フォーカス形成：細胞ベースのアッセイ遺伝子の発癌性を決定するために、

この手順の全体的な目標は、レトロウイルスを使用して遺伝子の発がん性を決定するために、マウス線維芽細胞株でフォーカス形成アッセイを実行することです。これは、まず目的の遺伝子の配列をレトロウイルスベクターにクローニングすることによって達成されます。第2のステップは、ウイルスベクターとPLA eパッケージング細胞を使用してレトロウイルス粒子を作製することです。

次に、レトロウイルスを使用してNIH three T threeマウス線維芽細胞に感染させ、目的遺伝子の形質転換の可能性を評価します。最後のステップは、NIHの3つのT細胞を2〜3週間分裂させ、続いて結晶紫色染色して形成された病巣の数を定量化することです。最終的に、フォーカス形成アッセイは、目的の遺伝子の過剰発現がマウス線維芽細胞の密度に依存しない増殖を誘導するのに十分であるかどうかを示すために使用されます。

この方法は、遺伝子の発がん性の可能性のスクリーニングなど、がん生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、テキストプロトコルに記載されているようにウイルスベクターを作成します。次に、プラットE細胞を摂氏37度の水浴で迅速に解凍し、15ミリリットルの円錐管に移すことにより、凍結細胞からプラットE培養を確立します。

15ミリリットルの円錐管に9ミリリットルのPLAEミディアムをゆっくりと加えます。チューブをGの180倍で5分間遠心分離し、上清を捨てます。10ミリリットルのプラットE培地で細胞を再懸濁し、10cmの培養皿に移します。

次に、細胞を摂氏37度の5%CO2インキュベーターで、細胞が80〜90%コンフルエントになるまでインキュベートします。まず培地を吸引して細胞分裂を行い、次にPBSで細胞を1回洗浄した後、0.05%tripsin EDTAを2ミリリットル加え、室温で1分間インキュベートし、指で軽くたたいて細胞を剥離します。次に、10ミリリットルのプラットE培地を加え、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。

前と同じようにチューブを遠心分離し、10ミリリットルのプラットE培地で細胞を再懸濁します。次に、抗生物質を一切使用せずにプラットE培地を使用して10センチメートル培養皿あたり200万個の細胞を培養し、細胞を一晩インキュベートします。翌日、300マイクロリットルのオプティマルを1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。

Optumで準備したチューブに27マイクロリットルのポリエチレンアミンを追加します。指で軽く叩いて穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、ボルテックスにより穏やかに混合したチューブに9μgのトランスフェクショングレードのプラスミドDNAを加え、室温で15分間インキュベートします。

次に、混合物をプラットE皿に滴下して、一晩インキュベートします。翌日、トランスフェクション試薬を含む培地を吸引し、10ミリリットルの新鮮なプラットE培地を加えてから、細胞をインキュベーターに戻してNIH three T three培養を確立します。まず、細胞を摂氏37度の水浴ですばやく解凍し、15ミリリットルのチューブに移します。

9ミリリットルのNIH 3、T 3培地を細胞にゆっくりと加え、チューブをGの180倍で5分間遠心分離し、スナットを廃棄します。次に、10ミリリットルのNIH three、T three培地で細胞を再懸濁し、10cmの培養皿に移します。摂氏37度の5%CO2インキュベーターで細胞をインキュベートし、自然形質転換の頻度が増加するにつれて細胞をコンフルエントに保ちます。

培養物が流暢さに達すると、種子を10〜5番目のnihに3回成長させたら、10センチメートル皿あたり3つのT細胞を3個培養し、翌日の感染のために一晩インキュベートします。翌日、10ミリリットルの使い捨て注射器を使用してプラットE皿からレトロウイルス上清を採取し、0.45ミクロンの孔径ナイロンメンブレンフィルターでろ過し、15ミリリットルのチューブに移します。細胞をインキュベーターに戻す前に、10ミリリットルの新鮮なplat E培地を細胞に加えます。

次に、感染させるNIH 3 T 3細胞皿から培地を吸引し、通常のNI H 3、T 3培地5ミリリットル、およびろ過された上清を含むウイルス5ミリリットルを追加します。次に、皿にポリブレインを加えます。ミリリットルあたり6マイクログラムの濃度を追加します。

細胞を一晩インキュベートしてから、2回目の感染のために感染手順を繰り返します。感染後、ウイルスを差し替え、通常のIH三T三培地に培地を封入する。IH 3 T 3細胞を2〜3細胞増殖させ、クリスタルバイオレット染色に必要な培地を交換します。

NIH three T three mediumを吸引し、皿を氷の上に置きます。氷冷したPBSで皿を2回洗います。細胞を氷冷メタノールで10分間固定します。

次に、皿を氷から取り出し、メタノールを吸引します。25%メタノールで作った0.5%クリスタルバイオレット溶液を3ミリリットル加え、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、クリスタルバイオレット溶液を吸引し、すすぎで色が落ちなくなるまでMilli Q水で皿を慎重にすすい

皿を蓋をせずにベンチトップで一晩乾かします。皿が乾いたら、定規を使用して焦点を測定し、直径5ミリメートルを超えるものを数えます。MXD 3という数字は、MADファミリーの非定型メンバーである基本的なヘリックスループヘリックスロイシンジッパー転写因子であり、ネガティブコントロールやポジティブコントロールと比較すると発がんに関与することが報告されています。

MXD 3が過剰発現したNIH three T three Dish は、病巣が有意に少なかった。データは、有意性を決定するために複数の実験から収集され、このアッセイからも同じ傾向が観察されました。結果は、この手順の後、MXD 3が癌遺伝子として機能しないことを示唆しています。

遺伝子の組み合わせによるフォーカス形成アッセイ、ソフトオーガー増殖の増殖、細胞周期解析などの他の方法は、追加の質問に答えるために実行できます がん発生の病因における関心のある遺伝子の役割を評価するため。