Name: 初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染法。WNT3A前処理とウイルス産生、安定統合選択により遺伝子発現操作を実現し、GFP蛍光で評価可能なin vitro遺伝子機能解析モデルを構築します。

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クーBKとMustata RCは医学研究審議会（MRC）でサポートされているウェルカムトラストとアンダーソン·ロルフAからのサー·ヘンリー·デール·フェローシップでサポートされています。フィンクJはウェルカムトラスト4年間の博士課程 - プログラムによってサポートされています。

以下のプロトコールで使用される全てのマウスは、特定病原体を含まない条件下で維持し、全ての手順は、英国内務省の規制に従って行った。 の調製<ol><li>使用に先立ってメディア1時間を準備し、少なくとも10分間、使用前に37℃の水浴中および前加温（ 表1および材料のリスト詳細は参照）。 </li></ol> 2培養小腸（SI）オルガノイド注：特に明記しない限り、全てのインキュベーションは、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で行われる。生きている細胞と接触する機器および試薬は、無菌でなければならない。 それは地下マトリックス（マトリゲルまたはBME）は播種時に広がるから落下防ぐように組織培養プレートを事前に温めることが重要です。また、基底行列は常に氷上で維持されるべきである。 -20℃と融解で保存使用前に氷上で。 <ol><li>陰窩の分離<ol><li>小腸を単離するために、その後、国の規則および規制に従って、マウスを犠牲にし、その裏に動物を配置し、70％エタノールで腹部を洗う。胸骨に足の付け根から縦正中切開を行います。まず、皮膚、次に皮下組織を切断する。胃に盲腸から小腸を取り出します。十二指腸、空腸および回腸から単離された陰窩はオルガノイド培養のために使用することができる。 </li><li>カルシウムやマグネシウム（PBS0）することなく、予め冷却したリン酸緩衝生理食塩水と分離され、小腸を洗ってください。 </li><li> 3〜5センチメートル長い断片に組織を切断し、縦に開いて、それをカットするはさみを使用しています。鉗子を使用して組織を広げる。 </li><li>カバーガラスを使用した絨毛を削り取る。注意、あまりにも多くの力が組織を引き裂くことになりますし、手順に従ってに陰窩の収量が減少します。 </li><li>予備冷却PBS0を使うを含む50mlチューブに組織を移すグラム鉗子。激しく振盪を通して組織片を洗浄しPBS0を変更してください。 2〜3倍を繰り返したりPBS0はあまり濁って変わるまで。 </li><li>チューブローラー上で4℃で30分間、1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）でPBS0を30 mlを含む50mlチューブ中で組織をインキュベートする。 </li><li>激しくチューブを振るおよび5mM EDTAでPBS0 30mlのを含む別の50ミリリットルチューブに組織を移す。 （以前に組織を含む）を1 mMのEDTA溶液は、陰窩および絨毛の混合物が含まれます。それはしばしば絨毛の高い割合が含まれているので、この画分は、オルガノイドの播種に適していない。 </li><li>チューブローラー上で4℃で1時間、さらに組織をインキュベートする。 </li><li>激しくチューブを振るときれいな50mlチューブ内の溶液を収集します。光学顕微鏡で50μl中陰窩をカウントすることで、 たとえば 、陰窩の存在を確認し、数を推定。 50-100陰窩を得るために必要な体積を計算し、1.5ml tにそれを転送するUBE。 </li><li> 5分間300×gでスピン。 、上清を捨て、予め温めておいた24ウェルプレート中の基底行列50μlのペレット、および種子を懸濁します。地下マトリックスが重合ので5〜15分間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li> 500μlのENR培地でオーバーレイ（ 表1参照）。オルガノイドを播種した後の約24時間後には、小さな丸い嚢胞の形を示し、構造が見えるようになる新進さらに2〜3日後になります。 3日ごとに新鮮なENRメディアに変更します。 </li><li>通過は7日ごとに文化をオルガノイド。 </li></ol></li><li>継代およびメンテナンスオルガノイド<ol><li>約7日ごとに、死んだ細胞で満たされたルーメンになるように5：3または1：3日おきにメディアをリフレッシュし、通路1によるオルガノイドを維持します。 </li><li> 1ミリリットルピペットマンチップを用いて媒体と地下行列ドームを破壊し、1.5mlチューブによくからそれを転送します。 </li><li>機械的にピペッティングAを介してオルガノイドを解離pproximately 50倍細かい（ 例えば 、200μlの）チップを用いて。 </li><li> 5分間300×gでスピン。 </li><li>上澄みを捨て、地下マトリックスの150〜250μlのペレットを再懸濁します。予め温め、24ウェルプレートにおける種子（地下行列/ウェルを50μl）。コー​​ティングするために一度地下行列を上下先端部の壁にピペットを播種する前に。ピペットでゆっくりと広がる基底行列を防ぐためにウェルの中央に気泡やシードを回避する。これは、ウェルの中央に基底行列のドームを得ることが望まれる。 </li><li>基底行列が重合よう5-15分間組織培養インキュベーター中でインキュベートする。ウェルあたり500μlのENRメディアとのオーバーレイ。 </li></ol></li></ol> 3プリ感染SIオルガノイドの治療注： 図1は、形質導入手順を示す。 <ol><li> ENRWntNicへの交換ENR培地（ 表1参照）とtでオルガノイドを育てる3日以上または、彼らは嚢胞の形態を採用しているまで、彼のメディア。ニコチンアミド（NIC）が培養効率を向上させながら、Wnt3aは、幹やパネート細胞の数が増加します。 </li></ol> 4。ウイルス産生<ol><li>プラチナ-E細胞の一つの150mmの皿は、感染ごとに必要とされる。シード約5×10 6ピューロマイシンの存在下で15〜18ミリリットルの培地（DMEM + 10％FBS）を有する細胞（1μg/ ml）およびブラストサイジン（10μg/ ml）を。これらは70〜80％のコンフルエンシーに達したときに、2〜3日後に細胞をトランスフェ。ピューロなしで+ 10％FBSのDMEMに培地を変更し、トランスフェクション前にブラストサイ。 </li><li> OPTI-MEMの1ミリリットルを含むチューブを分離するポリエチレンイミン（PEI）のレトロウイルスDNA構築30μgの240を添加する。混合し、5分間室温でインキュベートする。 </li><li>二つの溶液をプールし、20〜30分間室温でインキュベートする。プラチナ-E細胞の培地への完全な混合物を追加し、慎重にPLATを振るeは、DNA-PEI複合体の均等な分布を確保する。 </li><li>一晩のトランスフェクション混合物とプラチナ-E細胞をインキュベートし、翌日培地をリフレッシュ。 2日間新しい培地中の細胞を保管してください。 </li><li> 、50mlのFalconチューブ内の培地のみを収集して12〜16時間、4℃で8,000×gで0.45μmのフィルターと遠心分離機を介して渡します。上澄みを捨て、形質導入培地250μlの中にペレットを再懸濁し（ 表1参照）。 </li></ol> 5。オルガノイドフラグメント準備<ol><li> 1感染のため、24ウェルプレートからの1つのウェルが必要とされている。 1ミリリットルピペットマンチップを用いて媒体と地下行列ドームを破壊し、1.5mlチューブに移す。 </li><li>機械的にピペッティング（30-50x）を介してオルガノイドを破壊するために細かいボリュームチップ（ 例えば 、200μlのチップ）を使用します。解決策は、曇っになり、全く全体オルガノイドは表示されません。 </li><li>室温で5分間、900×gでの遠心分離<html> 。 </li><li>上清を捨て、細胞培養グレードの組換えプロテアーゼ（ 例えば 、のTrypLE）500μlにペレットを再懸濁します。 5分間37℃でインキュベートする。インキュベーションに続いてフラグメント当たりの細胞数をカウントし、光学顕微鏡を用いてオルガノイド断片のサイズを確認。 5-10細胞を含有するフラグメントが理想的です。断片の大部分は細胞のより高い数を含む場合、インキュベーション時間は、一度に2分することにより増加させることができる。 </li><li> ENR培地500μlを添加することにより、解離プロセスを終了します。 </li><li>室温で遠心し、5分間900×gで。上清を除去し、氷や4℃でペレットを保持します。 </li></ol> 6。レトロウイルス形質導入<ol><li> 48ウェルプレートの1ウェル中（セクション4.5からの）レトロウイルス溶液を250μlのオルガノイドの断片を結合します。 1ミリリットルピペットマンチップを用いてゆっくりとピペッティングにより穏やかに混合します。 </li><li>パラフィルムでプレートを密封。 </li></ol>E &quot;&gt; 7。ピノキュレーションとメッキ<ol><li> 1時間、32℃、600×gでプレートを遠心。慎重にパラフィルムを除去し、6時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li></ol>感染オルガノイドフラグメントの8播種<ol><li> 1.5mlチューブによくから感染オルガノイド断片及び伝達メディアを転送し、5分間900×gでスピン。 </li><li>上澄みを捨て、冷却するために氷上で5分間ペレットを含むチューブを置く。地下マトリックスを100μlを加え、上下にゆっくりピペッティングすることによりペレットを再懸濁します。 </li><li>新しい24ウェルプレートに50μlの「ミックス-cell地下マトリックス」の種子落下。地下の行列が固化するまで5〜15分間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>ウェルにポリブレンなしに伝達メディアを追加し、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 2〜3日おきにメディアを変更します。 </li></ol> 9。選択<ol><li>スタートSEメディアへのピューロ（を1μg/ ml）を添加することにより、2〜3日後にlection。 </li><li>フラグメントが形成オルガノイドピューロ（1μg/ ml）を補充したENRメディアに伝達メディアを交換し始めています。 </li></ol> 10感染後のSIオルガノイドの治療<ol><li>文化 &quot;は継代およびオルガノイドの維持&quot;プロトコル（セクション2.2.1）に従ってオルガノイド形質導入。 1〜2週間後のSIオルガノイドは、出芽の構造を取り戻すでしょう。 </li><li>出芽構造の出現に続いて1μMの作用濃度で4 - ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）を加えることによってmiRNA又はcDNAの発現を誘導する。このステップはAddgene（のpMSCV-のloxP-DsRedを - のloxP-EGFP-ピューロ-WPRE（32702）のpMSCV-のloxP-DsRedを - のloxP-3xHA-ピューロ-WPRE（32703）、およびのpMSCVからのレトロウイルスベクターを用いた場合にのみ有効であることに注意してください-FLIP-ピューロ-DsRedを-GFP-miRNAは（32704））とのCre-ERT2を表現オルガノイド。 </li></ol>感染およびexprの11の確認目的の遺伝子のession /抑制<ol><li> Addgene（32702、32703および32704）からのレトロウイルスベクターを使用している場合は形質導入効率は、DsRedの発現を観察することにより確認することができる。クーら 4に例示するようにさらに、目的の遺伝子の発現または抑制は、GFPまたは（遺伝子過剰発現用）3xHAエピトープおよび定量PCR（遺伝子ノックダウンのための）を使用して、ウエスタンブロットによって確認することができる。 </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871(2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。著者には利益相反が宣言されていません。

<html>高い形質導入効率を達成するために特定の側面は重要である。彼らは丸い嚢胞形状を採用するまで、一つはENRWntNicメディアとのオルガノイドの前処理である。これは、幹細胞の数とそれによって導入遺伝子の安定な組み込みを得る、ならびに形質導入​​手順を通じてSIのオルガノイドの生存率を増加させる機会を増大させる。別のパラメータは、スピノキュレーション以下のインキュベーション時間である。貧弱な形質導入効率およびオルガノイドの貧しい生存率の短すぎたり長すぎインキュベーションの結果であった。それは有意に形質導入​​オルガノイドの割合を増加させるが、スピノキュレーション工程は必須ではない。最後に、高力価のウイルスは、正常形質導入するためのキーである。これは、パッケージング細胞株およびウイルスの種類に依存する。プラチナ-E細胞株およびマウス幹細胞ウイルス（MSCV）の組み合わせは、オルガノイドの形質導入のための十分に高い力価を産生することが見出された。 ve_content &quot;&gt;以下は、成功した形質導入を達成することに役立つトラブルシューティングのためのヒントを紹介します。パッケージング細胞株のトランスフェクションが悪い場合、最初に細胞の密集度が70〜80％の間とのインキュベーション時間に確認してくださいプールされたPEI-DNA混合物を20〜30分の間にある。形質導入の際オルガノイドの生存は非常にフラグメントサイズに依存します。長すぎるトリプシン処理フラグメントの大半が3未満の細胞からなるさせ、それによってオルガノイド生存性を減少させます。もう一つの要因であるのWnt馴化培地の活性は、活性が低すぎる5μMの作業濃度にCHIR99021の添加を介して昇圧された場合は、生存率を増加させることができる。CHIR99021が増加Wntシグナル伝達をもたらす、GSK3を阻害し、さらに、Y-27362、これを防止オルガノイドが形質導入前にフラグメント（1-10個の細胞を含む）に破壊されているのでアノイキスは、オルガノイドバイバを向上させるために形質導入​​培地に添加されている。のよう60;スピノキュレーション後のインキュベーション時間が6時間を超えるべきではない、上記の。貧しい形質導入が認められた場合最後に、ウイルス力価及びレトロウイルスベクターインサートのサイズ制限に影響を与える前述の要因を考慮すべきである。ノックダウンの効率は、miRNAに大きく依存する。効率は、標的遺伝子とmiRNAの組み合わせに応じて変化するので、それが最も効果を発揮するものを同定するために効率スクリーニングを行う価値がある。 技術はオルガノイドシステムの上皮現象に限定されています。将来的には、それぞれ、免疫系に由来する成分と、病原体または再構成の共培養を介して感染性または免疫媒介性疾患を研究することが可能かもしれない。さらに、レトロウイルスは、比較的小さいサイズの挿入物を運ぶことができる。したがって、天然に存在する調節領域は除外されなければならないので、導入遺伝子の発現は、それを模倣することができない内因性遺伝子。上述したように、ノックダウン効率は、標的遺伝子およびmiRNAに依存している。適切なノックダウン効率とのmiRNAが見つからない場合には、その特定の標的遺伝子のための技術の使用を制限することができる。 理論的には、オルガノイドは、細胞株に使用されるすべての標準化された操作的な技術と互換性があります。レトロウイルス形質導入は、4に報告された最初の方法であったが、近年、BAC（細菌人工染色体）-transgenesis 5利用可能になった。 2〜3週間の総発電時間で、パッケージング細胞株へのウイルスプラスミドのトランスフェクション後に、トランスジェニック（TG）マウスの世代よりもかなり高速である。幹細胞ならびに腸上皮のすべての分化した細胞系統を含むながら、in vivoでの陰窩-絨毛アーキテクチャを維持することにより、オルガノイド培養系は、TG動物および以前に使用した細胞培養の間のギャップを埋める。 <pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt;プロトコルは、ここで説明するゲイン-と機能の研究の無損失を通じてin vitroで内胚葉上皮の表現型の解析を実行するための方法を提供する。これはtgマウスの最小限の必要性と、成体幹細胞生物学の生理学的に関連する問題に対処することが可能になります。例えば、条件付きノックアウトマウスの生成は周産期致死6新生児の変異体から誘導されるオルガノイドを使用することによって回避することができる。さらに、この技術は、追加のノックダウン7,8を行うことにより、パラログの役割を研究するために以前に確立されたノックアウトマウス由来のオルガノイドに適用することができる。 小腸オルガノイドの確立に続いて、元の培養プロトコルの適合は、膵臓、肝臓、大腸、胃上皮9-11の培養を可能にした。さらに、ヒトの腸オルガノイド及び腫瘍オルガノイドは、一次アデン、正常なヒトの生検に由来しているOMAおよび大腸癌生検10。ウイルス感染プロトコルを容易オルガノイドこれらのタイプに拡張し、ヒト由来の組織において機能的研究を行うの前例のない方法を提供することができる。 まとめると、小腸オルガノイドのレトロウイルス形質導入は、幹細胞の維持、分化、および細胞運命決定、ならびに細胞シグナル伝達および細胞 - 細胞相互作用を調べるための貴重な資源である。

ハイスループット機能遺伝学は、現在の基礎科学と医学を改善するために、身体の私たちの生物学的理解を高めるために必要とされる。マウス遺伝学、それは時間がかかり、コスト高でもあるが、in vivoでの遺伝子機能を調べるためのゴールドスタンダードとなっている。安価でありながら細胞株は、他の一般的な選択で、より高いスループット能力を有する。しかしながら、それらがインビボで見られる適切な微小環境、それにより生理学的応答を再現することができないことによって妨害されているため、コスト/時間効率の高スループット分析しばらくが容易なハンドルモデル系のための明白な必要性があるin vivoでのトランスジェニック（TG）マウスの実験で観察生理学的応答を模倣する。 内胚葉上皮そのようなモデル系では2009年1で登場しました。LGR5陽性腸管幹細胞の発見から得られた知識の中にあった幹細胞の維持に必要な細胞外マトリックスおよび成長因子に対応するニッチについての情報。この情報を利用することもオルガノイド2としても知られている「ミニ勇気を」確立することが可能になりました。最近オルガノイドが「enteroids」と呼ばれているインビトロ培養のためのコンセンサス命名法は、3示唆された。細胞株と同様に、オルガノイドは拡大を続けるとのリガンドおよび阻害剤で処理するのは簡単です。しかし、代わりに二次元であることから、それらは三次元自己組織化陰窩 - 絨毛組織を保持する構造体ならびに幹細胞および小腸（SI）の分化した細胞系統である。オルガノイドは、管腔領域を囲む上皮細胞の単層から成る。突出出芽構造は幹細胞区画を含む小腸の陰窩に相当する。前駆細胞は、それらマイルのように分化する出芽構造の先端から始まる最終分化細胞が内腔に流されている上皮内層に向かってすりおろす。細胞株と比較して、このエキソビボシステムは、より密接に正常な生理機能を再現し、したがって小腸上皮のための有望なモデル系である。 レトロウイルス形質導入のこのビデオプロトコルでは、この新規オルガノイド培養系でex vivo遺伝子機能研究を可能にする方法を提示する。私たちは、ステップ·バイ·ステップ方式でオルガノイド文化を記述することで起動し、導入手順が続くレトロウイルスの生成を実証することによって継続する。最後に、トラブルシューティングのための追加的なアドバイスをする部分があります。この技術の利点は、それが腸上皮に恒常性、細胞運命決定および細胞 - 細胞相互作用を研究するために、ライブイメージング又は薬物スクリーニングと組み合わせることができることである。それらの単純な構造と高速回転率に、オルガノイドは、理想的なモデルSを表す成体幹細胞生物学を研究するためのテム。さらに、レトロウイルス形質導入は、予め確立されたトランスジェニックマウスおよびヒト患者試料由来するオルガノイドに適用することができる。ノックイン及びノックアウトアプローチはヒトに拡張することはできませんように、ヒトのSIオルガノイドは、魅力的な代替を構成している。 要約すると、レトロウイルス形質導入による遺伝子操作が人間由来の組織での研究のための新たな道を開いている間に、それによって、マウスの遺伝学および細胞株を補完する、マウスまたはヒト組織サンプルから得られた小腸オルガノイドにおける表現型分析を可能にする。レトロウイルス形質導入はゲイン-可能にし、機能喪失研究は、オルガノイド培養系4で実行される。これは、リデュース（削減、洗練、および置換）に従ってながら、遺伝子の機能、成体幹細胞生物学および疾患を調べるための貴重な資源となる。

<table><tbody><tr><td>アドバンスドDMEM/F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-アセチルシステイン 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>マウス EGF 500 &micro;g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>マウス Noggin 100 & マイクロ;g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 馴化培地</td><td></td><td></td><td>馴化培地はHEK293細胞から生成され、詳細はSato and Clevers 2013を参照。</td></tr><tr><td>Wnt 馴化培地 馴化培</td><td></td><td></td><td>地はL細胞から生成されます(詳細については、Sato and Clevers 2013を参照してください)。</td></tr><tr><td>ニコチンアミド 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 & micro;M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン (8 & マイクロ;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>標準 BD マトリゲル基底マトリックス</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) AMSBIOが供給する代替物として使用できます。</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E cells</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

本質的な成長は、EGF、ノギン、およびインビトロで原発3D上皮構造の拡大を続ける文化に私たちを可能にする、R-スポンジンを要因とLGR5陽性幹細胞は補うことができる。どちらもオルガノイドと呼ばれるこれらの「ミニ·ガッツ」のアーキテクチャと生理学的特性は、密接にそれらのインビボの対応に似ている。これは、彼ら小腸上皮のための魅力的なモデル系になります。レトロウイルス形質導入を用いて、機能的な遺伝学は、現在、条件付き遺伝子の過剰発現またはノックダウンすることにより行うことができる。このビデオでは、オルガノイド文化、レトロウイルスの生成、およびin vitroでの小腸上皮の表現型分析を支援するオルガノイドのレトロウイルス形質導入の手順を示しています。レトロウイルス媒介性の遺伝子発現と組み合わせたこの小説器官型モデルシステムは、costlを必要とせずにin vitroでの遺伝子機能の迅速な分析のための貴重なツールを提供していますトランスジェニック動物のためのyおよび時間のかかる世代。

オルガノイドは、中央管腔が原因死細胞（ 図2）の存在のために暗くされたときに分割される準備ができている。前処理オルガノイドの2〜3日後のラウンド嚢胞の形態（ 図3）を採用する必要があります。これは、安定した組み込みを得る機会を高めること、幹細胞の数を増加させる。ウイルスペレットのサイズに起因ペレットサイズの細胞破片の変化の寄与に、ウイルス上清の遠心分離後の最も可能性を変化させることができる。形質導入効率に明確な相関関係が観察されていない。安定な組込みを有するものが残りますしながら、選択手順非形質導入オルガノイド中に、死んでしまう。 MSCV-eGFPのレトロウイルスからの蛍光タンパク質は、形質導入（ 図4）は、次の2〜3日以内に、嚢胞性形態を有するオルガノイドを、生き残っ由来の細胞で観察することができる。 <img alt> =「図1」のfo：コンテンツ幅= "6インチ" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg"幅= "600" /&gt; 図1。レトロウイルス形質導入手順の概略図。前に感染オルガノイドへは、前処理された彼らは、嚢胞性構造（ステップ1）を採用するまでENRWntNicを使用している。白金-E細胞は、パッケージング細胞株として用いられ、それらは70〜80％コンフルエントに達するまで培養する。その後、それらは、PEIを用いてレトロウイルス構築物でトランスフェクトする。ウイルスは、2日後（ステップ2）収穫する。オルガノイドは、1〜10細胞（ステップ3）を含有する断片を得るためにトリプシン処理され、次いで（ステップ4）を感染させる。感染効率（ステップ5）を大きくするピノキュレーションに続いて、感染したオルガノイド断片が播種される（ステップ6）、2-3日後に安定した統合を陽性クローンの選択を行うことができる（ステップ7）。 1765fig2highres.jpg "幅=" 500 "/&gt; 図2文化の4-6日後のオルガノイドの代表的なイメージが。ルーメンは、それが暗く見えること、死細胞で満たされている。この段階でオルガノイドを継代する準備ができました。 <img alt="静的平衡研究中の液体中の気泡の顕微鏡画像で、表面張力を実証します。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図3"> 3〜4日間ENRWntNic培地で培養小腸オルガノイドの図3。代表画像。オルガノイドは、嚢胞の形態を採用しています。 <img alt="細胞形態画像、明視野および蛍光顕微鏡、細胞構造解析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図4"> ウイルス性導入遺伝子発現（B、eGFPの）を示して小腸オルガノイドの図4。代表的なイメージは、（a）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ADVANCED DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> 4週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>グルタマックス100倍</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ヘペス1Mの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質100X </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic培地（20ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2"> 2週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 +++ </td><td> 7.2ミリリットル</td></tr><tr><td> B27サプリメント（50×） </td><td> 400μlの</td></tr><tr><td> N2サプリメント（100×） </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td>のn-アセチルシステイン（500ミリモル） </td><td> 50μlの</td></tr><tr><td>マウスEGF（500μg/ ml）を</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td>マウスノギン（100μg/ ml）を</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td> R-スポンジンコンディットionedメディア</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td>のWnt3a馴化培地</td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td>ニコチンアミド（1 M） </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td colspan="2"> 伝達媒体（20ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2">新鮮な準備</td></tr><tr><td> ENRWntNicメディア</td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td> Y-27632（10μM） </td><td> 20μlの</td></tr><tr><td>ポリブレン（8μg/ ml）を</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td colspan="2"> ENR培地（20ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2"> 4週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 +++ </td><td> 17.4ミリリットル</td></tr><tr><td> B27サプリメント（50×） </td><td> 400μlの</td></tr><tr><td> N2サプリメント（100×） </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td>のn-アセチルシステイン（500ミリモル） </td><td> 50μlの</td></tr><tr><td>マウスEGF（500μg/ ml）を</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td>マウスノギン（100μg/ ml）を</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td> R-スポンジン馴化培地</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2"> プラチナ-E細胞のための培地（500ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2"> 12週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>のDMEM </td><td> 449.45ミリリットル</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> 50ミリリットル</td></tr><tr><td>ピューロ（1μg/ ml）を</td><td> 50μlの</td></tr><tr><td>ブラストサイ（10μg/ ml）を</td><td> 500μlの</td></tr></tbody></table> プラチナ-E細胞のための高度なDMEM / F12 +++、ENRWntNicメディア、トランスダクション培地、ENR媒体及び媒体のため、表1のメディア組成物。

このプロトコルは、一次LGR5-高い正のオルガノイド文化やレトロウイルス形質導入のその後のパフォーマンスを説明しています。これは配信の導入遺伝子のCre誘導性過剰発現またはノックダウンを可能にし、機能的研究は、in vitro器官における新規で行うことができるようになり モデル系。

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

この手順の全体的な目標は、オルガノイドで機能的な遺伝学的研究を行う方法を実証することです。これは、まずオルガノイドをWINT 3 A含有培地で前処理することで達成され、嚢胞性形状の採用を容易にし、幹細胞の数を増やすことができます。第2ステップでは、ウイルスが産生され、オルガノイド断片が形質導入され、接種されます。最終ステップでは、トランスフェクションされたオルガノイドを着座させ、安定したウイルス統合のために選択します。最終的には、目的遺伝子の発現または抑制はGFP蛍光によって評価できます。マウスのような既存のALモデルよりもこの技術を使用する主な利点は、この技術を使用すると、腸オルガノイドを使用してin vitroで機能的な遺伝子実験を行うことができることです。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるアマンダ・アンドロです 陰窩を分離するには、予め冷やしたカルシウムとマグネシウムを含まないPBSで小腸を洗うことから始めます。次に、組織を3〜5センチの長さに切り、ハサミで縦に開きます。鉗子を使用して組織を広げ、カバースリップを使用して余分な絨毛をこすり落とし、次に、冷やしたPBSを含む50ミリリットルのチューブにピースを移します。激しく振とうしながら組織片を2〜3回洗浄し、最後の洗浄後にPBSが曇りにくくなるまでPBSを交換し、30ミリリットルのPBSを含む50ミリリットルのチューブで組織をインキュベートし、4°Cで摂氏4度のEDTAを補充しますチューブローラー。30分後、チューブを再度振って、組織を30ミリリットルのPBSを含む別の50ミリリットルのチューブに移し、5ミリモルのEDTAを補充します。1時間後、チューブローラー上で摂氏4度で激しくインキュベートします。チューブを再度振って、溶液を新しい50ミリリットルのチューブに移します。次に、50マイクロリットルで陰窩の数を数えます。50〜100個のクリプトを含むボリュームを計算して、1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、陰窩をスピンダウンし、ペレットを50マイクロリットルの地下マトリックスに再懸濁します。次に、陰窩溶液をPrewarm 24ウェルプレートに播種し、プレートを組織培養インキュベーターで5〜15分間インキュベートします。基底膜が重合したら、細胞培養インキュベーターでマトリックスを500マイクロリットルのENR培地とインキュベートします。着座後約24時間後に3日ごとに培地を更新すると、オルガノイドは小さな丸い嚢胞性形状を示します。さらに2〜3日後、オルガノイドが嚢胞性形態のシードを、150ミリメートルの皿に15〜18ミリリットルの培地に15〜18ミリリットルのPur、マイシン、ブラスチンを補給した状態で6つのプラチナE細胞に約5倍採用している間に、出芽構造が見えてきます。2〜3日後、培地を抗生物質を含まない培地に変更し、30マイクログラムのレトロウイルスDNAコンストラクトと240マイクロリットルのπを、それぞれ1ミリリットルの最適チューブを含む2つの個々のチューブに追加します。次に、チューブを混合し、室温でインキュベートします。5分後、2つの溶液をプールし、室温でさらに20〜30分間インキュベートします。完全な混合物を白金E細胞に加え、プレートを慎重に振とうして、DNA PI複合体が均等に分布するようにします。一晩インキュベーションした後、培地をリフレッシュし、細胞を再度インキュベートします。2日後、50ミリリットルのファルコンチューブに培地のみを採取し、0.45ミクロンのフィルターで濾します。次に、溶液を8,000倍Gおよび摂氏4度で12〜16時間遠心分離し、ペレットを250マイクロリットルの形質導入媒体に再懸濁します。レトロウイルス形質導入のためのオルガノイド断片を調製するには、まず200マイクロリットルのピペットチップで培養物を30〜50回ピペットでピペットし、オルガノイドを機械的に破壊すると、溶液が濁り、オルガノイド全体が検出されなくなります。フラグメントをスピンダウンした後、ペレットを500マイクロリットルの細胞培養物でインキュベートし、組換えプロテアーゼを摂氏37度で5分間グレードします。インキュベーション後、光学顕微鏡を使用してオルガノイド断片のサイズを評価し、断片あたりの細胞数をカウントします。次に、500マイクロリットルのENR培地を添加して解離プロセスを終了させ、細胞断片をスピンダウンします。上清を捨てた後、ペレットを氷の上に置き、フラグメントを48の1つのウェルに播種します。ウェルプレートを250マイクロリットルの予め調製したレトロウイルス溶液で調製します。細胞溶液を1ミリリットルのピペットチップで穏やかに混合し、次にプレートをparamで密封して、接種の最初の遠心分離を行います。48ウェルプレートをGの600倍、摂氏32度で1時間プレートします。次に、パラフィルムを慎重に除去し、プレートを細胞培養インキュベーターでさらに6時間インキュベートします。インキュベーション後、感染した断片を1.5ミリリットルのチューブに移します。次に、オルガノイドの断片を再度スピンダウンし、ペレットを氷の上で5分間冷やします。ペレットが冷えたら、チューブに100マイクロリットルの地下マトリックスを追加し、ペレットをゆっくりと上下にピペットで動かして再懸濁します。次に、フラグメントマトリックス懸濁液の50マイクロリットル滴を24ウェルプレートの各ウェルに播種し、プレートを摂氏37度で5〜15分間インキュベートします地下マトリックスが固まった後、オルガノイドをポリブレインのない形質導入培地でインキュベートします。2〜3日後、purマイシンを含む培地をウェルに加えて選択を開始します。フラグメントがオルガノイドを形成し始めたら、形質導入培地を補充したENR培地と交換します。プラムを使用すると、Mycinオルガノイドは、死んだ細胞の存在により中央の内腔が暗くなったときに分割する準備ができています。Wint 3 a培地の前処理を2〜3日続けた後、オルガノイドは嚢胞性の形態を取り入れ、幹細胞の数を増やし、幹細胞に安定して統合する可能性を高める必要があります。これらの画像では、形質導入後2〜3日以内に予想される嚢胞性形態を獲得した生存オルガノイドに由来する細胞で、M-S-C-V-E-G-F-Pレトロウイルスからの蛍光タンパク質発現が観察されます。この手順を試みる際には、オルガノイド断片のサイズを確認することが重要です。これは、オルガノイド断片の生存率に強く影響するためです。このビデオを見れば、オルガノイドのレトロウイルス形質導入の方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

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