Name: 心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶ マウス心臓からの心筋細胞分離とTATS膜ネットワークの蛍光顕微鏡解析法。心房・心室細胞の膜構造を定量的に比較し、心臓生理学と病態理解への応用を示します。

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この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (S.E.L. のサブプロジェクト A05 と B05) と KFO 155 (S.E.L. のサブプロジェクト 4) を通じて支援を受け、E.W. を支援する S.E.L. へのハルバッハ財団賞、E.W. を支援する German Cardiac Society からの助成金、そしてメリーランド大学での訪問者として T.K. を支援する DAAD 交換プログラムを受けました。これらの結果につながる研究は、欧州共同体の第7次フレームワークプログラムFP7/2007-2013から助成金契約No.HEALTH-F2-2009-241526、EUTrigTreat(SELへ)。S.E.L.は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK)の主任研究者です。

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
<li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li>
<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
<li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2%2B+signaling+during+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%2C+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

著者らは、利益相反は存在しないと宣言します。

心筋細胞を単離し、何十年も32のために研究されてきたが、最近のレビューは、一貫した高品質の筋細胞単離が27厳しい状況と結論付けた。これは、プライマリ心筋細胞の単離のための比較的複雑なプロトコル向かい合っ共通の標準的なアプローチの欠如、共有メタデータ、および透明セルの品質のドキュメントを反映している。細胞単離プロトコルは、通常、個別のグループによってカスタマイズされて、細胞は分離株の、変数結果をもたらす個別のモデルの設定（ 例えば 、種、年齢、共存する心臓の状態）に依存し、通常、特定の実験条件に合わせて調整されています。ここで紹介する定量的タッツ膜研究やプロトコルの文脈の中で、品質評価およびドキュメントの基本的なレベルは、代謝および分離プロトコルに依存した変化を起こしやすい個別の細胞膜構造の共焦点または超解像顕微鏡に関するもので、両方AMまたはVM内。重要なことは、細胞の単離物の高収量が健康無傷の心筋細胞を提案しても、研究者は、文書化し、批判的に起因する、異なるタイプに固有の変更に対する単離法への非特異的な損傷に対する表面とタッツ膜の完全性の形態学的基準に照らして慎重にそれぞれの個別のセルを判断する必要があります対照条件と比較して介入。心臓細胞単離の間の重要な変数は、指定されたコラゲナーゼのロットの特定の活動である。コラゲナーゼの新しいロットを選択するには、いくつかのコラゲナーゼの試料の酵素活性は、心筋細胞の収量と品質を評価し、製造者の指示に従ってによってお互いにテストする必要があります。理想的には、コラゲナーゼの新しいロットが前の正常に使用ロットに似コラゲナーゼ活性と同一視されている（可能な酵素活性の拡張評価のための材料および方法表中の「コラゲナーゼロット選択ツール」を参照してください）​​。 T一緒aken、タッツ膜の可視化の定量的アプローチは、細胞単離の品質と、その逆の、単離手順の重要なレビューと修正をトリガーするタッツ顕微鏡によって文書化されているように非特異的膜損傷につながる心臓細胞単離に決定的に依存している。細胞単離の品質とタッツ膜の可視化と定量化は本質的にリンクされているので、この記事で説明したプロトコルは、継続的な戦略として、すべての主要な側面をカバーしています。 新たな課題と心臓の研究の共通の課題、細胞の損傷および/ ​​または細胞の損失心筋梗塞9以下、代謝などの介入を損なうことに起因し発生し、まだ細胞単離の間見過ごされて空気塞栓以下、潜在的な偶発的な損傷などに対して判断する必要がある。病気の心臓から心筋細胞の単離は、追加、有意な細胞の損失につながると細胞収量を減少させたことがあります。したがって、comparは細胞の単離とカウントを一貫して標準化されたプロトコルを介して印加された場合の制御と疾患の心の間で分離された完全な細胞の総数のISONは、意味のあることができます。したがって、可能な限り最高の筋細胞単離の品質を反映した適切な対照群を介して、細胞の完全性を判断することが重要である。重要なことは、誤って単離手順によって損傷を受けた筋細胞に対する罹患対個体の細胞質および健康の生細胞の顕微鏡検査は、有意にタッツ膜ネットワークの分析に影響を与え得る。したがって、ここで紹介するプロトコルは、細胞単離と無傷の膜の生細胞顕微鏡検査の際に生理的な膜成分の整合性と安定性を重視しています。ワークフロー全体は、これらは、membran破砕膜細管状分離依存性膜のアーティファクトを示すことになることから、達成し、損傷した細胞を排除しながら、無傷タッツ膜成分を維持するために継続的な戦略として設計されていますEブレブ、および変更されたタッツネットワーク誤って制御条件の下で、さらなる定量分析を損なう。その逆に、同じ戦略はタッツ膜の変化との真の疾患細胞に対する真の健康な間で意味のある比較対照に決定的に依存しタッツ膜を、破壊する可能性を秘めた介入研究のために重要である。 さらに、当社は、AM細胞の技術的にはるかに困難な分離を実現するための手順に対応しています。進歩と改良されたプロトコルにもかかわらず、それがVMとのAM用としても信頼性の低い高品質の細胞単離を再現するのは簡単ではないことを強調することが重要である。これは、VM細胞の損傷の軽度の度合いが比較的高い細胞に細胞懸濁液中のあまり明らかであるかもしれないのに対し、細胞単離の間に、小さなエラーや変動が午前細胞単離の完全な故障につながる可能性があり、AM細胞の全体的に低い収量に起因している番号がAMと比較。 AM細胞は、cになる場合がありますのでステップ4.3の下で概説したように単離した後urved、いくつかのROIを通じて分析が有利であり得る。細胞単離ステップの詳細な手順に従うが、私たちは直接、内在性膜染色および共焦点またはVMとのAM用の両方タッツネットワークのSTEDの超解像イメージングのためのプロトコルを提供する。これらのプロトコルは、以前に確立されたパラメーターによってタッツ膜の選択成分の定量分析と分化の両方を可能にする。仮想マシンと比較すると、3次元組織とのAM心房タッツ·ネットワークの機能的な振る舞いは、現在、あまり理解されている。 生きた細胞の画像タッツ膜への手続きは、（3.1〜3.7ステップ）、市販の共焦点（材料/機器の表）と、カスタムメイドのSTED蛍光顕微鏡9を用いて開発された。蛍光画像生成および定量タッツ分析のための顕微鏡の設定を最適化するために、以下の点は、一般的な重要なものである： <ul><li> 客観的な </strオング&gt; タッツ膜構造、細胞内の深いいくつかのマイクロメーターを中心に目的は、最高の画質を提供し、経験的にテストの細部を解決するために。特定の共焦点顕微鏡は、ここで使用される63X 1.4 NA油対物レンズとは対照的に、水またはグリセロール目的に良好に機能することができる。 100X倍率に目的ナノメートル分解能34小さな視野のトレードオフ、超解像STED顕微鏡に使用されます。 </li><li> 励起とゲイン 励起パワーと検出器利得の最適な設定は、顕微鏡の光路、レーザ性能、およびサンプルの性質に依存する。理想的には、レーザパワーと利得検出器の全範囲を利用する、まだ画像の飽和を回避するように調整される。商業用顕微鏡のソフトウェアパッケージは、通常、ダイナミックレンジの下限と上限を視覚化ルックアップテーブルを提供する。また、可能な限り低いLを採用する色素漂白を最小限にするためにまだ十分な構造タッツ膜の詳細を提供ASERパワー。また、励起パワーは、筋細胞拘縮や死に至る累積光損傷を避けるために十分に低くなければならない。 </li><li> 画素サイズ ナイキストサンプリング、与えられた設定を使用して達成され、約半分の解像度と互換性のピクセルサイズを使用してください。共焦点イメージングのためには100nm×100程度の画素サイズはまた、漂白が制限され、互換性がある。超解像顕微鏡観察のために有意に小さい画素サイズは、STED顕微鏡9のために、例えば 、20ナノメートル×20程度使用される。 </li><li> 休止時間 共焦点顕微鏡は、平均化機能を提供する。一般に、シグナル平均化例と組み合わせて漂白を避けるために、可能な限り最短の画素滞留時間を使用して、ライン平均≥8は、信号対雑音比を改善する。 </li><li> メタデータを介して適用顕微鏡の設定を文書化 にどのように設定したらタッツ膜構造の画像の詳細は、特定の焦点顕微鏡上で安全に最適化されたおよび/または設定（プロトコルメタデータ）を文書化した。同じ目的、励起パワー、ゲイン、画素サイズ、画素滞留時間、および平均化機能を有する細胞の（または間）基（複数）内のすべての画像を取得する。イコール撮影条件は、細胞の（または間）基（複数）内の直接比較および定量を可能にします。 </li><li>一般的なガイダンスおよび共焦点顕微鏡の原理及び用途についての詳細は生物共焦点顕微鏡（ポウリーJB、第3版 、2006年、シュプリンガー·サイエンス+ビジネスメディア、LLC）のハンドブックを参照してください。 </li></ul>ここで紹介する直接分析戦略、タッツ膜および疾患に関連する変化を記述する先の刊行物とは対照的に、フーリエTRANSFに基づく定量的な戦略16,17、または間接的な地域戦略としてT管密度の地域的集約読み出しを使用していたT管コンポーネント規則7を評価するために、横紋膜シグナルのormation分析。これとは対照的に、ここで説明する定量的なアプローチは、直接個別のタッツコンポーネントに関連して、膜ネットワークのプロパティと、細管の割合のような特定のコンポーネントを含む、多くの追加パラメータを提供します。さらに、タッツネットワーク密度は、ROI面積当たりの全体の抽出骨格の正規化された長さとして定量化することができる。 3個体の三重接合の数、連続的に接続された細管のコンポーネントはタッツ膜網の分岐の複雑さの尺度として用いることができる。当社は、最小のタッツのコンポーネントのいずれかの分析は染色手順に依存していることに注意してください。われわれの経験では、50μMのジ- 8 - ANEPPS液800μlの50,000 VMセル9を含む細胞ペレットに完全タッツ網を染色するのに十分である。しかし、細胞ペレットは心筋細胞のより低い番号が含まれている場合、強力な蛍光検出器が利用可能である場合、および最小の膜の詳細および量的変化に関心があるのではなく、全体のタッツのネットワーク配信の共焦点イメージング、低い染料濃度は、経験的なテストに基づいて使用してもよいかどう。最後に、記載の分析用に書かれたソフトウェアマクロは異なる治療群（ 例えば 、薬物）、細胞型間の比較のために特に有用である大きなデータセットの分析を容易にする画像処理工程を自動化するために使用することができる（ 例えば 、VMに対するAM ）、および病態生理学的介入（ 例えば 、心筋梗塞に対する偽）。 タッツネットワークの画像分析のために、原則として以下の一連のステップが適用される：1）ローリングボール背景減算（4.5.1）は、バックグラウンド強度の空間的変動を除去すること; 2）局所的コントラスト強調（4.5.2）。 3）画像の平滑化（4.5.3）; 4）統計的な地域のマージ（4.5.4）; 5）を定義する画像2値化のしきい値（4.5.6）;および6）スケルトンデータの計算（4.5.8）。蛍光タッツ画像のスケルトン化の間の重要なステップは、 図6に示す画像2値化ある。関連する閾値化ステップは、最終的に真の膜構造は、バックグラウンドノイズからのエラーによって識別潜在的に誤った構造に対して、基礎となるタッツコンポーネントを表すために検出されるかを定義する。バイナリ画像解析のための正確な閾値の同定は、共焦点と超解像顕微鏡法のアプローチのための十分に高い信号対雑音（SNR）比それぞれに依存する真タッツ膜構造と対応すべきである。そのため、十分な画質が最初に確立し、続いて概説したように、明視野画像によるドキュメントを含む個別のセルの品質の重要な判断と組み合わせる必要がある。代替所与顕微鏡データ出力のための画像分割プロトコルを適応させるオプションおよび/または物理ポートiologicalの質問は、画像デコンボリューションとImageJのプラグインとして利用可能な「大津」や「磯·データ」のような他のしきい値処理手順を含む。かかわらず、最終的なセグメンテーション手順は、イメージオーバーレイによって抽出された生データとの比較必須の品質制御ステップを考える。要約すると、個別の単離された筋細胞、細胞内タッツ膜の十分な染色、蛍光イメージングのためのパラメータの最適化、及び抽出されたスケルトンデータのオーバレイ制御の形態学的および膜完全性は、全ての蛍光タッツ画像と定量結果の品質に貢献する。 マウスよりも大きな種は細胞単離のために使用される場合、プロトコルは、容易に適切に適合させることができる。次に大きな種については、ラットの心臓は鈍い14 Gカニューレ（外径2.1ミリメートル）でカニューレすることができ、/分8ミリリットルで灌流。大幅に古いまたは病気の心はさらに大きなカニューレのサイズが必要な場合があります。遺伝子で梅毒、心臓灌流は、リザーバと大動脈の間、または蠕動ポンプを用いて一定流量を1メートルの高さの水柱を使用して、一定の圧力、例えばいずれかによって行うことができる。コラゲナーゼ消化が最終的に一定流量プロトコルによってある程度制御される血管床を漏れるの過度の灌流速度につながる冠動脈抵抗血管が中断されているので、マウスやラット一定の流れのような小さな齧歯類の心からの細胞単離のために有利な場合がある。流速、正しい挿管の監視が変化した血管抵抗挙動による介入モデルに対するならびに細胞単離手順の訓練のために有利である優先度である場合とは対照的に、定圧潅流が有利である。 上記で概説したように、十分な細胞質は、内在性膜系の定量的研究のために非常に重要である。しかし、心臓の灌流およびコラゲナーゼ消化中に非常に多くの要因が、CRができるiticallyプロトコルの最適化やトラブル27を撮影中に過小評価してはならない細胞単離の品質に影響を与えます。特に、与えられたコラゲナーゼロットの活性は、研究の残りを通じて維持されるべき関心例えば 、心房又は単離条件を確立するために実験的な善意の研究の実行前に、心室の特定の組織のために決定されるべきである。また、灌流セットアップの水質、pH、温度、最適化、および洗浄は、汚染物質および塞栓から不注意による損傷のリスクを最小限にし、潜在的に追加の因子は、細胞単離の間に最適な恒常性の条件を確立するために監視されなければならない。 BDM（2,3 - ブタンジオン-モノオキシム）ミオシンの可逆的阻害剤のクロスブリッジATPアーゼは、一般に、細胞単離物の収率を増加させる心筋の弛緩を維持するために、組織の切開、消化中に使用される。それにもかかわらず、研究者らは、Tが必要ですO BDMはオフターゲット効果など 、一定の条件の下で33のNa + / Ca比2 +交換電流の阻害をもたらす非特異的ホスファターゼ活性を発揮し得ることに注意してください。いくつかの実験のために、心筋保護液、しかし、毒性、比較的高価であり、その他のオフターゲット効果を有することができるマイクロモル濃度でのミオシンに対して高い親和性を有する阻害剤としてブレビスタチンによってBDMを交換することが有利かもしれない。一休み健全な心筋細胞を、さらなる分析から除外すべき電気刺激およびそのような細胞の非存在下でのあらゆる収縮を示さないようにしてください。一方、生理的な細胞外Ca 2 +濃度における電気刺激に応答した心筋細胞の収縮と弛緩に、健康な対照に対する心臓疾患における機能性細胞質および/ ​​または異常な挙動を評価するための追加対策として、通常の収縮挙動を確立するために使用することができ細胞。 9タッツ膜ネットワークの共焦点と超解像顕微鏡に適用し、AMれた細胞21だけでなく、微小管ネットワークの定量分析固定された心筋細胞（データは示さず）。プロトコルのこれらのおよび将来のアプリケーションは、ドメイン固有のシグナリングを、異なる発生段階のタッツ膜の特性評価や高度に局在化を発揮するタッツネットワークに連絡して、膜関連タンパク質または細胞小器官の構造の解析などの実験さまざまな質問のための道を開くことがありますAMおよびVM細胞内で機能します。

健康的な横紋筋細胞では、メインセル軸に垂直な「横」配向（T管）を有する管状の膜構造が豊富である。したがって、T-細管深くセルの中心に向かって細胞質ゾルに侵入筋細胞メイン「横方向」表面膜（筋細胞膜）の連続的な拡張、として特徴付けられている。外表面膜を有する連続T管の生理的役割は、電位活性化L型Caのナノメートルの近接結合による比較的大きな心筋細胞の体積全体のSERオルガネラコンタクトドメインによって形成された遠隔細胞内区画の急速な電気的結合2+チャンネル隣接するリアノジン受容体（RyR2の）SERのCa 2 +放出を活性化電流（I Ca）の内向き（Cav1.2）。心室筋細胞（VMS）、接合部のSERドメインとTとの間の非連続膜に接触する（「ジャンクショ​​ン」）では、-tubulesは、各セル1に個別の細胞内Ca 2 +放出のナノドメインの数千を制御すると考えられている。 任意の連絡先ドメインでは、並置された膜部分T管と周辺（接合部）SERのそれぞれが、それ故にナノドメインとして定義され、互いに近接15nm程度である。これにより、非常に小さな個別の細胞質の部分空間は、準細胞自律的コンパートメントの動作を可能にする分離される。着信活動電位が作動すると、現在の内向きのVM、比較的小さいのCa 2 +の T管におけるCav1.2チャンネルが急速にattoliterサイズのナノドメイン1での[Ca 2 +]、Sの部分空間のCa 2 +濃度が増加します。次に、の[Ca 2 +] Sの増加は、並置されたSER膜接合にナノメートル近傍内のCa 2 + -gatedリアノジン受容体（RyR2の）を活性化し、この結合プロセスは、すべての電気的に結合を通して起こるd個の筋細胞ナノドメイン。 RyR2sは5-10のRyR2チャネル2用の1 Cav1.2チャネルの推定化学量論と同様に、高密度のマルチチャンネルクラスターを発生する。 SER対細胞質ゾル以来の[Ca 2 +]勾配は（比率10 4：1）非常に急峻で定量的に大規模な内CaのRyR2活性化の結果、およびRyR2s機能機能的に結合されたクラスタ内の高コンダクタンスのCa 2 +の放出チャンネル2 + T管からの放出電流は1〜2ミリ秒3,4内は100μM以上にローカル部分空間の[Ca 2 +] Sを増やす接合SERドメインを結合されている。この心臓信号増幅動作は、のCa 2 +誘発性のCa 2 +放出（CICR）と呼ばれる。まとめると、T管は急速に興奮収縮（EC）カップリングの間接合ナノドメインのSERの接点を介してのCa 2 +の放出信号を活性化し、細胞全体のCICR ​​不可欠膜構造である。 T-細管に加えて、軸方向の尿細管メイン（縦）細胞軸に有意差が平行な配向での（A-細管）は、電子顕微鏡（EM）、共焦点及び2光子顕微鏡研究によって実証されている。例えば、サルコメアのZラインに近いT管と相互接続筋原線維間に、尿細管の細胞全体の継続的な格子は、細胞外トレーサーと固定モルモットのVM 5のEMイメージングによって示された。細胞外デキストラン連動フルオレセイン染色を使用し、ラットVMの2光子イメージングを生きる、複雑な網状3D細管ネットワークは〜60％のT管と約40％のA-細管6からなる可視化した。本研究では、豊富なA-細管の3D可視化するだけでなく、EMの可視化のために、切片は、本質的に横軸細管システム（タッツ）のような複雑で動的な膜ネットワークの解析のために制限されているという認識につながっただけでなく、。したがって、直接ジ8 ANNEPSで染色タッツ膜の共焦点生細胞イメージングを開発した。生細胞の場合タッツネットワークは、フーリエ変換によって分析され、サルコメアZ-ライン近傍の空間におけるT-細管成分の定期的な外観は、横紋信号7の領域からのアンサンブルパワースペクトルによって反射される。この間接的な分析戦略は、疾患モデル7におけるタッツコンポーネントの規則でセル全体の地域の変化を検出するために使用されている。例えば、shRNAを仲介junctophilin-2のノックダウンは、心不全やアイソフォーム特異的なタンパク質欠損はナノドメインのCa 2 +の放出機能障害8とT管の再編成をもたらしました。私たちは最近、直接、定量的なアプローチを通じて、さらに誘導放出枯渇（STED）ナノスコピー9を用いて、マウスのVM内の個別タッツ·コンポーネントの生細胞の超解像顕微鏡によってタッツ膜ネットワークの解析を高めています。横の50:50分布に近似より小さい個別のタッツ·コンポーネントの直接分析のために許可されたナノメートル画像の解像度、アキシャル細管の向きに対して、定量的に健康なマウス心臓9内の2つの豊富な、まだ差別的指向の個別のタッツ·コンポーネントを確認した。これらの戦略は、さらに以下のプロトコルのセクションで説明されます。 成体心臓に豊富A-細管部品の生理的役割は謎のままであったが、EM研究は、モルモットとラットのVM 5,10において内因性のCa 2 +の放出ナノドメインを示唆し、細管に関連したSER膜構造を報告している。 Cav1.2及びRyR2の共焦点分析は、A-細管ジャンクション10で共局在度の高い発見した。 VMがT管は一般的に発生するZ線の条線から比較的離れて発信したラットに自発のCa 2 +スパークの〜20％以来、1番目の引数は、細管に関連するナノドメインが実際に存在し、機能し得ることであったのCa 2 +の放出サイトなど11,12。興味深いことに、T-細管形成及び成熟OCP5での前駆筋細胞膜陥入の萌芽と未熟を通じてのみ生後CURSおよび心臓細胞の増殖に匹敵する、 例えば 、マウス13でP10でタッツネットワークアセンブリを分岐した。これは、遅れたのCa 2 +放出および未熟A-細管支配のアーキテクチャと一致して病的なタッツ組織につながるSER接合部にT管膜の固着を防止するshRNAノックダウンするのでJunctophilin-2は生後タッツ·ネットワーク·成熟のために特に重要であると思われる仮想マシン13。これらの観察結果は、最終的には、概念実証T管の追加やさえ代替細胞内のメカニズム14を通じてモーフィングも、細管のに対し、膜陥入過程を通じて形成につながる可能性があります。 心臓病でのタッツの膜の変化の特徴付け病態生理学的な質問のための重要な研究領域となっています。ペーシング誘発性の心臓の犬モデルにおける初期のレポートfailu再T-細管およびCav1.2電流（I Ca）の 15の損失を示した。虚血性心筋症のブタモデルは、T管の密度の低下を示した、細胞内のCa減少同期は16をリリース2+。心不全の自然発症高血圧ラット（SHR）モデルを用いて、T管の損失は「孤立のRyR2」の提案されたメカニズムによってCav1.2及びRyR2の減少したナノドメイン結合と関連していた7。 T-細管の損失はまた、虚血性拡張型心筋症、および肥大型心筋症試料17からのヒトのVMに示されている。さらに、細管の増加は、ヒト拡張型心筋18の組織切片で報告された。心筋梗塞の後、私たちは、細管部品9の増加するとは対照的に、T管の有意な低下とマウスのVMにおけるタッツ再編の差動機構を示した。重要なことは、改良されたローカルの膜コントラストは、生細胞superreを通じて達成ソリューションSTED顕微鏡タッツネットワーク長の全体的な増加にA-細管の有意な増殖を示したと複雑9分岐直接的な測定を通じて、詳細な定量的な成分分析を可能にした。また、心筋梗塞19の後および心臓再同期療法が心房tachypacing誘起心不全20の犬にT管のリモデリングを逆転させる可能性があることをラットでのT管リモデリングを逆転得るよう運動トレーニングを示された。プロトコールに概説され、以下のセクションで結果としてまとめると、病気のヒトおよび動物のVMだけでなく、潜在的な治療的介入の両方の研究は間違いなく高品質の細胞単離手順や詳細な定量分析戦略の恩​​恵を受ける。 KATPチャネルのタッツの膜輸送は21アイソフォームに対するさらに、側面が最近実証されるように、心房メートルを考慮することが重要であるyocytes生物学的に明確なだけでなく、仮想マシンに対する比較心臓細胞モデルとして（AMS）。 T管は、最近羊と人間のAM 22に記載されていた。現在の証拠は、いくつかのT管は23羊と人間のような大型哺乳動物におけるではなく、小型げっ歯類、典型的には、AM細胞に存在し、ことを示唆している。仮想マシンとは対照的に、AMは細胞内のCa 2 +放出は、マークの空間的および時間的のCa 2 +の勾配23を生じる細胞の中心に向かって拡散により細胞表面を伝搬するから生じるように見える。この枠組みの中で、このような心房細動24などの一般的な病気の形態のための細胞内Ca 2 +シグナル伝達の不安定性の機構を解明することが重要と思われる。要約すると、健康で病気の心のために両方のAMとVM細胞単離、それぞれが一般的なプロトコルを採用している。十分な細胞品質の顕微鏡の資料によって判断されるように細胞の単離が適切に行われている場合にのみ、AMおよびVMサンプルはCAであるべき定量的タッツ分析のために前進rried。従って、以下のプロトコルのセクションでは、マウスまたは無傷タッツ膜を分析するために、生細胞顕微鏡に続く他の種から分離された高品質のセルに決定的に依存している。以前に指摘したように、タッツ膜の特性評価は、固定と準備アーティファクト6、浸透圧の変更に起因する膜の変化、および従来の光学顕微鏡9の分解能の限界のための傾向と挑戦的な研究領域である。私たちは、Ca 2 +イメージングとパッチクランプ用の細胞培養のためのラットのVMの人間のAMの単離のための最近の最先端のプロトコルが以前にこのジャーナル25,26に掲載されていることに注意してください。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Chemicals and Enzymes</td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>ウシウシ血清</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>SH30073</td><td>Triple 0.1 &micro;m滅菌ろ過。</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>21115</td><td>MQ水で1:10に希釈し、100 mM CaCl2 stock濃度を得る。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td><td>ご要望に応じて</td><td>酵素活性は、個々のコラゲナーゼバッチに依存します。コラゲナーゼIIおよびその他の酵素活性(カゼインーゼ、クロストリパイン、トリプシン)は、「コラゲナーゼロット選択ツール」で評価できます。コラゲナーゼの新規ロットごとに、細胞の収量と品質を個別に測定します。</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>カール・ロート、カールスルーエ、ドイツ</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>・ロテックスメディカ、トリッタウ、ドイツ</td><td>PZN-03862340</td><td>0.9% NaCl で希釈し、腹部の皮膚に皮下注射しました。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Forene 100% (V/V)</td><td>Abbott, Libertyville, IL, USA</td><td>B506</td><td>活性剤:イソフルラン、250 ml. 空気/酸素ディスペンサー器具で約2 Vol%を使用してください。</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (2 mg/ml)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>354232</td><td>ラミネート加工については、ステップ 2.1 で説明します。</td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ>&middot;6H2O</td><td>カール・ロス、カールスルーエ、ドイツ</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dyes</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ダルムシュタット, ドイツ</td><td>D-3167</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>T8154</td><td>トリパンブルーは、チップカット1 mlプラスチックピペットで細胞懸濁液と1:1に穏やかに混合し、ノイバウアーサイトメーターで細胞をカウントします。</td></tr><tr><td colspan="4">Langendorff Perfusion Setup</strong</td></tr><tr><td>>Circulation thermostat</td><td>Lauda, Lauda-K&ouml;nigshofen, Germany</td><td></td><td>Louch et al. (JMCC 2011)を参照されたい。灌流チューブのサーモスタットとバッファーを37°Cに加熱します。C使用の15分前。</td></tr><tr>蠕動ポンプ<td>VWR、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>224-2252</td>用<td>フレキシブルシリコンチューブタイゴン</td>チューブは<td>定期的に交換する必要があります。</td></tr><tr><td>サーモスタット用フレキシブルシリコンチューブタイゴン</td><td>VWR、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>228-4340</td><td></td></tr>加熱<tr><td>コイル周囲灌流チューブ</td><td>Rettberg、G&ouml;ttingen、ドイツ</td><td>カスタムメイド</td><td>の加熱コイルとチューブは、使用後にMQ水で完全に洗浄する必要があります。洗剤は使用しないでください。ガラス部品は定期的に浴槽に入れる必要があります&nbsp;10 mM NaOHで一晩。</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Ismatec, Wertheim, Germany</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>三方停止コック Discofix C Luer Lock 10 cm</td><td>Braun, Melsungen, Switzerland</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>三方停止コック Discofix 3SC</td><td>Braun, Melsungen, Switzerland</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</strong</td></tr><tr><td>>42 mm ガラスカバースリップ</td><td>メンツェル・グラウムル;サーモサイエンティフィック経由、シュヴェルテ、ドイツ</td><td>ご要望に応じて</td><td>厚さ 0.13-0.16 mm</td></tr><tr><td>カニューレ 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td><td>304432</td><td>~5 mmの長さにカットし、サンドペーパーで粗くします。</td></tr><tr><td>Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td><td>Menzel Gl&auml用カバースリップ;サーモサイエンティフィック経由のサービス、シュヴェルテ、ドイツ</td><td>リクエストに応じて</td><td>0.38-0.42 mm 厚さ</td></tr><tr><td>グレーフェ鉗子、0.5 mm チップ、わずかなカーブ</td><td>ファイン サイエンス ツール、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>カール ツァイス、イェーナ、ドイツ</td><td></td><td>63X 1.4 NA オイル対物レンズ</td></tr><tr><td>ノイバウアー改良型サイトメーター</td><td>Labor Optik、フリードリヒスドルフ、ドイツ</td><td>1100000</td><td>計数手順:計数チャンバーに付属のサイトメーターとカバースリップを70%エタノールで拭きます。カバースリップを計数室にそっと押し込み、2つのガラス面が接触し、ニュートンのリングが観察されるようにします。続いて、10-20 & マイクロ;Lセル懸濁液は、毛細管現象によって空隙に吸い込まれるカバースリップの端に塗布することができます。100 nlを反映するサイトメーターグリッドの正方形を使用して、無傷の筋細胞と欠損筋細胞をカウントします。サイトメーターに設けられた2番目のグリッドでカウント手順を繰り返します。元の細胞懸濁液中の細胞の密度を計算するには、希釈とカウントのショートカットを考慮します。</td></tr><tr><td>POC-R2イメージングチャンバー</td><td>Pecon、エルバッハ、ドイツ</td><td></td><td>細胞懸濁液量:800 & マイクロ;l;所望のめっき密度: ~1,000 AM および ~10,000 VM</td></tr><tr><td>スプリングはさみ、8 mm ブレード ストレート、鈍い</td><td>Fine Science Tools、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>学生 dumont #7 鉗子、inox</td><td>Fine Science Tools、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>学生用虹彩はさみ、湾曲、11.5 cm</td><td>Fine Science Tools、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>学生用虹彩はさみ、ストレート, 11.5 cm</td><td>Fine Science Tools, ハイデルベルク, ドイツ</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Student surcigal はさみ, ストレート, シャープ, 12 cm</td><td>Fine Science Tools, ハイデルベルク, ドイツ</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子, 1 x 2 歯, スリム, 10 cm</td><td>Fine Science Tools, ハイデルベルク, ドイツ</td><td>11023-10</td><td></td></tr></tbody></table>

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

心筋細胞では、膜細管の複雑なネットワークである横軸尿細管システム(TATS)が細胞内の深いシグナル伝達機能を制御しています。外面メンブレンと関連するTATSメンブレン成分は連続しているように見えますが、脂質とタンパク質の含有量には大きな違いがあります。心室筋細胞(VM)では、特定のTATS成分が非常に豊富に存在し、直線尿細管ネットワークと規則的な分岐3Dアーキテクチャに貢献しています。末梢のTATS成分は、細胞表面から数千の遠隔細胞内筋小胞体(SER)膜接触ドメインに活動電位を伝播し、それによって細胞内Ca2+放出単位(CRU)を活性化すると考えられています。VMとは対照的に、心房筋細胞(AM)におけるTATSメンブレンの組織化と機能的役割は大きく異なり、あまり理解されていません。まとめると、健康な筋細胞と罹患した筋細胞におけるTATS膜ネットワークの定量的な構造特性評価は、機能的な可塑性と病態生理学的再編成をよりよく理解するための重要な前提条件です。ここでは、生きているVMおよびAMにおけるTATS膜ネットワークの直接定量分析のためのプロトコルの戦略的な組み合わせを紹介します。このために、マウスVMおよび/またはAMの初代細胞単離には、TATSメンブレンの蛍光イメージングのための重要な品質管理ステップと直接膜染色プロトコルを伴います。共焦点または超解像TATS画像処理に最適化されたワークフローを使用して、TATSネットワークとそのコンポーネントの定量分析のために、二値化およびスケルトン化データが生成されます。これまでに発表された間接的な局所凝集画像解析戦略とは異なり、当社のプロトコルは、ハイスループットでオープンアクセスのソフトウェアツールにより、生きた筋細胞のTATS膜ネットワークの特定の成分を直接特性評価し、複雑な生理学的特性を導き出すことができます。要約すると、この組み合わせプロトコル戦略は、生理学的筋細胞の適応や疾患の変化、異なる心筋または骨格筋細胞の種類の比較、トランスジェニックモデルの表現型決定、および薬理学的または治療的介入における定量的なTATSネットワーク研究に容易に適用できます。

心筋細胞では、管状の膜構造は、細胞内のネットワークを形成している。私たちは、品質管理、最先端の蛍光顕微鏡用ii）の生細胞染色を含むマウスの心臓から心筋細胞のi）の単離のためのプロトコルを最適化について説明し、およびiii）直接画像解析は、コンポーネントの複雑さおよび細胞内膜の可塑性を定量化するネットワーク。

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

この手順の全体的な目標は、心房および心室筋細胞の尿細管膜ネットワークを分析することです。これは、まず成体マウスの心臓から心房筋細胞と心室筋細胞を単離することによって達成されます。第2ステップでは、横軸細管系またはtatsを無傷の生きた孤立した心筋細胞で染色します。次に、tats膜ネットワークを共焦点または代位蛍光顕微鏡で可視化し、ネットワークの構成要素を定量的に分析します。最終的には、異なる細胞タイプの膜ネットワーク間、または偽細胞群と治療群の違いは、定量的なタッツ画像解析によって明らかにすることができます。この細胞単離および解析技術の主な利点は、単離プロセスの包括的なワークフローにより、筋細胞の直接蛍光イメージングが可能になり、タッチメンブレンネットワークの定量的データ解析が可能になることです。この方法は、生きている健康な心筋細胞の複雑な膜ネットワークの組織化に関する洞察を得ることができますが、病気にかかった動物やトランスジェニック動物の筋細胞にも適用できます。このプロトコルの新規参入者は、高品質の心筋細胞の一貫した分離を達成するための追加の入門トレーニングと、技術を実行するための重要な前提条件の恩恵を受けます 筋細胞を分離するには、臓器摘出が可能になった直後に、摂氏37度の酸素化灌流バッファーで12週以上のマウスの心臓を灌流することから始めます。次に、摂氏37度の消化バッファーで心臓を8〜10分間観察し、組織消化の進行状況を監視して、見かけの心臓表面全体の不透明度、柔らかさ、酸性度を高めます。消化後、右心房付属器をそらし、心房心室弁のすぐ上の右心房を解剖します。左心房で解剖を続け、線維性弁装置を解剖して廃棄します。必要に応じて、左右の自由心室壁と中隔および小さな組織部分を解放して解剖を終了します。次に、2.5ミリリットルの消化緩衝液が入った60ミリのシャーレに心室組織全体を移し、次いで組織を約1ミリメートルの立方体に切断する。トランスファーピペットで組織片をゆっくりと食べ、心室筋細胞を穏やかに解離して単一細胞懸濁液にし、泡や液体ジェットの損傷を避けるように注意しました。次に、7.5ミリリットルのストップバッファーを細胞懸濁液に加えます。並行して、消化された心房組織を1ミリリットルの消化で約1ミリメートルの立方体に切断し、60ミリメートルのペトリ皿で緩衝し、次に今示したように心房筋細胞を穏やかに三分割します。機械的攪拌に続いて、4ミリリットルのストップバッファーを添加して、心房筋細胞懸濁液中の残留コラゲナーゼ活性を停止します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、残りの組織片を15秒間沈殿させてから、単離された筋細胞を仰臥位画分で回収します。1回の洗浄ステップの後、Resusは心房筋細胞を5ミリリットルの灌流緩衝液に穏やかに懸濁し、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに約10の1倍で3つの細胞アリコートに分割して、心室筋細胞のtat膜を染色します。まず、心房筋細胞に1.5ミリリットルの反応チューブを染み込ませて1.5ミリリットルの反応チューブを重力で8分間沈殿させ、どちらの細胞種についても室温でGの20倍で細胞を2分間廃棄する。次に、細胞ペレットが不必要に攪拌されないように注意しながら、仰臥位を慎重に取り除きます。次に、800マイクロリットルの膜特異的tyle色素色素8およびepsに細胞を穏やかに再懸濁し、暗所洗浄で15分間インキュベーションした後、直ちに筋細胞をイメージングチャンバー内のラミニン被覆カバースリップに移します。カバーは一度滑ると、1ミリリットルの灌流バッファーで覆います。中央の細胞内筋細胞切片のサンプル画像を撮影し、クロップ機能を使用してクロップウィンドウと最終ピクセルサイズを100 x 100ナノメートルに調整します。最終的なイメージング平面を選択するには、単一のイメージフレームを使用して、Z方向に最適なイメージング平面を手動で選択します。TAの膜ネットワークにtチューブとチューブの両方のコンポーネントが含まれており、焦点面で視覚的に明らかであることを確認します。典型的な細胞内イメージング面は、中心的な細胞内基準点として核を含み得ることに留意されたい。tats膜ネットワークとその成分を解析するには、適切な画像解析ソフトウェアを使用して画像ファイルを開きます。ポリゴン選択ツールを使用して、この画像に示すように、外面膜を除外し、tats膜ネットワークの細胞内部分を含めながら、関心領域を描きます。次に、edit コマンドと clear outside コマンドを使用して、選択した細胞内領域に tats ネットワークの細胞内膜部分のみが含まれ、表面膜の一部が含まれないように、選択した ROI を生成します。次に、[プロセス]をクリックして背景を減算し、ローリングボールの半径を5ピクセルに設定します。次に、プロセスを選択し、ローカルコントラストを強化します。また、ブロック サイズを 49 に、ヒストグラム ビンを 256 に、最大傾きを 3 に、マスクを none に設定します。プラグインの下の[処理]と[スムージング]をクリックし、[セグメンテーション]と[統計領域のマージ]を選択して、パラメーターをQ100に設定します。次に、[平均を表示]をクリックします。次に、画像の種類と 8 ビットを選択し、しきい値 40 から始めて、画像調整としきい値を選択します。しきい値の正しい選択は、特定のtats膜構造のみを生成し、バックグラウンドノイズによる偽陽性の信号を生成しないことに注意してください。次に、プラグインでスケルトンとスケルトン化された2D 3Dを選択し、スケルトン化された2D画像を採用ファイルとして保存します。次に、プラグインを再度選択し、スケルトン2D 3Dを分析して、スケルトン化された画像ファイルを分析して定量的なデータ出力を行います。次に、プルーニングサイクルの方法として「なし」を選択し、結果のデータテーブルが自動生成されることを確認します。次に、Fijiプラグインの方向性を使用して、スケルトン化された画像データから適切な税ネットワークコンポーネントの個々の向きを分析します。[方法] で [FURIER コンポーネント] を選択し、終了ビンを 180 に、ヒストグラムの開始をマイナス 45 度に設定します。最後に、表示テーブルを確認し、方向性ヒストグラムを生成します。この最初の図では、画像のX軸に垂直な横方向要素とx軸に平行な軸成分で構成される健康な心室筋細胞のタットの代表的なスケルトン化された画像が示されています方向性プラグインの適用により、ゼロ度で同等のピークを持つ心室タットの向きヒストグラムが得られます。 軸の比率を表し、90度で横方向を表します。対照的に、心房筋細胞のタットの代表的なスケルトン化された画像は、主に画像のX軸に平行な軸成分で構成されています。従って、対応する配向ヒストグラムは、軸方向のタッツ比率を表すゼロ度ビンの周囲に支配的なピークを示し、90度では小さなピークのみを示し、これは横方向のタッツ比率を表す。 この手順を試みる間、細胞単離後、イメージング中、そして最も重要なことにおいて、細胞単離後のすべてのステップで細胞の品質をチェックすることが重要である。 画像解析の直前。このビデオを見れば、複雑な膜構造、tesネットワーク、および潜在的に膜結合タンパク質がどのように完全に分化されているかを十分に理解できるはずです。成体の心筋細胞は、共焦点顕微鏡で画像化し、定量的に分析することができます。親油性膜の目、消化酵素、および感染性の可能性のある心臓病患者、EMを扱う作業は危険である可能性があり、これらの手順を実行する際には常に鉄皮保護などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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Bioengineering

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単離されたラット筋細胞におけるカルシウム(Ca2+)過渡測定とともに、サルコメア長検出による収縮機能の測定を説明する一連のプロトコルが提示されています。心不全の動物モデルでの研究へのこのアプローチの適用も含まれています。...

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

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心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

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