Name: 推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶビーズ凝集アッセイによる細胞接着分子のキャラクタリゼーション。エクトドメイン断片を用いてタンパク質の接着活性を迅速かつ簡便に評価する手法です。HEC 293細胞を使用し、カルシウム依存的なホモフィリック接着を解析できます。

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この作業は、NSF/ARRA賞(IOS 0920357)とNIH賞(5R21MH098463)によって支援されました。

1。細胞調製（日-2〜0） <ol><li>分割HEK293細胞1： - 80％コンフルエント（2 - 3日間）および0.05％トリプシン-EDTA溶液を用いて5〜60まで、5％CO 2、37℃で増殖培地中でインキュベートする。各条件については、2×100mm皿内の培養細胞。 </li></ol> 2細胞トランスフェクション（1日目） <ol><li>そのようなリポフェクタミンなどのトランスフェクション試薬を使用してコードするプラスミドFc融合でHEK293細胞をトランスフェクトする。同等のトランスフェクション効率をもたらす代替的な方法を用いてもよい。 </li><li> 24時間インキュベーターにトランスフェクトされた細胞を返します。 </li></ol> 3セルの伝播（2日目） <ol><li> 37℃までのウシ胎児血清（-FBS）なしの予熱増殖培地。 </li><li>料理は10ミリリットルの成長メディア-FBSで2回すすぎ、1時間、37℃のインキュベーターに皿を返す。 </li><li>合計3回の洗浄のために、10ミリリットルの成長メディア-FBSと文化の料理をもう一度洗浄します。 </li><li> Incuお譲りしたメディアを収集する前に、FBSを含まない別の48時間、37℃でトランスフェクトされたHEK293細胞。 </li></ol> 4。ビーズ集約（4日目） <ol><li>培養皿からメディアを収集するには、細胞破片をペレット化し、5分間500×gで50ミリリットルコニカルチューブとスピンに料理の各ペアからメディアを転送します。 </li><li> 30ミリリットルの注射器、0.45μmのシリンジフィルターを用いて遠心フィルターに50ミリリットルコニカルチューブからフィルターメディア。 </li><li>濃縮された培養培地の体積は約500μlの（約15分）まで、4,000×gで、4℃で遠心分離フィルタースピン。すべての培養培地を添加して、濃縮されるまで繰り返します。 </li><li> 、各サンプルについて1.5mlのマイクロチューブに結合バッファーの氷冷1mlにプロテインG磁気ビーズを1.5μl加え、磁石上の場所とバッファを削除します。すぐにプロテインG磁気ビーズに濃縮した培養培地を追加します。 </li><li> 2時間、4℃で管を回転させます。 </li><li> Plの磁石上のエースチューブとは、メディアを取り出します。すばやく結合バッファーの氷冷1で2回ビーズを洗浄した後、結合緩衝300μlのビーズを懸濁します。 </li><li>スプリットは2管、各チューブに150μlの中にビーズを再懸濁し、その後、それぞれ、「カルシウム」と「いいえカルシウム」の条件について200のCaCl 2または200のEDTA、1.5μlを添加する。 </li><li>うつ病への転送、各条件からの100μlをうまくスライドさせ、透過光顕微鏡（ 図2）を使用して、顕微鏡写真を収集します。所望の各時点での各実験のために5視野からの画像を収集します。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li> [ファイル ]プルダウンメニューから... ImageJの、または同等の画像解析ソフト、 インポート/イメージシーケンスを使用して、5つの画像データセットのオープン1を使用した。これらは、画像スタックとして開かれます。 </li><li> イメージ / プロパティ...]ダイアログボックスで、私を変更ピクセルにメイジユニットおよび1.0にピクセルの幅と高さをピクセル単位で設定します。 </li><li> 画像プルダウンメニューで調整/しきい値...コマンドを使ってバイナリに画像を変換します。ビーズやビーズ凝集体に貢献する画素が含まれるようにしきい値を設定しますが、その背景と小さい粒子を除外します。スタック内のすべての画像に適用します。 </li><li> セットの測定 ]ダイアログボックスで、 エリアとスタックポジションチェックボックスをオンにします。 </li><li>プルダウンメニューの分析に...粒子を分析し実行します。これは、それらの大きさ（面積）およびそれらが同定された画像を含む同定された粒子のリストを生成する。 </li><li>実験と実験条件について、この手順を繰り返します。 </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

細胞接着は多細胞生命の本質的な特徴であり、細胞表面タンパク質の広範な配列によって媒介される。このうち、詳細な接着性が比較的小さい割合と理解される。ここでは、便利なエピトープタグに融合された分泌された外部ドメインの同種親和性接着剤能力を調査するための、シンプルで迅速なプロトコルを記載している。このアプローチは、多くの重要な利点を有している。タンパク質の十分な量が100mm皿の一過性トランスフェクションによって生成することができるように、まず、安定した細胞株は、14,20を必要としない。 例えば点または削除変異体- -これは構造体のより多くのスクリーニングを可能にする細胞株を大量に生成し、維持するための努力と費用をかけずに。第二に、これらのビーズアッセイは、減少し、システム内の推定上の接着分子の生化学的性質の直接的な試験である。そのため、接着は直接タンパク質に起因することができます調査ではなく、潜在的な間接的影響下に。第三に、可能な補因子の効果を調べるために、細胞を、推定上の接着分子とその推定上の補因子の分泌された形態の、別個のエピトープタグとのそれぞれに同時トランスフェクトすることができる。それは、...

細胞間接着は、多細胞生物の発生および完全性に必須であり、細胞表面分子の多様な配列によって媒介される。これらの接着分子の多くは、多くはまだ発見されていないものの、同定され、特徴付けられている。いくつかの方法は、アッセイを、細胞選別、細胞凝集アッセイ1-8と、原子間力顕微鏡、表面力分光法9-12のような生物物理学的方法を含む細胞接着分子（CAM）の特性を調べるために使用される。 偶数細胞株を用いてインビトロ系において簡略化の複雑さは、それが困難な推定上のCAMの接着特性を決定することを可能にする。非接着細胞株にトランスフェクトした場合には細胞凝集を誘導する場合、通常、分子はCAMと考えられている。しかし、これは接着活性の直接的な証拠はないことは明らかである。例えば、細胞表面の配信または安定性を促進するCAMはまた、増加した細胞凝集1,13をもたらすであろう。また、真のCAMは、細胞株は、細胞表面送達または安定化に必要なその他の補助因子を欠いている場合、細胞凝集を媒介することに失敗することがあります。 これらの複雑な要因を回避するために、より直接的なアッセイは、接着性相互作用は、細胞外ドメインの固有の生化学的性質であるべきであるという考えに基づいていることを採用することができる。ビーズは最初に呉-CAM 2を特徴付けるために使用されたが、これらのアッセイは、カドヘリン介在性接着12,14,15を調べるために拡張されている。 C-カドヘリン細胞外ドメイン-Fc融合の融合を使用して、Gumbinerラボは、複数のカドヘリンリピートが相互作用14を同種親和性に寄与することを示した。 ショウジョウバエからプロト1,15-18とDSCAMアイソフォームの数を持っているように、同等のビーズ凝集アッセイ、E-カドヘリンとN-カドヘリン接着を使用すると、、12,15を特徴づけられている<em&gt; 19。ここでは、推定上の同種親和性のCAM（ 図1）の分泌され、エピトープタグの外部ドメインの接着活性を特徴付けるため、比較的簡単かつ迅速なアッセイを記述する。私たちは、カドヘリンスーパ​​ーファミリーのメンバーを特徴づけるために、主にこのアッセイを使用している。

<table><tbody><tr><td>pFc-N1プラスミド</td><td>Addgene</td><td>提出予定</td><td></td></tr><tr><td>HEK293細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 25300054</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash;プロテインG</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>うつ病スライド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>アミコン ウルトラ-15 遠心フィルターユニット ウルトラセル-10 膜</td><td>ミリポア</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm シリンジ フィルター</td><td>サーシュテット</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>フィジー (ImageJ) 画像解析ソフトウェア</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table of Buffers/Solutions</td></tr><tr><td>Growth Media</td><td>DMEM + 10% FBS + Pen-Strep</td><td>Filter 滅菌し、4°Cで保存します。</td><td></td></tr><tr><td>グロースメディア&ndash;FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep</td>フィルター<td>は、4°Cで滅菌および保管します。</td><td></td></tr><tr><td>結合バッファー</td><td>50 mM Tris、pH 7.4、100 mM NaCl、10 mM KCl、0.2% BSA</td><td>Vortex 溶解するまで、氷上に保ちます。</td><td></td></tr></tbody></table>

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

細胞 - 細胞接着は多細胞生命の基本であり、細胞表面タンパク質の多様な配列によって媒介される。しかし、これらのタンパク質の多くのための接着剤の相互作用はほとんど解明されていない。ここでは、推定される同種親和性細胞接着分子の接着特性を特徴付けるための、シンプルで迅速な方法を提示する。培養されたHEK293細胞は、細胞表面タンパク質の分泌、エピトープタグ外部ドメインをコードするDNAプラスミドでトランスフェクトされる。エピトープタグに特異的な官能化されたビーズを用いて、可溶性の分泌された融合タンパク質を培地から捕捉される。コー​​ティングされたビーズは、その後、ビーズ凝集アッセイにおいて、または同種親和性接着を試験するためのアッセイを選別蛍光ビーズに直接使用することができる。所望の場合、突然変異誘発は、その後の接着に必要な特定のアミノ酸又はドメインを解明するために使用することができる。このアッセイは、発現されたタンパク質の少量のみを必要とする安定な細胞株の産生を必要とせず、アコすることができ4日間でmplished。

実験例は、FC（NcadEC-Fc）のに融合したN-カドヘリンの細胞外ドメインによってカルシウム依存性ビーズの凝集を示した図2に示されている。カルシウムの非存在下では、ビーズは凝集するほとんど又は全く傾向を示す、時間（ 図1A、C）との凝集体サイズの増加はない。カルシウムの存在下では、ビーズは、凝集体サイズが（ 図1B、C）は、時間の経過とともに増加し、NcadEC-Fcのショー堅牢な集約でコーティング。この実験は、5つの非重複視野からの画像からなる各インスタンスで、3回繰り返した。画素領域内の粒子サイズは、5つのフィールド内の各集合体について決定した。これらのデータは、各実験における各時点について平均した。 3回の実験のデータは、各時点（ 図2C）における手段と測定の標準誤差を決定するために平均化した。 1762 / 51762fig1highres.jpg "/&gt; ビーズ凝集アッセイ中の分泌、エピトープタグの外...

ここでは、推定細胞接着分子の固有の接着特性を特徴付けるための簡単で迅速な方法を提示します。 細胞接着分子の分泌されたエピトープタグ付きエクトドメインは、培養培地から小さく均一な官能基ビーズに捕捉されます。 これらのビーズは、その後、単純なビーズ凝集アッセイですぐに使用できます。

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

この手順の全体的な目標は、ヒトIgGのFC領域へのエクトドメインフラグメントの融合をコードするこのプラスミドを達成するために、タンパク質エクトドメインがホモフィリック接着を媒介する能力をテストすることです。分泌されたOdin FC融合タンパク質は、プロテインGに結合した磁気ビーズに捕捉され、洗浄後、コーティングされたビーズは溶液中で相互作用します。次に、コーティングされたビーズを画像化して凝集の程度を評価し、最後に、単純な画像分析を使用して定量化します。結果として得られるデータは、タンパク質アンダースタディがホモフィリック接着を媒介できるかどうかを明らかにします。この手法は、細胞凝集アッセイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、迅速かつ簡単に、選択したタンパク質の接着活性を直接テストできることです。この手法を実演するのは、研究所の上級科学者であるミシェル・エマン博士です。この手順は、トランスフェクションの2〜3日前に、ここでECFCでNCA用の培養細胞を準備することから始めます。EDTAで0.05%tripsを使用して、HEC 2 93細胞を培養皿から分離します。各条件に合わせて100ミリ皿を2皿用意します。細胞を1〜5個に分けて培養します。成長培地を補充しました。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベートし、60〜80%のコンフルエントになるまで培養します。トランスフェクション当日は、lipoなどの試薬を用いてFC融合をコードするプラスミドを導入します。トランスフェクション後、トランスフェクションの翌日に細胞をインキュベーターに24時間戻します プレウォーム、ペント連鎖球菌を含むDMEM、およびウシ胎児血清なしを摂氏37度まで。温めた培地10ミリリットルで各皿を2回すすぎ、インキュベーション後1時間皿を摂氏37度のインキュベーターに戻し、培養皿をウシ胎児血清を含まない10ミリリットルのDMEMでもう一度すすぎ、合計3回の洗浄を行い、その後、トランス切除した細胞をさらに摂氏37度で48時間インキュベートしてから培地を収集します。トランスフェクションの4日後、血清学的ピペットを使用して、培養皿の各ペアから培地を回収し、50ミリリットルの円錐管に移します。次に、培地を5分あたり500Gで遠心分離して、スピン後に細胞破片をペレット化し、各50ミリリットルの円錐管から培地を30ミリリットルのシリンジに注ぎ、0.45ミクロンのシリンジでろ過します。遠心濃縮器にろ過します。濃縮培地の量が約500マイクロリットルに減少するまで、遠心フィルターを回転させます。これには約 15 分かかります。すべての培地が添加され濃縮されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、1.5マイクロリットルのタンパク質G磁気ビーズを1ミリリットルの氷冷結合緩衝液に各サンプルの1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。この手順の最も難しい側面は、ビーズの凝集です。成功を確実にするために、手順に正確に従うようにしてください。ビーズをすばやく観察しますが、厳しすぎないようにします。チューブの側面で乾燥させたり、磁石に長時間留まらせたりしないでください。チューブを磁石の上に置き、ピペットを使用してバッファーを吸引します。その後、すぐに濃縮培地をプロテインG磁気ビーズに加えます。チューブを摂氏4度で2時間回転させます。チューブを磁石の上に置き、媒体をすばやく取り除きます。ビーズを1ミリリットルの氷冷結合緩衝液で2回洗浄し、次にビーズを300マイクロリットルの結合緩衝液に再懸濁します。再懸濁したビーズを2本のチューブに分割し、各チューブに150マイクロリットルを入れます。次に、カルシウム条件とカルシウムなし条件にそれぞれ1.5マイクロリットルの塩化カルシウムまたはEDTAを追加します。各状態から100マイクロリットルをくぼみに移します。透過光顕微鏡を使用してよくスライドします。各実験の5つの視野から、目的の各時点で画像を収集します。image Jまたは同等の画像解析ソフトウェアを使用します。ドロップダウンメニューで、画像Jの5つの画像データセットのいずれかを開きます。画面の上部にある [ファイル] を選択します。次に、[インポート]、[画像シーケンス]の順に選択します。画像ファイルが含まれているフォルダを見つけて、画像スタックとして開きます。次に、ドロップダウンメニューバーで[画像]をクリックし、[プロパティ]を選択します。そこでプロパティウィンドウを開きます。画像の単位をピクセルに変更し、ピクセルの幅とピクセルの高さを 1.0 に設定します。画像をもう一度クリックし、[調整]、[しきい値]の順に選択してしきい値ウィンドウを開き、スライダーを使用して画像のしきい値を調整します。ビーズに寄与するピクセルを含め、小さな粒子を排除します。画像スタック内のすべての画像にしきい値を適用します。次に、画面上部のドロップダウンメニューバーにあります。[分析]をクリックします。次に、[測定の設定]を選択し、画面上部の[領域]と[スタック位置]のチェックボックスを使用して測定ダイアログボックスを開きます。[分析]をクリックし、[粒子の分析]を選択します。これにより、識別された粒子のサイズと識別された画像を含む、識別された粒子のリストが生成されます。各実験および各実験条件についてこのプロセスを繰り返して、ゼブラフィッシュとカドヘリンのカルシウム依存性接着能を決定します。HEC 2、9、3細胞をNCATヘリンODドメインでトランスフェクションし、2つのfcを融合させ、続いてカルシウム依存性ビーズ凝集細胞を、これらの画像で見ることができるように、このビデオで説明されているようにイメージングおよび分析しました。カルシウムが存在しない場合、ビーズは凝集する傾向がほとんどまたはまったくなく、カルシウムの存在下では時間の経過とともに凝集サイズが増加することはありません。しかし、NCATとECFCでコーティングされたビートは、接着の半定量的な尺度として、時間の経過とともに骨材サイズが増加する堅牢な凝集を示しています。3つの実験からの透過光画像を分析して、凝集体の平均サイズを決定しました。このプロットからわかるように、カルシウムの存在下とカルシウムの非存在下でのncoer ECFCコーティングビーズの凝集は、15分間隔で測定されました。1時間にわたって、これらのデータは、ゼブラフィッシュのnカドヘリンのエクトドメインがカルシウム依存性のホモフィリック接着を媒介していることを明らかにしています。このビデオを見れば、接着が目的のタンパク質の本質的な生化学的特性であるかどうかを検定する方法を十分に理解できるはずです。

bead-aggregation-assays-for-characterization-putative-cell-adhesion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 -...

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

このビデオでは、HEK細胞凝集アッセイを通じてシナプス細胞接着分子間の細胞間相互作用を測定する技術を実演します。このアッセイでは、所望のシナプス前細胞接着分子と蛍光タンパク質を発現する同数のHEK細胞を、シナプス後細胞接着分子と別の蛍光タンパク質を発現するHEK細胞と混合します。細胞接着分子間の相互作用により、細胞は凝集し、これは蛍光顕微鏡で測定できます。...

細胞接着分子間のトランス相互作用を検出するための細胞凝集アッセイ

内皮細胞単層内の接着細胞の実際の数を定量できるin vitro法を報告します。...

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

宿主細胞への細菌の付着は、宿主のコロニー形成と感染の間の重要なステップです。このプロトコルは、ポリマー共役組換えアドヘシンの生成を生体模倣材料として説明し、他の細菌要因とは無関係に、これらのプロセスへの個々のアドヘシンの寄与の分析を可能にします。...

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

この流接着アッセイは、T細胞、上皮細胞間相互作用の単純な、耐衝撃性モデルを提供します。シリンジポンプは、剪断応力を生成するために使用し、共焦点顕微鏡は、定量化のための画像を捕捉します。これらの研究の目的は、効果的に流れ条件を使用して、T細胞接着を定量化することです。...

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。...

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

本研究は、ユーティリティおよび定量的細胞膜拡張測定と細胞の接着能の相関性を示します。代表的な例として、Dickkopf 関連蛋白質 3 を紹介して (DKK3) が増加 lobopodia 形成を促進し、副腎皮質癌における細胞接着細胞の in...

細胞膜の拡張機能と癌細胞の接着の役割を勉強のキャラクタリゼーション

血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in...

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。...

異種細胞系におけるタンパク質凝集による細胞間相互作用の測定

本稿では、1)焦点接着のサイズと数および2)細胞形状指標およびMCF7細胞のコンラエント単層の共焦点画像からの分布の定量化について説明する。...

MCF7細胞単層における細胞基質接着面積と細胞形状分布の定量化

このプロトコルは、高速細胞圧延接着中に接着イベントを画像化するために、接着フットプリントアッセイを実行するための実験的手順を提示する。...

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

学ぶビーズ凝集アッセイによる細胞接着分子のキャラクタリゼーション。エクトドメイン断片を用いてタンパク質の接着活性を迅速かつ簡便に評価する手法です。HEC 293細胞を使用し、カルシウム依存的なホモフィリック接着を解析できます。

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

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