マウス皮膚や毛包パターニングおよび感覚軸索形態の解析への応用のフラットマウントイメージング

この手順の全体的な目的は、サンプルを物理的に切断することなく、毛包や神経終末などの皮膚構造を完全に可視化することです。これはまず、背中、後肢、尾など、さまざまな身体部位から皮膚を採取することによって達成されます。次のステップでは、皮膚サンプルを平坦化し、洗浄します。

次に、皮膚サンプルを適切な方法で固定します。最終ステップとして、皮膚サンプルの免疫染色または組織化学染色を行います。最終的に、解剖顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いてイメージングを行い、さまざまな皮膚構造の形態を可視化します。

表皮ホルモンマウント標本作製などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、身体のあらゆる部位の皮膚に適用可能であり、真皮から表皮を分離する必要がない点にあります。この方法は、細胞極性の研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。皮膚の二次元的な幾何学的構造と毛包の独特な配置は、このプロセスを研究するための理想的な系であるため、本手法は細胞極性への洞察を与えるだけでなく、個々の軸上の形態の直接的な可視化に基づく体性感覚ニューロン型の定義など、皮膚発達の他の側面を研究するためにも適用可能です。

足や尾などの一部の部位からの皮膚剥離は習得が困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。皮膚を完全に平坦にし、しわや過剰な伸展を避けることが重要です。本デモンストレーションでは、イソフルラン吸入により安楽死させたP3マウスから背側皮膚を採取します。メスを使用して、尾の付け根から各側腹部に沿って水平に切開し、各肢の付け根の背側を通り、耳の外側を経て鼻端で終わるように切開します。

手袋を着用した指で皮膚を保持し、鉗子で皮膚を挟まないように注意しながら、後方から前方に向かって、下層組織から皮膚をそっと剥離します。まず耳の高さの皮膚を剥離する場合、鋏で耳を切り取り、この部位は皮膚が裂けやすいため、特にゆっくりと作業を進めてください。ここから先は、皮膚の内側を上に向けて配置します。

皮膚の周囲に約20本の昆虫ピンを等間隔に刺し、S Guardに固定します。この際、皮膚を伸ばしすぎないようにしてください。その後、角度付きまたは湾曲したピンセットを用いて、10から20 millilitersのPBSで皮膚を覆います。

皮膚に付着している脂肪および結合組織を剥離します。ピンセットが皮膚を貫通するリスクを最小限に抑えるため、ピンセットの先端を水平に向けてください。綿棒で皮膚表面を優しく転がし、皮膚の下に溜まった気泡を押し出します。

次のステップは、ピン皮膚を固定することです。皮膚をメラニンイメージングまたはアルカリホスファターゼ組織化学染色に使用する場合は、10 cmシャーレあたり、調製直後の4% PFA-PBSまたは10%緩衝ホルマリンを20 mL加えます。免疫染色またはトランスジェニックケラチンKRT 17 GFPの可視化に使用する場合は、10 cmシャーレあたり、調製直後の2% PFA-PBSを20 mL加えます。低温室で一晩緩やかに回転させ、翌日にPBSで10分以上洗浄してください。

アルカリホスファターゼ組織化学染色の手順は、このビデオでは実演しません。メラニンイメージングについては、室温で緩やかに水平回転させながら、各ステップ1日ずつ、段階的なエタノール系列を用いて皮膚を脱水します。3日後、100% ethanolに浸した状態で、脱水した皮膚から残存する結合組織を取り除きます。

昆虫ピンを取り除き、皮膚を直径10 centimeterのガラスシャーレに移します。この手順を成功させるには、皮膚サンプルを完全な状態で採取し、完全に平らにする必要があります。皮膚の上に2枚のガラス顕微鏡スライドを置き、皮膚を平らにして丸まるのを防ぎます。

ベンゾイル安息香酸ベンゾイルおよびベンジルアルコール（BBBA）を20 milliliters加え、その後数時間かけて組織を急速に硬化させます。スライドを皮膚から数秒間持ち上げ、BBBAが皮膚全体に行き渡るようにします。毛包パターニング解析用の足皮膚は、通常P1からP8の動物から採取します。安楽死させた後、足首の関節より上の部分で足を切り取り、足底の腹側表面に沿って直線的に1回切開します。

近位から遠位に向かって、皮膚を下の組織からそっと剥離させます。指の部分を切り離して皮膚を解放し、内側を上にして皮膚を固定台にピンで固定します。足の部分には結合組織がほとんどありません。

皮膚トランスジェニック。KRT 17 GFP皮膚のメラニンイメージングの準備が整いました。背側皮膚について先に示した方法で皮膚の固定および処理を行います。P 21の個体を安楽死させた後、除毛剤を塗り込んで毛を除去します。

手袋を着用した指と親指で皮膚表面にゲルを塗り、10分間待機します。皮膚表面を水道水で洗浄します。その後、前述の方法に従って、足の皮膚を解剖し、Sガードにピンで固定します。

室温で1% PFA-PBSを用いて30分間固定し、その後PBSで洗浄します。尾部皮膚を調製するには、まず尾の付け根に円周状の切開を入れ、次に腹側を伝って尾の長さに沿って縦に切り込みを入れます。一本のピンセットで尾骨または結合組織をしっかりと掴み、もう一本のピンセットで皮膚を掴み、先端から尾部皮膚を剥がします。

メラニン分布および毛包の配向を解析するため、尾部の皮膚をSILガードにピンで固定します。固定前に行う皮脂腺の解析に向けて、背部皮膚で示した方法に従って皮膚を固定・処理します。尾部の皮膚を約0.5～1 cmの長さのセグメントに連続的に切断し、5 mM EDTA含有PBS中で37 °Cにて一晩インキュベートします。

翌日、真皮と表皮の接着を弱めるため、表皮を真皮からゆっくりと剥がします。表皮の界面をSガードでピン留めし、4% PFA-PBS中で室温で1時間固定します。その後、表皮をPBSで洗浄し、プロトコルの本文に従ってオイルレッドOで染色します。

解剖顕微鏡を用いて、BBBAに浸され、ガラススライドで押しつぶされた状態でガラスシャーレに入っている足背または尾の皮膚を撮影します。この手法により、顕微鏡へのBBBA汚染を最小限に抑えることができます。視野全体の光強度の空間的な変動を最小限にするため、シャーレを下から照明してください。

ガラス皿を実体顕微鏡の標準的な作業面から約10 cmの高さまで上げ、光源の上にプラスチック製またはガラス製の拡散板を置きます。イメージングが完了したら、皮膚を100%エタノールに戻し、−20 °Cで長期保存してください。アルカリホスファターゼ染色した皮膚をイメージング用に準備するには、小型タンパク質ゲルに使用されるタイプの2枚のガラスプレートの間に配置します。

プレートと皮膚の間に気泡が入らないように注意してください。余分なBBBAはペーパータオルで丁寧に拭き取ります。このプレート・皮膚・プレートのサンドイッチ構造を顕微鏡ステージ上に置いてください。

10倍の対物レンズを用い、明視野またはDIC照明で、Zステップを2µmまたは5µmに設定して観察します。電動XYステージを使用してXY画像のモンタージュを撮影し、それらを繋ぎ合わせて単一の3次元グレースケールデータセットを作成します。その後、さまざまなソフトウェアパッケージを用いて、軸索樹状突起の半自動トレースを行います。

皮膚フラットマウントの明視野イメージングを用いることで、ここに追跡画像とともに示すような単一の皮膚感覚神経樹状突起をイメージングできます。また、明視野イメージングでは、メラニン色素沈着に基づく毛包パターンの可視化も可能です。これらの画像は、野生型およびFrizzled 6ノックアウトマウスのP1皮膚、およびFrizzled 6ノックアウトマウスのP7皮膚を示しています。

皮膚のフラットマウントの光学顕微鏡イメージングを用いることで、皮脂腺とその管状構造の幾何学的形状を定義することができます。Oil Red Oで可視化した皮膚において、frizzled sixノックアウトマウスの皮脂腺は、野生型の背足と比較して無秩序に配置されています。A GFPタグ付きケラチンKRT 17 GFPを発現し、Oil Red Oで染色した野生型およびfrizzled sixノックアウトマウスから採取した皮膚です。

Red O染色により、ノックアウト皮膚の中心に毛旋（ヘアワール）があることが明らかになりました。皮膚のフラットマウントの共焦点イメージングにより、KRT 17 GFPおよび抗GFP免疫染色で可視化した毛包と立毛筋の幾何学的構造を定義することも可能です。眼筋は抗平滑筋アクチン免疫染色により可視化しました。

メルケル細胞クラスターは、抗サイトケラチン8またはAM 1 43色素の取り込みによって視覚化され、その中心にある毛包はKRT 17 GFPによって視覚化されます。Frizzled 6ノックアウトのメルケル細胞クラスターは、前方に開いているのではなく、閉じた円を形成しています。一度習得すれば、適切に行えば解剖は約30分で完了し、数日から1週間以内にさまざまな染色の実施が可能です。このビデオを視聴することで、体のさまざまな部位から皮膚を採取する方法と、ホルモン形式でさまざまな皮膚構造を視覚化するための染色の方法について、十分に理解できるはずです。皮膚構造の高解像度な全層画像は、標準的な光学顕微鏡および共焦点顕微鏡を用いて収集できます。

パラホルムアルデヒドおよびBBBAを取り扱う際は、極めて危険であることに注意してください。これらの溶液は密閉容器に保管し、蒸気の吸入を最小限に抑え、皮膚への接触を避けてください。また、BBBAをプラスチックに接触させないでください。