、非形質転換細胞株の使用に依存している。密度依存性増殖の損失の癌遺伝子の過剰発現。形質転換された細胞は、次に簡単に非形質転換細胞のバックグラウンド単層に対して可視化「病巣」を形成する、複数の層で成長することができる。フォーカス形成アッセイは、その後、コンタクトInhibが喪失によって証明されるように、悪性形質転換を誘導する候補癌遺伝子の能力を測定する測定可能な表現型としてition。 FFAは、プロテインキナーゼ（ 例えば 、Srcの4、BRAF 5）の過剰発現により形質転換を評価するために使用されている、転写因子（ 例えば 、N-mycの6）、Gタンパク質共役受容体（ 例えば 、P2RY8 7）およびGTPアーゼ（ 例えばとりわけラス1）。このアッセイの相対的な容易さは、遺伝子の過剰発現は、インビトロで NIH 3T3マウス線維芽細胞を形質転換するのに十分であるか否かを迅速かつ視覚的に明確な答えを提供する適切な選択肢となる。 FFAは、このプロトコルに記載のレトロウイルスを産生するウイルスパッケージングタンパク質を提供するのPlat-Eパッケージング細胞株8、およびレトロウイルスベクターpBABEpuro 9（Addgeneプラスミド1764）を使用する。目的の遺伝子を含むpBABEpuro構築物でトランスフェクションした後、のPlat-E細胞株は、NIH 3T3細胞を感染させるために使用することができるエコトロピックレトロウイルスを産生する。 T遺伝子送達の彼のウイルスの方法は、従来の化学的なトランスフェクション法よりも効率的であり、それは持続的に遺伝子10を表現する方法を提供しています。 NIH 3T3細胞のゲノムに組み込まれると、目的の遺伝子の過剰発現は、ウイルスの長い末端反復（LTR）プロモーター11によって駆動される。この定数式は、NIH 3T3細胞に、病巣の形成によって測定されるように、目的の遺伝子は、発癌活性を有するかどうかを決定するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro ベクター</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>クローニングベクター</td></tr><tr><td>Platinum-E レトロウイルスパッケージング細胞株, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>RV-101</td><td>ウイルス生産用細胞株</td></tr><tr><td>NIH 3T3 細胞株 マウス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>焦点形成アッセイ用細胞株</td></tr><tr><td>10 ml BD Luer-Lok チップシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>ウイルス産生試薬</td></tr><tr><td>0.45 &mu;m Puradisc シリンジフィルター</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>ウイルス産生試薬</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td>細胞<td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>ポリブレン感染/トランスフェクション試薬</td><td>EMD ミリポア</td><td>TR-1003-G</td><td>細胞トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C581-25</td><td>細胞染色試薬</td></tr><tr><td>プラスプラスプラスミディキット</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td>プラス<td>ミド精製</td></tr><tr><td>BDファルコン組織培養皿</td><td>BDバイオサイエンス353003</td><td></td><td>細胞培養用品</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td>細胞<td>培養培地</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>細胞培養用品</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清培地</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>細胞培養培地</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>細胞培養培地</td></tr></tbody></table>

フォーカス形成：細胞ベースのアッセイ遺伝子の発癌性を決定するために、

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

悪性形質転換は、通常、増殖の増加、接触阻害の喪失、足場に依存しない増殖能の獲得、および実験動物における腫瘍形成能力と関連しています1。NIH 3T3細胞では、Rasシグナル伝達経路がこれらのイベントの多くを引き起こすことが知られており、これはRas形質転換として知られています。NIH 3T3細胞に過剰発現遺伝子を導入すると、形態学的形質転換と接触阻害の喪失が促進される可能性があり、これは目的の遺伝子の発がん性の可能性を決定するのに役立ちます。がん遺伝子の形質転換の可能性の1つの側面を評価するための簡単な方法を提供するアッセイは、Focus Formation Assay(FFA)2です。NIH 3T3細胞が培養で正常に分裂すると、コンフルエントな単層に到達するまで分裂します。しかし、過剰発現したがん遺伝子の存在下では、これらの細胞は、結晶紫色またはヘマ3染色によって視覚化および定量化できる高密度の多層病巣1で増殖し始める可能性があります。この記事では、目的の遺伝子をNIH 3T3細胞にレトロウイルス形で形質導入するFFAプロトコルと、染色による病巣数を定量する方法について説明します。レトロウイルス形質導入は、トランスフェクションよりも効率的な遺伝子導入方法を提供し、エコトロピックマウスレトロウイルスの使用は、潜在的なヒトがん遺伝子を扱う際のバイオセーフティ制御を提供します。

MXD3は、MYC / MAX / MADネットワークのメンバーである塩基性ヘリックス - ループ - ヘリックスロイシンジッパー（bHLHZ）転写因子である。それは、MADファミリー13-15の異型メンバーであり、発癌16,17に関与することが報告されている。 pBABEpuro（陰性対照）およびMYC（陽性対照）と比較した場合、MXD3を過剰発現させたNIH 3T3料理が著しく少ない病巣（ 図1A）を有していた。 図1Bのデータは有意性を決定するために複数の実験から収集した。 それはMYC（既知の癌遺伝子）に同様の活性を持っているのでMXD3の発癌性を決定する際の初期の関心があった。しかし、このアッセイからの結果はMXD3は癌遺伝子として機能しないことを示唆している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_uplo...

フォーカス形成アッセイは、候補癌遺伝子の形質転換能を評価するための簡単​​な方法を提供する。

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

この手順の総合的な目的は、レトロウイルスを用いてマウス線維芽細胞株でフォーカス形成アッセイを行い、遺伝子の発がん能を判定することです。まず、目的の遺伝子の配列をレトロウイルスベクターにクローニングします。次に、そのウイルスベクターとPLA-Eパッケージング細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製します。次に、目的遺伝子の形質転換能を評価するため、レトロウイルスを用いてNIH 3T3マウス線維芽細胞に感染させます。最終ステップとして、NIH 3T3細胞を2〜3週間分裂させた後、クリスタルバイオレット染色を行い、形成されたフォーカス数を定量します。最終的に、このフォーカス形成アッセイにより、目的遺伝子の過剰発現がマウス線維芽細胞において密度非依存性増殖を誘導するのに十分であるかを確認します。本手法は、遺伝子の腫瘍形成能のスクリーニングなど、がん生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。まず、テキストプロトコルに従ってウイルスベクターを作製します。次に、凍結保存されたplat E細胞を37 °Cの温浴で速やかに融解し、15 mLコニカルチューブに移すことで、plat E細胞の培養を確立します。15 mLコニカルチューブにPLA E培地9 mLをゆっくりと加えます。チューブを180 ×gで5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞を10 mLのPLA E培地で再懸濁し、10 cm培養皿に移します。その後、細胞が80～90%Confluentになるまで、37 °C、5%CO2インキュベーター内で培養します。細胞の継代（細胞分割）を行うため、まず培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄します。次に、0.05%tripsin EDTAを2 mL加え、室温で1分間インキュベートした後、フィンガータッピングにより細胞を剥離させます。その後、plat E mediumを10 mL加え、細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。前と同様にチューブを遠心分離し、10 millilitersのplat E mediumで細胞を再懸濁します。次に、抗生物質を含まないplat E mediumを用いて、10 centimeter培養ディッシュあたり2 million cellsを播種し、一晩インキュベートします。翌日、optimum 300 microlitersを1.5 milliliterマイクロチューブに移します。準備したOptum入りのチューブに、ポリエチレンアミンを27 µL加えます。指で軽く叩いて混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。次に、トランスフェクショングレードのプラスミドDNAを9 µgチューブに加え、ボルテックスで静かに混合し、室温で15分間インキュベートします。次に、混合液を plat E ディッシュに滴下し、一晩インキュベートします。翌日、トランスフェクション試薬を含む培地を吸引除去し、10 milliliters の新鮮な plat E 培地を加えてから、細胞をインキュベーターに戻して NIH 3T3 の培養を確立します。まず、細胞を 37 °C のウォーターバスで迅速に解凍し、15 milliliter チューブに移します。NIH 3T3培地 9 mLを細胞にゆっくりと加え、チューブを180 ×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、細胞をNIH 3T3培地 10 mLで再懸濁し、10 cm培養皿に移します。細胞を37 °C、5% CO2インキュベーター内で培養し、自発的な形質転換の頻度を高めるため、コンフルエントになる前に継代します。培養物がコンフルエントに達したら、10 cmディッシュあたり3 × 10⁵個のT3細胞を播種し、翌日の感染に向けて一晩インキュベートします。翌日、10 mL使い捨てシリンジを用いてプラチネディッシュからレトロウイルス上清を回収し、孔径0.45 µmのナイロンメンブレンフィルターでろ過した後、15 mLチューブに移します。細胞に10 mLの新鮮なプラチネ培地を加え、インキュベーターに戻します。次に、感染させるNIH 3T3細胞ディッシュから培地を吸引し、通常のNIH 3T3培地 5 mLと、ウイルスを含むろ過上清 5 mLを加えます。続いて、ポリブレインをディッシュに加えます。最終濃度が 6 µg/mL になるように調整してください。細胞を一晩インキュベートした後、感染ステップを繰り返し、2回目の感染を行います。感染後、ウイルス含有培地を通常のIH3T3培地と交換します。クリスタルバイオレット染色を行うまで、必要に応じて培地を交換しながら、IH3T3細胞を2〜3日間増殖させます。NIH 3T3培地を吸引し、ディッシュを氷上に置きます。氷冷したPBSでディッシュを2回洗浄します。氷冷したメタノールを用いて、細胞を10分間固定します。その後、ディッシュを氷から取り出し、メタノールを吸引除去します。25%メタノールで調製した0.5%クリスタルバイオレット溶液を3 mL加え、室温で5分間インキュベートします。インキュベート後、クリスタルバイオレット溶液を吸引除去し、洗浄液に色が出なくなるまでMilli Q水で慎重にディッシュを洗浄します。ディッシュをベンチトップで蓋をせずに一晩乾燥させます。ディッシュが乾燥したら、定規を使用してフォーカスを測定し、直径が5 mm以上のものの数を数えて記録します。MXD3は、MADファミリーの非典型的メンバーである塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス-ロイシンジッパー転写因子であり、陰性対照および陽性対照と比較して、がん化に関与していることが報告されています。MXD3を過剰発現させたNIH 3T3細胞のディッシュでは、フォーカス形成が有意に減少しました。有意性を判断するために複数の実験からデータを収集しましたが、このアッセイにおいても同様の傾向が観察されました。これらの結果は、本手順に従った場合、MXD3がオンコジーン（癌遺伝子）として機能しないことを示唆しています。関心のある遺伝子が腫瘍形成の病態に果たす役割を評価するために、遺伝子組み合わせを用いたフォーカス形成アッセイ、軟寒天培地での増殖能試験、および細胞周期解析などの他の手法を用いて、さらなる疑問を検討することができる。

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

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