心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

この手順の全体的な目標は、心房および心室筋細胞の尿細管膜ネットワークを分析することです。これは、まず成体マウスの心臓から心房筋細胞と心室筋細胞を単離することによって達成されます。第2ステップでは、横軸細管系またはtatsを無傷の生きた孤立した心筋細胞で染色します。

次に、tats膜ネットワークを共焦点または代位蛍光顕微鏡で可視化し、ネットワークの構成要素を定量的に分析します。最終的には、異なる細胞タイプの膜ネットワーク間、または偽細胞群と治療群の違いは、定量的なタッツ画像解析によって明らかにすることができます。この細胞単離および解析技術の主な利点は、単離プロセスの包括的なワークフローにより、筋細胞の直接蛍光イメージングが可能になり、タッチメンブレンネットワークの定量的データ解析が可能になることです。

この方法は、生きている健康な心筋細胞の複雑な膜ネットワークの組織化に関する洞察を得ることができますが、病気にかかった動物やトランスジェニック動物の筋細胞にも適用できます。このプロトコルの新規参入者は、高品質の心筋細胞の一貫した分離を達成するための追加の入門トレーニングと、技術を実行するための重要な前提条件の恩恵を受けます 筋細胞を分離するには、臓器摘出が可能になった直後に、摂氏37度の酸素化灌流バッファーで12週以上のマウスの心臓を灌流することから始めます。次に、摂氏37度の消化バッファーで心臓を8〜10分間観察し、組織消化の進行状況を監視して、見かけの心臓表面全体の不透明度、柔らかさ、酸性度を高めます。

消化後、右心房付属器をそらし、心房心室弁のすぐ上の右心房を解剖します。左心房で解剖を続け、線維性弁装置を解剖して廃棄します。必要に応じて、左右の自由心室壁と中隔および小さな組織部分を解放して解剖を終了します。

次に、2.5ミリリットルの消化緩衝液が入った60ミリのシャーレに心室組織全体を移し、次いで組織を約1ミリメートルの立方体に切断する。トランスファーピペットで組織片をゆっくりと食べ、心室筋細胞を穏やかに解離して単一細胞懸濁液にし、泡や液体ジェットの損傷を避けるように注意しました。次に、7.5ミリリットルのストップバッファーを細胞懸濁液に加えます。

並行して、消化された心房組織を1ミリリットルの消化で約1ミリメートルの立方体に切断し、60ミリメートルのペトリ皿で緩衝し、次に今示したように心房筋細胞を穏やかに三分割します。機械的攪拌に続いて、4ミリリットルのストップバッファーを添加して、心房筋細胞懸濁液中の残留コラゲナーゼ活性を停止します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、残りの組織片を15秒間沈殿させてから、単離された筋細胞を仰臥位画分で回収します。

1回の洗浄ステップの後、Resusは心房筋細胞を5ミリリットルの灌流緩衝液に穏やかに懸濁し、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに約10の1倍で3つの細胞アリコートに分割して、心室筋細胞のtat膜を染色します。まず、心房筋細胞に1.5ミリリットルの反応チューブを染み込ませて1.5ミリリットルの反応チューブを重力で8分間沈殿させ、どちらの細胞種についても室温でGの20倍で細胞を2分間廃棄する。次に、細胞ペレットが不必要に攪拌されないように注意しながら、仰臥位を慎重に取り除きます。

次に、800マイクロリットルの膜特異的tyle色素色素8およびepsに細胞を穏やかに再懸濁し、暗所洗浄で15分間インキュベーションした後、直ちに筋細胞をイメージングチャンバー内のラミニン被覆カバースリップに移します。カバーは一度滑ると、1ミリリットルの灌流バッファーで覆います。中央の細胞内筋細胞切片のサンプル画像を撮影し、クロップ機能を使用してクロップウィンドウと最終ピクセルサイズを100 x 100ナノメートルに調整します。

最終的なイメージング平面を選択するには、単一のイメージフレームを使用して、Z方向に最適なイメージング平面を手動で選択します。TAの膜ネットワークにtチューブとチューブの両方のコンポーネントが含まれており、焦点面で視覚的に明らかであることを確認します。典型的な細胞内イメージング面は、中心的な細胞内基準点として核を含み得ることに留意されたい。

tats膜ネットワークとその成分を解析するには、適切な画像解析ソフトウェアを使用して画像ファイルを開きます。ポリゴン選択ツールを使用して、この画像に示すように、外面膜を除外し、tats膜ネットワークの細胞内部分を含めながら、関心領域を描きます。次に、edit コマンドと clear outside コマンドを使用して、選択した細胞内領域に tats ネットワークの細胞内膜部分のみが含まれ、表面膜の一部が含まれないように、選択した ROI を生成します。

次に、[プロセス]をクリックして背景を減算し、ローリングボールの半径を5ピクセルに設定します。次に、プロセスを選択し、ローカルコントラストを強化します。また、ブロック サイズを 49 に、ヒストグラム ビンを 256 に、最大傾きを 3 に、マスクを none に設定します。

プラグインの下の[処理]と[スムージング]をクリックし、[セグメンテーション]と[統計領域のマージ]を選択して、パラメーターをQ100に設定します。次に、[平均を表示]をクリックします。次に、画像の種類と 8 ビットを選択し、しきい値 40 から始めて、画像調整としきい値を選択します。

しきい値の正しい選択は、特定のtats膜構造のみを生成し、バックグラウンドノイズによる偽陽性の信号を生成しないことに注意してください。次に、プラグインでスケルトンとスケルトン化された2D 3Dを選択し、スケルトン化された2D画像を採用ファイルとして保存します。次に、プラグインを再度選択し、スケルトン2D 3Dを分析して、スケルトン化された画像ファイルを分析して定量的なデータ出力を行います。

次に、プルーニングサイクルの方法として「なし」を選択し、結果のデータテーブルが自動生成されることを確認します。次に、Fijiプラグインの方向性を使用して、スケルトン化された画像データから適切な税ネットワークコンポーネントの個々の向きを分析します。[方法] で [FURIER コンポーネント] を選択し、終了ビンを 180 に、ヒストグラムの開始をマイナス 45 度に設定します。

最後に、表示テーブルを確認し、方向性ヒストグラムを生成します。この最初の図では、画像のX軸に垂直な横方向要素とx軸に平行な軸成分で構成される健康な心室筋細胞のタットの代表的なスケルトン化された画像が示されています方向性プラグインの適用により、ゼロ度で同等のピークを持つ心室タットの向きヒストグラムが得られます。 軸の比率を表し、90度で横方向を表します。対照的に、心房筋細胞のタットの代表的なスケルトン化された画像は、主に画像のX軸に平行な軸成分で構成されています。

従って、対応する配向ヒストグラムは、軸方向のタッツ比率を表すゼロ度ビンの周囲に支配的なピークを示し、90度では小さなピークのみを示し、これは横方向のタッツ比率を表す。 この手順を試みる間、細胞単離後、イメージング中、そして最も重要なことにおいて、細胞単離後のすべてのステップで細胞の品質をチェックすることが重要である。 画像解析の直前。このビデオを見れば、複雑な膜構造、tesネットワーク、および潜在的に膜結合タンパク質がどのように完全に分化されているかを十分に理解できるはずです。成体の心筋細胞は、共焦点顕微鏡で画像化し、定量的に分析することができます。

親油性膜の目、消化酵素、および感染性の可能性のある心臓病患者、EMを扱う作業は危険である可能性があり、これらの手順を実行する際には常に鉄皮保護などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。