2014年10月17日
ここでは、推定細胞接着分子の固有の接着特性を特徴付けるための簡単で迅速な方法を提示します。 細胞接着分子の分泌されたエピトープタグ付きエクトドメインは、培養培地から小さく均一な官能基ビーズに捕捉されます。 これらのビーズは、その後、単純なビーズ凝集アッセイですぐに使用できます。
この手順の全体的な目標は、ヒトIgGのFC領域へのエクトドメインフラグメントの融合をコードするこのプラスミドを達成するために、タンパク質エクトドメインがホモフィリック接着を媒介する能力をテストすることです。分泌されたOdin FC融合タンパク質は、プロテインGに結合した磁気ビーズに捕捉され、洗浄後、コーティングされたビーズは溶液中で相互作用します。次に、コーティングされたビーズを画像化して凝集の程度を評価し、最後に、単純な画像分析を使用して定量化します。結果として得られるデータは、タンパク質アンダースタディがホモフィリック接着を媒介できるかどうかを明らかにします。
この手法は、細胞凝集アッセイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、迅速かつ簡単に、選択したタンパク質の接着活性を直接テストできることです。この手法を実演するのは、研究所の上級科学者であるミシェル・エマン博士です。この手順は、トランスフェクションの2〜3日前に、ここでECFCでNCA用の培養細胞を準備することから始めます。
EDTAで0.05%tripsを使用して、HEC 2 93細胞を培養皿から分離します。各条件に合わせて100ミリ皿を2皿用意します。細胞を1〜5個に分けて培養します。
成長培地を補充しました。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベートし、60〜80%のコンフルエントになるまで培養します。トランスフェクション当日は、lipoなどの試薬を用いてFC融合をコードするプラスミドを導入します。
トランスフェクション後、トランスフェクションの翌日に細胞をインキュベーターに24時間戻します プレウォーム、ペント連鎖球菌を含むDMEM、およびウシ胎児血清なしを摂氏37度まで。温めた培地10ミリリットルで各皿を2回すすぎ、インキュベーション後1時間皿を摂氏37度のインキュベーターに戻し、培養皿をウシ胎児血清を含まない10ミリリットルのDMEMでもう一度すすぎ、合計3回の洗浄を行い、その後、トランス切除した細胞をさらに摂氏37度で48時間インキュベートしてから培地を収集します。トランスフェクションの4日後、血清学的ピペットを使用して、培養皿の各ペアから培地を回収し、50ミリリットルの円錐管に移します。
次に、培地を5分あたり500Gで遠心分離して、スピン後に細胞破片をペレット化し、各50ミリリットルの円錐管から培地を30ミリリットルのシリンジに注ぎ、0.45ミクロンのシリンジでろ過します。遠心濃縮器にろ過します。濃縮培地の量が約500マイクロリットルに減少するまで、遠心フィルターを回転させます。
これには約 15 分かかります。すべての培地が添加され濃縮されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、1.5マイクロリットルのタンパク質G磁気ビーズを1ミリリットルの氷冷結合緩衝液に各サンプルの1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。
この手順の最も難しい側面は、ビーズの凝集です。成功を確実にするために、手順に正確に従うようにしてください。ビーズをすばやく観察しますが、厳しすぎないようにします。
チューブの側面で乾燥させたり、磁石に長時間留まらせたりしないでください。チューブを磁石の上に置き、ピペットを使用してバッファーを吸引します。その後、すぐに濃縮培地をプロテインG磁気ビーズに加えます。
チューブを摂氏4度で2時間回転させます。チューブを磁石の上に置き、媒体をすばやく取り除きます。ビーズを1ミリリットルの氷冷結合緩衝液で2回洗浄し、次にビーズを300マイクロリットルの結合緩衝液に再懸濁します。
再懸濁したビーズを2本のチューブに分割し、各チューブに150マイクロリットルを入れます。次に、カルシウム条件とカルシウムなし条件にそれぞれ1.5マイクロリットルの塩化カルシウムまたはEDTAを追加します。各状態から100マイクロリットルをくぼみに移します。
透過光顕微鏡を使用してよくスライドします。各実験の5つの視野から、目的の各時点で画像を収集します。image Jまたは同等の画像解析ソフトウェアを使用します。
ドロップダウンメニューで、画像Jの5つの画像データセットのいずれかを開きます。画面の上部にある [ファイル] を選択します。次に、[インポート]、[画像シーケンス]の順に選択します。
画像ファイルが含まれているフォルダを見つけて、画像スタックとして開きます。次に、ドロップダウンメニューバーで[画像]をクリックし、[プロパティ]を選択します。そこでプロパティウィンドウを開きます。
画像の単位をピクセルに変更し、ピクセルの幅とピクセルの高さを 1.0 に設定します。画像をもう一度クリックし、[調整]、[しきい値]の順に選択してしきい値ウィンドウを開き、スライダーを使用して画像のしきい値を調整します。ビーズに寄与するピクセルを含め、小さな粒子を排除します。
画像スタック内のすべての画像にしきい値を適用します。次に、画面上部のドロップダウンメニューバーにあります。[分析]をクリックします。
次に、[測定の設定]を選択し、画面上部の[領域]と[スタック位置]のチェックボックスを使用して測定ダイアログボックスを開きます。[分析]をクリックし、[粒子の分析]を選択します。これにより、識別された粒子のサイズと識別された画像を含む、識別された粒子のリストが生成されます。
各実験および各実験条件についてこのプロセスを繰り返して、ゼブラフィッシュとカドヘリンのカルシウム依存性接着能を決定します。HEC 2、9、3細胞をNCATヘリンODドメインでトランスフェクションし、2つのfcを融合させ、続いてカルシウム依存性ビーズ凝集細胞を、これらの画像で見ることができるように、このビデオで説明されているようにイメージングおよび分析しました。カルシウムが存在しない場合、ビーズは凝集する傾向がほとんどまたはまったくなく、カルシウムの存在下では時間の経過とともに凝集サイズが増加することはありません。
しかし、NCATとECFCでコーティングされたビートは、接着の半定量的な尺度として、時間の経過とともに骨材サイズが増加する堅牢な凝集を示しています。3つの実験からの透過光画像を分析して、凝集体の平均サイズを決定しました。このプロットからわかるように、カルシウムの存在下とカルシウムの非存在下でのncoer ECFCコーティングビーズの凝集は、15分間隔で測定されました。
1時間にわたって、これらのデータは、ゼブラフィッシュのnカドヘリンのエクトドメインがカルシウム依存性のホモフィリック接着を媒介していることを明らかにしています。このビデオを見れば、接着が目的のタンパク質の本質的な生化学的特性であるかどうかを検定する方法を十分に理解できるはずです。
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本記事では、エクトドメイン断片を用いて細胞接着分子の接着特性を迅速にキャラクタライズする方法を提示します。この手法では、分泌されたエピトープタグ付きエクトドメインを機能化ビーズで捕捉し、ビーズ凝集アッセイを行います。
細胞接着分子の迅速な特性評価は、初期創薬ターゲットのリスクを低減し、細胞生物学に基づいた治療プログラムにおけるメカニズム上の仮説を明確にするために極めて重要です。ビーズ凝集アッセイを用いることで、ホモフィリックな接着特性を直接的かつ定量的に評価でき、ターゲット選定における予測精度の向上と機能的な検証が可能になります。この効率化されたワークフローは、タンパク質の機能に関する曖昧さを排除し、創薬の転換点におけるポートフォリオの選別と優先順位付けを加速させます。
このビーズ凝集アッセイは、初期探索からリード化合物同定に至る一連の流れに適合し、分子特性解析と機能的スクリーニングを繋ぐ架け橋となります。