超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け

本実験の全体的な目的は、酵母 Saccharomyces cei のエンドソーム区画を超微形態レベルで可視化することである。これは、酵母のスフェロプラストを調製し、正に帯電したナノ金粒子をエンドサイトーシスにより取り込ませることで達成される。第2段階として、試料を固定し、切片を作成して細胞の超薄凍結切片を得る。

次に、凍結切片を銀増感反応に供します。エンドサイトーシスされた正電荷のナノ金粒子を拡大・可視化することで、本手法の特異的な標識に基づいた、酵母のさまざまなエンドソームコンパートメントの形態を示す結果が得られます。切片のImmunoGold標識などの既存の手法と比較した本技法の主な利点は、電子顕微鏡試料では機能しないことが多い抗体に依存しない点にあります。

本手法は酵母 *Saccharomyces cerevisiae* のリソソーム系に関する知見を得るために有効ですが、他の酵母や哺乳類細胞などの他の真核生物モデルにも適用可能です。まず、スフェロプラストを調製する酵母を、翌日の実験計画に基づいて決定した適切な培地10 mL中で30 ℃にて一晩培養します。その後、600 nmにおける培養液の吸光度（OD 600）を測定し、同一の培養培地を用いて細胞をOD 600が0.2から0.4になるまで希釈します。

細胞を指数増殖期まで培養し、OD 600が1から2になったところで、OD 600換算で10相当の細胞を50 mLチューブに移し、2100 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを5 mLの100 mM PBSおよび10 mM DTTに再懸濁し、30 °Cで10分間インキュベートします。遠心分離により細胞を回収します。

上清を除去した後、1 molarのsorbitolと5 mgのlytic enzymeを含む5 mLの培地で細胞を懸濁させる。この混合物を30 °Cで30分間、緩やかに振盪しながらインキュベートする。細胞懸濁液を300 Gsで5分間遠心分離し、Sphero platsに相当するペレット分画を回収する。

上清を捨て、1 M sorbitolを含む氷冷した培地 960 µLでスフェロプラストを再懸濁します。この混合液を氷冷した2 mLマイクロ遠心チューブに移します。ナノゴールド取り込みの手順を開始するために、ピペットを使用して、スフェロプラストと正に帯電したナノゴールド粒子を穏やかに混合します。

40 µLの水で再懸濁します。混合物の最終容量を1 mLにしてください。得られた細胞懸濁液を氷上に15分間静置します。

懸濁液を室温に戻し、エンドサイトーシスによるナノゴールドの内部移行が行われるよう、規定時間インキュベートします。目的のナノゴールドの取り込みが完了したら、1 M sorbitolを含む2倍濃度の固定液1 mLを細胞懸濁液に加えて反応を停止させます。チューブを室温で30分間保持します。

PHE plastと懸濁液を均一に保つため、30分間のうちにマイクロ遠心チューブを手動で数回静かに転倒混和します。次に、1700 Gsで25秒間の遠心分離を2回行い、上清を除去した後、1 molar sorbitolを含む標準濃度の新鮮な固定液1 mLを添加します。低速回転ディスクを用いて、室温で2時間インキュベートします。その後、本手順を開始する前に記載されたテキストプロトコルに従って、細胞の処理および凍結切片作成を行います。シルバー増感キットをフリーザーから取り出し、37 °Cのインキュベーターで融解させます。融解したキットを、使用時まで暗室内に設置した24 °Cのベンチトップインキュベーターに入れておきます。

ヒートプレートを暗室に設置し、最終温度が24 degrees Celsiusになるまで温めます。ヒートプレートの上部をベンチコート表面プロテクターで覆い、光沢のある面を上に向けた状態でテープで固定します。表面プロテクターの上にパラフィルムを敷き、暗所でも視認できるように端を黒のマーカーで印付けします。

温度計をサーフェスプロテクターの上部にテープで固定します。加熱プレートの温度を監視しながら、温度を徐々に調整してください。24 °Cにならない場合は、2回蒸留水を入れた50 mLチューブを設置してください。

インキュベーター内で、37 °Cに予熱した二回蒸留水を小型ペトリ皿に満たします。凍結切片を載せた2枚のニッケルグリッドを、試料面を下にして水に30分間浸します。30分後、2枚目のペトリ皿に予熱した二回蒸留水を満たし、同じ2枚のニッケルグリッドをさらに30分間水に浸します。

加熱プレート上に固定したパラフィルムの上に、24 °Cの二回蒸留水を数滴滴下し、その上をグリッドの試料側を下にして通過させ、再度洗浄します。銀増感反応後の洗浄用に、パラフィルムの上にさらに9滴の二回蒸留水を用意しておいてください。手順のこの段階で、暗室内のすべての照明を消し、赤色灯を点灯させてください。

ただし、撮影上の理由により、ライトは点灯させたままにします。本デモンストレーションでは、24 °CのインキュベーターからシルバーエンハンスメントキットのA液およびB液を取り出します。1.5 mLマイクロ遠心チューブにA液を6滴、続いてB液を6滴加え、気泡の形成を避けながらガラスパステールピペットでよく混ぜ合わせます。その後、溶液をボルテックスで攪拌します。

溶液aおよびBを速やかに24°Cのインキュベーターに戻し、溶液Cを取り出します。AB混合液に溶液Cを6滴加します。再びパスツールピペットで混ぜた後、ボルテックスミキサーで撹拌しますが、気泡が入らないように注意してください。

この最終混合液はすぐに使用してください。清潔な非磁性ピンセットを用いて、パラフィルム上に液滴を置きます。その混合液の上にグリッドを配置します。

これは銀増幅反応です。実験で求める増幅度に応じて、グリッドを6～15分間浸漬させます。混合液からグリッドを取り出し、6滴の二回蒸留水を経由させて速やかに洗浄します。最後の3回の洗浄では、24°Cに設定したPerfil上の蒸留水を用いてください。

水1滴につき7分間、グリッドを浸漬させます。実際の実験を行う場合は、洗浄が完了したら照明を再び点灯させてください。その後、電子顕微鏡（EM）観察のために、ImmunoGold標識または膜染色によって結果を可視化します。

銀増感ナノゴールドを用いて、酵母の異なる種類のエンドソームコンパートメントを標識し、電子顕微鏡で可視化することができます。ナノゴールドを5分間取り込ませると、細胞膜および、エンドサイトーシス小胞と思われる単一小胞や、初期エンドソームである可能性が非常に高い管状構造などの初期エンドソームコンパートメントが標識されます。ナノゴールドを用いて30分間インキュベートすると、後期エンドソームまたはマルチベシキュラーボディが標識されます。

免疫電子顕微鏡法とこのナノ金・銀増幅プロトコルを組み合わせることによる分解能の高さは、示されているオルガネラの形態、特に多胞体内部の小胞の保存状態と質によって裏付けられています。銀増幅法を用いる前に、銀粒子のサイズと均一性の両方において最適なインキュベーション時間を決定するための予備実験を行う必要があります。本手順に従ってください。

特定のタンパク質が膜下コンパートメントのどの部位に局在しているかといった疑問に答えるため、免疫標識などの他の手法を用いることができます。