Name: 超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶ 酵母Saccharomyces cerevisiaeのエンドソーム系をナノゴールド粒子で標識し、電子顕微鏡で超微細構造を可視化する手法。この抗体非依頼性プロトコルは、細胞内輸送メカニズムの研究に有用です。

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著者らは、図の作成の支援のためにルネScriwanekに感謝します。 FRがエコー（700.59.003）、ALWオープンプログラム（821.02.017や822.02.014）、DFG-NWO協力（DN82-303）とZonMW VICI（016.130.606）の補助金によってサポートされています。

1。スフェロプラストの準備<ol><li>実験の設計によって決定された適切な培地10ml中で30℃で一晩酵母をインキュベートする。 </li><li>翌日、設計しない限り、光度計を用いて600nmで（OD 600）での培養物の光学密度を測定する0.2〜0.4のOD 600に同じ培養培地中で細胞を希釈し、指数増殖期にそれらを成長させる実験は、異なる条件を必要とします。培養がOD 1-2の600を持っている時に細胞が指数増殖期にある。 </li><li> 50mlチューブ中で5分間、3,500×gで遠心分離することによって細胞の10 OD 600当量を収集する。遠心分離の後、上清を捨てる。 </li><li> 100mMのPIPES（pH9.6）中の5mlの10mMジチオスレイトール、10分間30℃でインキュベートして細胞ペレットを再懸濁。 </li><li> 5分間3500×gで再び遠心分離して細胞を回収します。上清を捨てる。 </li><li>細胞を再懸濁Inは1 Mソルビトールおよび溶菌酵素5mgを含有する（実験の設計によって決定される）、そして穏やかに30分間振とうしながら30℃で混合物をインキュベートする培地5ml。 </li><li>スフェロプラストに対応するペレット分画を回収し、5分間300×gで細胞懸濁液を遠心分離する。上清を捨てる。 </li><li>氷冷たいメディアの960μlのフェロプラストを再懸濁し、1Mのソルビトールを含む（メディア実験の設計によって決定される）、アイス冷2 mlマイクロチューブに混合物を移す。 </li></ol> 2。ナノ金取り込み<ol><li>ピペットを使用して、静かに水40μlに再懸濁させ、正に帯電しナノゴールド粒子の4ナノモルでフェロプラストをミックス。混合物の最終容量を1mlとする必要がある。 </li><li> 15分間氷上で得られた細胞懸濁液を置きます。 </li><li>室温でサスペンションを転送し、Eによりナノゴールド内在化を可能にするために必要な時間のためにそれをインキュベートndocytosis。 注：15分の取り込みが全体エンドソームシステム（初期および後期エンドソーム）をマークすることを許可する一方、5分間の取り込みは、主に、細胞内小胞と早期エンドソーム区画のラベル付けにつながる。長いインキュベーション時間（30分以上）も、空胞を標識することを許可します。 NOTE：パルスチェイス標識実験は、この方法を行うことができない。 LEの分析のためにラベル付けする際にそのため、ナノゴールドもPMおよびinEEにあります。 </li></ol> 3。固定と分割<ol><li> 2倍濃度の固定液を1ml添加​​することにより、ナノゴールド取り込みを停止する[4％パラホルムアルデヒド（PFA）、0.1 M PHEM緩衝液中の0.4％グルタルアルデヒド（GA）（20mMのPIPES、50mMのHEPES、pH6.9の、20mMのEGTA、4のMgCl 2）]を細胞懸濁液に1Mソルビトールを含有する。室温でチューブを保った。 </li><li>優しく（これがフェロプラストを維持するために可能にする30分の間にmicocentrifugeチューブを手動で数回転倒懸濁液）してから25秒間1700×gで二度遠心する。 </li><li> 1Mソルビトールを含有し、ゆっくりと回転するホイール​​上で室温で2時間インキュベート上澄みを捨てたと（0.1M PHEM緩衝液中の2％のPFA、0.2％GA）の新鮮な標準強度固定液1ミリリットルを追加することにより、固定液を交換してください。 </li><li>以前に説明したように6クライオ切片化のための細胞を処理する。 NOTE：ナノゴールド取り込みおよび銀増強する手順については、指定されたプロトコルに記載の周期的な酸処理を行うことがないようにしている。過ヨウ素酸処理は、より良いセル壁26を透過することであるが、この構造は、スフェロプラストの生成中に除去されている。 </li><li>以前8に記載されているようUCTウルトラを用いたドライダイアモンドナイフで-120℃で50 nmの薄凍結切片を切り取り、50はニッケルグリッドメッシュコーティングされたホルムバール炭素上に置きます。 </li></ol>ナノ金粒子映像設備のための4。銀強化lization 注：反応混合物を製造するための手順は、基本的には、製造業者が示す1です。このプロトコルを使用して実用的な適応は、凍結切片上で効果的かつ信頼性の高い銀増強手順を行う。 <ol><li>冷凍庫から銀増強キットを削除し、37℃インキュベーターまたは水浴中で解凍。解凍した場合には、使用するまで、暗い部屋の中に置かれ24℃のインキュベーター（4.7参照）でキットを配置。 </li><li>暗い部屋で熱板を置き、24℃の最終温度まで温める</li><li>表面保護、光沢のある面を上にして加熱プレートの上部を覆い、テープで固定します。 </li><li> Benchkoteにパラフィルムを配置し、暗所にパラフィルムの端を見ることができるようにするために黒のマーカーでエッジをマーク。 </li><li>熱板の温度を監視するBenchkoteの上に温度計をテープで固定します。徐々に温度を調整しない場合は、24℃ </li><li>ナンプラー蒸留水や内部の銀増強キットで50ミリリットルチューブをCE。 </li><li>再蒸留水を用いて小型のペトリ皿を埋め、37℃で予め温め試料は30分間、上下左右、水にグリッドを配置します。 </li><li>この4.7ステップ1より多くの時間を繰り返します。 </li><li>収納ボックスにグリッドを転送し、暗い部屋にそれらをもたらす。 </li><li>加熱プレート上に固定されているパラフィルム上に置かれ24℃の蒸留水を数滴に（下に試料側に）、それらを渡すことによって、再びグリッドを洗浄します。 </li><li> 9追加の蒸留水の水滴が銀増強反応後の洗浄に、パラフィルム上で準備ができていることを確認してください。 </li><li>光をオフにして、すべてのライトが消えていることを確認してください。赤色光をオンにします。 </li><li> 24℃のインキュベーターから銀増強キットのAとBのソリューションを取り出します。 </li><li>最初のA液6滴と1.5メートルのB液を6滴入れLマイクロチューブ、気泡を作るために避けてガラスパスツールピペットでよく混ぜる。溶液は非常に厚く、それが最終的に手動で簡単にそれをボルテックスする前にピペットで混合しなければならない。 </li><li> 24℃のインキュベーター中でAとBのソリューションを戻し、C溶液を取り出します。 </li><li> A / BミックスにC溶液6滴を追加します。その後、パスツールピペットで最初再び混合し、次いでボルテックスにより、気泡を作ることは避けてください。 </li><li>パラフィルム上（〜20μL/ドロップ）滴を配置することで、すぐに最終的な混合物を使用してください。 </li><li>クリーン、耐磁ピンセットで、得られることを望んだ機能拡張（金粒子のつまり 。サイズ）によっては6〜15分間混合物（ 例えば 、銀強化反応）にグリッドを配置します。 </li><li>混合物からグリッドを取り外し、洗浄液を24℃で低下し、二重蒸留水の上に渡します。まず、急速に連続して6滴での使用、ドロップあたりの7分のインキュベーション時間で3滴、ライトをオンにする前に。 </li><li>次のステップは、EM調査のために、結果を可視化するために免疫金標識または膜染色27のいずれかに進みます。 </li></ol>

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<li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li>
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<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

免疫電子顕微鏡は、これらのタンパク質が存在するキャリアや細胞小器官の超微細構造の分解能でタンパク質の局在を組み合わせることが可能な技術である。酵母エンドソームシステムを研究する際に、その区画は蛍光顕微鏡のように断続構造が表示されますので、これは特に重大である。これは、それらを区別することは困難である。このような理由から、EMによって検出可能と時間依存的にエンドサイトーシス経路に入るプローブの使用は、異なるエンドソームを明確にマークすることが重要です。プローブのこのタイプは、エンドサイトーシス6の機能性を評価することは価値がある、それはタンパク質マーカーを検出する抗血清の不足に代わるものです。 ここで説明する手順では、積極的にエンドソーム区画を標識するプローブとしてナノ金を請求利用する。凍結切片は、特別な装置や技術を必要としながら、提示されたプロトコルは、技術的に容易であり、再ません特殊な機械を帖。そのためには、研究のためにそれを使用したい任意の研究室にアクセスできます。しかし、いくつかの注意事項が銀増強反応すなわち、この手順の重要なステップの間に入れなければな...

エンドソーム系は、1,2受容体リソソーム酵素ソーティング受容体のトラフィッキング及び原形質膜（PM）のリサイクルを含む複数の重要な細胞の役割を果たしている主要な膜選別装置である。エンドソームは、3つの異なるコンパートメント、 すなわち分割されている。初期エンドソーム（EE）、後期エンドソーム（LE）と、リサイクルエンドソーム。この分類は、特定のマーカータンパク質に及び、それらの形態で、それらに到達するためにエンドサイトーシスされた物質のにかかる時間に基づいている。膜は、午後から内部化すなわちタンパク質と脂質二重層は、分解のためにエンドソームを経由してリソソームに送達するか、または再循環する。膜はまた、ゴルジ体からエンドソームに輸送し、同様に、いずれのリソソームに継続するか、戻ってゴルジに検索することがされています。さらに、タンパク質は、エンドソーム境界膜の形成に至る過程から内方出芽管腔小胞に分類することができLEのサブカテゴリ、多胞体。 酵母エンドソーム系は、高い真核細胞のものよりも比較的複雑である。酵母エンドソームは、EEとLEに分かれています。哺乳動物細胞とは対照的に、それらはリサイクルエンドソームでなく、組織特異的なリソソーム関連オルガネラを含まない。そのため彼らは、エンドソーム人身売買ルート3,4の少ない複雑なネットワークを持っている。そのため酵母が表現され、今でもエンドソーム系に膜輸送の基礎となる原則のいくつかを研究するための有利な実験系を表しています。この利点は、エンドソーム経路に関与する多数の遺伝子が最初に酵母5での遺伝子スクリーニングで単離されているという事実によって強調される。 野生型および変異細胞における酵母エンドソーム系は広く生化学的および蛍光顕微鏡法アプローチを用いて研究してきたが、超微細構造レベルでの調査のみであった最小限。エンドソーム小器官のほとんどは彼らの明確な同定6困難に蛍光顕微鏡で断続構造として検出されるため、形態学的分析は、酵母において特に関連する。残念ながら、酵母エンドソームタンパク質マーカーを認識し、抗血清の限られた数は、（IEM）準備7月10日免疫電子顕微鏡で働いている。いくつかのタンパク質については、この問題は、目的の遺伝子の内因性のタグ付けとそれ7,11,12を検出するためのタグを認識する抗体を使用することによって回避されている。多くの場合、しかし、タンパク質が低いため発現レベルのIEMによって検出されない。この方法は細胞小器官の形態/機能にミス局在および/または変更を誘導することができるので、その過剰発現は、解決策ではありません。このように、電子顕微鏡EMによって検出可能なプローブを用いたエンドサイトーシス区画のラベルは、効果的なオプションです。これは、特にPR場合に最適なソリューションです。OBEは、特定の細胞小器官6を迎えます時に知ることができ、時間依存的にエンドサイトーシス経路を、入力している。 酵母スフェロプラスト（細胞壁が酵素的に除去されている、すなわち酵母）によって正に帯電したナノ金の取り込みに成功した酵母エンドソーム区画10は識別するのに使用されている。これらの粒子は強く、生体膜を構成する負に帯電した脂質に結合する。このようにPMと正に帯電したナノゴールドアソシエイツは、エンドサイトーシスによって細胞に浸透し、空胞に到達する前に、EEとLEを通過する。これらの小さな金粒子は、しかしながら、EMによって見られるように適切なサイズを有していない。彼らは目に見えるレンダリングするには、その大きさは、金型プローブ13〜15の周囲に銀や金の析出につながる化学反応によって拡大することができる。我々が開発され、首尾よく実行するために細胞内徳安法に基づくIEMアプローチを適用しているローカリゼーションは、8,16を研究。この方法では、形態学8,17-24の優れた分解能で酵母の準備に免疫金標識化を行うことができます。我々はまた、酵母エンドソーム系コンパートメント6のナノゴールドラベルとこのIEMプロトコルを組み合わせた手順を確立しています。我々は、形態学的に欠陥6,25エンドソーム輸送で変異体をエンドソームの異なるサブクラスを特徴とする超微細構造を調べてきたこのアプローチを使用する。また、我々は、このナノゴールド標識は異なるエンドソーム小集団に、目的のタンパク質の分布を探索する可能性を提供免疫金ラベル付けと組み合わせることができることを実証した。ここでは、正に帯電したナノゴールドと酵母エンドソームシステムの標識は、実質的にどのように実行されるか提示します。

<table><tbody><tr><td>PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt,</td><td>Germany 1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Positively charged Nanogold</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>-20 > deg;C</td></tr><tr><td>HQ-silver&trade; 強化キット</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma, St Louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 8% EM grade</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>-20 >C</td></tr><tr><td>溶解酵素</td><td>MP Biomedicals、カリフォルニア州サンタアナ</td><td>153526</td><td>-20 °Cで保存。C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St Louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50メッシュニッケルグリッド&nbsp;</td><td>Agar Scientific、スタンステッド、イギリス</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>クライオ免疫ダイヤモンドナイフ35&deg;</td><td>Diatome AG, Biel, Switzerland</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>UCTウルトラミクロトーム&nbsp;</td><td>Leica, Solms, Germany N.A. (ライカ、ゾルムス、ドイツ</td><td>)</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 resine</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50メッシュニッケルグリッド&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Grids storage box</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur キャピラリーピペット 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml微量遠心分離機&nbsp;</td><td>Sarstedt、N&uuml;mbrecht, Germany</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Benchkote surface protector</td><td>Whatman, Maidstone, United Kingdom&nbsp;</td><td></td><td></td>1159201</tr></tbody></table>

超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

エンドソームは、真核細胞の主要な膜ソートのチェックポイントの一つであり、彼らは主に、細胞膜やゴルジ体からのタンパク質のリサイクルや破壊を調節する。その結果、エンドソーム系は、細胞の恒常性を維持する上で中心的な役割を果たしており、小胞輸送によって相互接続オルガネラのこのネットワークに属する遺伝子の変異は、がんや神経生物学的障害を含む深刻な病状を引き起こす。これは、エンドソーム系の生物発生と組織のメカニズムを理解することは、プライム関連性のある。酵母Saccharomyces cerevisiaeが 、この作業において極めて重要となっている。特にこのモデル生物のエンドソームシステムにラベルを付け、超微細構造レベルで解析するために、我々はここで銀増強反応によりこれらの粒子の可視化に続いてスフェロによって正に帯電したナノ金の取り込みのための詳細なプロトコルを提示する。この方法はあまりにも貴重なものですエンドソーム輸送における欠陥を有する突然変異体の形態学的検査のためのL。また、それのみならず、超微細構造検査のために適用可能であるが、それはまた、タンパク質の局在の調査のための免疫金ラベル付けと組み合わせることができる。

提示されたプロトコールに従って、酵母エンドソーム系の形態は、送信EMによってアクセスすることができる。 図1に達し、したがって、ナノゴールドで標識されているエンドソーム区画の異なるタイプを示している。銀増強ナノ金は明らかに電子密度の高い粒子として見ることができます。銀増強反応のために確立された最適な設定は、酵母細胞の超微細構造を妨害しない5〜15 nmの均質なサイズ範囲内の金粒子を有することができる。原形質膜だけでなく、LEは、提示された場合多胞体で、取り込みの少なくとも30分（ 図の後に、これらの粒子によって到達可能であるが、早期エンドソーム区画は、24℃で5分間のインキュベーション（ 図1A）の後にナノ金にアクセス可能である1B）。ナノ金/銀増強プロトコルで我々のIEM手順8を組み合わせる分解能はここで説明され、未多胞体（ 図1B）の内部小胞、特に示さ小器官の形態の保存と品質によってderlined。 <p class="jove_co...

酵母、 サッカロマイセス·セレビシエは 、エンドソーム系の生合成と機能を調節する遺伝子を同定し、研究するための重要なモデル生物となっている。ここでは、超微細構造の研究のためのエンドソーム区画の特異的標識のための詳細なプロトコルを提示する。

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

本実験の全体的な目的は、酵母 Saccharomyces cei のエンドソーム区画を超微形態レベルで可視化することである。これは、酵母のスフェロプラストを調製し、正に帯電したナノ金粒子をエンドサイトーシスにより取り込ませることで達成される。第2段階として、試料を固定し、切片を作成して細胞の超薄凍結切片を得る。次に、凍結切片を銀増感反応に供します。エンドサイトーシスされた正電荷のナノ金粒子を拡大・可視化することで、本手法の特異的な標識に基づいた、酵母のさまざまなエンドソームコンパートメントの形態を示す結果が得られます。切片のImmunoGold標識などの既存の手法と比較した本技法の主な利点は、電子顕微鏡試料では機能しないことが多い抗体に依存しない点にあります。本手法は酵母 *Saccharomyces cerevisiae* のリソソーム系に関する知見を得るために有効ですが、他の酵母や哺乳類細胞などの他の真核生物モデルにも適用可能です。まず、スフェロプラストを調製する酵母を、翌日の実験計画に基づいて決定した適切な培地10 mL中で30 ℃にて一晩培養します。その後、600 nmにおける培養液の吸光度（OD 600）を測定し、同一の培養培地を用いて細胞をOD 600が0.2から0.4になるまで希釈します。細胞を指数増殖期まで培養し、OD 600が1から2になったところで、OD 600換算で10相当の細胞を50 mLチューブに移し、2100 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを5 mLの100 mM PBSおよび10 mM DTTに再懸濁し、30 °Cで10分間インキュベートします。遠心分離により細胞を回収します。上清を除去した後、1 molarのsorbitolと5 mgのlytic enzymeを含む5 mLの培地で細胞を懸濁させる。この混合物を30 °Cで30分間、緩やかに振盪しながらインキュベートする。細胞懸濁液を300 Gsで5分間遠心分離し、Sphero platsに相当するペレット分画を回収する。上清を捨て、1 M sorbitolを含む氷冷した培地 960 µLでスフェロプラストを再懸濁します。この混合液を氷冷した2 mLマイクロ遠心チューブに移します。ナノゴールド取り込みの手順を開始するために、ピペットを使用して、スフェロプラストと正に帯電したナノゴールド粒子を穏やかに混合します。40 µLの水で再懸濁します。混合物の最終容量を1 mLにしてください。得られた細胞懸濁液を氷上に15分間静置します。懸濁液を室温に戻し、エンドサイトーシスによるナノゴールドの内部移行が行われるよう、規定時間インキュベートします。目的のナノゴールドの取り込みが完了したら、1 M sorbitolを含む2倍濃度の固定液1 mLを細胞懸濁液に加えて反応を停止させます。チューブを室温で30分間保持します。PHE plastと懸濁液を均一に保つため、30分間のうちにマイクロ遠心チューブを手動で数回静かに転倒混和します。次に、1700 Gsで25秒間の遠心分離を2回行い、上清を除去した後、1 molar sorbitolを含む標準濃度の新鮮な固定液1 mLを添加します。低速回転ディスクを用いて、室温で2時間インキュベートします。その後、本手順を開始する前に記載されたテキストプロトコルに従って、細胞の処理および凍結切片作成を行います。シルバー増感キットをフリーザーから取り出し、37 °Cのインキュベーターで融解させます。融解したキットを、使用時まで暗室内に設置した24 °Cのベンチトップインキュベーターに入れておきます。ヒートプレートを暗室に設置し、最終温度が24 degrees Celsiusになるまで温めます。ヒートプレートの上部をベンチコート表面プロテクターで覆い、光沢のある面を上に向けた状態でテープで固定します。表面プロテクターの上にパラフィルムを敷き、暗所でも視認できるように端を黒のマーカーで印付けします。温度計をサーフェスプロテクターの上部にテープで固定します。加熱プレートの温度を監視しながら、温度を徐々に調整してください。24 °Cにならない場合は、2回蒸留水を入れた50 mLチューブを設置してください。インキュベーター内で、37 °Cに予熱した二回蒸留水を小型ペトリ皿に満たします。凍結切片を載せた2枚のニッケルグリッドを、試料面を下にして水に30分間浸します。30分後、2枚目のペトリ皿に予熱した二回蒸留水を満たし、同じ2枚のニッケルグリッドをさらに30分間水に浸します。加熱プレート上に固定したパラフィルムの上に、24 °Cの二回蒸留水を数滴滴下し、その上をグリッドの試料側を下にして通過させ、再度洗浄します。銀増感反応後の洗浄用に、パラフィルムの上にさらに9滴の二回蒸留水を用意しておいてください。手順のこの段階で、暗室内のすべての照明を消し、赤色灯を点灯させてください。ただし、撮影上の理由により、ライトは点灯させたままにします。本デモンストレーションでは、24 °CのインキュベーターからシルバーエンハンスメントキットのA液およびB液を取り出します。1.5 mLマイクロ遠心チューブにA液を6滴、続いてB液を6滴加え、気泡の形成を避けながらガラスパステールピペットでよく混ぜ合わせます。その後、溶液をボルテックスで攪拌します。溶液aおよびBを速やかに24°Cのインキュベーターに戻し、溶液Cを取り出します。AB混合液に溶液Cを6滴加します。再びパスツールピペットで混ぜた後、ボルテックスミキサーで撹拌しますが、気泡が入らないように注意してください。この最終混合液はすぐに使用してください。清潔な非磁性ピンセットを用いて、パラフィルム上に液滴を置きます。その混合液の上にグリッドを配置します。これは銀増幅反応です。実験で求める増幅度に応じて、グリッドを6～15分間浸漬させます。混合液からグリッドを取り出し、6滴の二回蒸留水を経由させて速やかに洗浄します。最後の3回の洗浄では、24°Cに設定したPerfil上の蒸留水を用いてください。水1滴につき7分間、グリッドを浸漬させます。実際の実験を行う場合は、洗浄が完了したら照明を再び点灯させてください。その後、電子顕微鏡（EM）観察のために、ImmunoGold標識または膜染色によって結果を可視化します。銀増感ナノゴールドを用いて、酵母の異なる種類のエンドソームコンパートメントを標識し、電子顕微鏡で可視化することができます。ナノゴールドを5分間取り込ませると、細胞膜および、エンドサイトーシス小胞と思われる単一小胞や、初期エンドソームである可能性が非常に高い管状構造などの初期エンドソームコンパートメントが標識されます。ナノゴールドを用いて30分間インキュベートすると、後期エンドソームまたはマルチベシキュラーボディが標識されます。免疫電子顕微鏡法とこのナノ金・銀増幅プロトコルを組み合わせることによる分解能の高さは、示されているオルガネラの形態、特に多胞体内部の小胞の保存状態と質によって裏付けられています。銀増幅法を用いる前に、銀粒子のサイズと均一性の両方において最適なインキュベーション時間を決定するための予備実験を行う必要があります。本手順に従ってください。特定のタンパク質が膜下コンパートメントのどの部位に局在しているかといった疑問に答えるため、免疫標識などの他の手法を用いることができます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け

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