Name: ネズミ角膜移植：固体臓器移植の最も一般的な形態を研究するためのモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶマウス角膜移植モデルによる急性移植片拒絶反応の研究法。ドナー角膜摘出、縫合、混濁評価を通じて拒絶メカニズムを解明し、新規治療戦略の開発に貢献します。

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著者は、この技術に取り組み、完成させ、この研究室と他の研究室の両方で多くの原稿の生成に責任を負った多くの人々に感謝したいと思います。 この研究は、国立衛生研究所の助成金EY12707(PMS)と、失明を防ぐための研究から眼科への無制限の助成金によって支援されました。

注：この手順で使用するすべての動物は、ビジョンの研究のための協会と眼科文の眼科と視覚研究における動物の使用のためだけでなく、セントルイス大学で動物の監督委員会によって定めるガイドラインに従って扱われます。 注：すべての手術器具やソリューションは、目の微生物感染を制限するために手術前に滅菌される。これは、動物は、この手順のいくつかの痛みを経験しない間、我々は、鎮痛薬を使用しないことに留意すべきである。すべての鎮痛薬は、抗炎症性であり、角膜移植応答は、炎症を伴うため、系抗炎症薬の使用は、角膜移植不全に関与しているかの要因を決定する我々の能力を危うくするので、この理由による。 1.麻酔<ol style="margin-left: 40px;"><li>ケタミン（86mgのIP注射によって、全身麻酔下で、ドナーとレシピエントマウスを置きます。98ミリグラム/ kg）およびキシラジン（13.04 mg / kgを）。 </li><li>通常、時間に30分を要する作業中は麻酔下でレシピエントマウスにしてください。その結果、常に意識を取り戻すの兆候のためのマウスを監視します。 </li><li>動物は乾燥を防ぐために麻酔をかけた後に手術を受けることはありません目にpuralube軟膏を適用します。 </li></ol> 2。角膜移植<ol style="margin-left: 40px;"><li>ドナー角膜ボタンを取得する。 <ol><li>動物が完全に麻酔したら、1％トロピカミドおよび2.5％塩酸フェニレフリンの点眼剤のカップルの投与により十分な散瞳を達成。 </li><li>水平に頑丈な可動支持体の上に置かれ、ボード上のドナー動物の頭を置きます。目は操作全体を通して水平な位置にあることを保証するために、首全体でテープのストリップで頭を固定します。 </li><li>アウト、先端がメチルブルーで染色した直径2mmのトレフィンを使用して、中央角膜移植部位を裏打ちする。 </li><li>鋭利な刃で、角膜に浸透し、ドナー内皮および基盤となるレンズへの損傷の可能性を減らすためにそれを深めるために前房内にのHealonを注入する。 </li><li> vannasはさみを持つドナー移植片を切除し、使用するまでハンクス平衡塩溶液を含む皿に置く。 </li><li>ドナー移植片が除去された後、CO 2吸入によりドナーマウスを安楽死させる。 </li></ol></li><li>移植床の準備。 <ol><li>受信者に対して2.1.2を通じて、2.1.1で説明したのと同じ手順を繰り返します。 </li><li>直径1.5mmのトレフィンを使用して、受信者の移植部位を概説。 </li><li>鋭利な刃で、角膜に浸透し、下層のレンズへの損傷の可能性を低減することを深めて前房へのHealonを注入する。 </li><li> vannasはさみを使って受信者から概説し、中央の角膜のボタンを外して捨てる。 </li></ol></li><li>縫合移植<ol><li>受取人の角膜のベッドの上で移植ドナーの角膜を置きます。十分なのHealonは、レンズとの直接接触による損傷からドナー内皮細胞を保護するために、ドナー角膜の下にあることを確認してください。 </li><li>超微細な先端マイクロピンセットを使用して、その後オフネクタイ、受信者の側への完全な厚さの90％の深さを持つドナーを通じて、ドナー側に11-0ナイロン縫合糸の最初の一口を置く。 </li><li>角膜が所定の位置に固定されると、角膜は8~10総縫合糸を有し、ドナー角膜がしっかりと整列し、受信者の角膜の移植床に取り付けられるようにmidcardinal結節縫合を行う。 </li></ol></li><li>前房の深化<ol><li>前房内にHBSSまたは気泡を注入することによって前房を深め、静かにセルローススポンジで漏れのため、角膜移植片の完全性をチェック。 注：前房を改質することができない場合、cは確率が高い移植された角膜の将来の評価が非常に困難になり、また、潜在的ドナー角膜内皮機能不全、したがって、移植の失敗につながるataract。 </li></ol></li><li>最終的評価<ol><li>瞳孔が丸いと前房の深さが正常であることを決定するために、目を守ってください。 注：瞳孔が丸いされていない場合、これは、虹彩を縫合中に破損したため、移植片が技術的失敗と見なされていることを示します。 </li><li>目に抗生物質軟膏を適用します。オプション：7-0絹縫合糸で眼瞼を閉じます。 </li><li>彼らは完全に目を覚ましていると、その後個別に手術後2日以上のためにそれらを収容するまで、マウスを観察します。 </li></ol></li></ol> 3.抜糸<ol style="margin-left: 40px;"><li>上記のように、蓋縫合糸が使用されているような場合には、マウスを麻酔し、48時間後に蓋縫合糸を除去する。 </li><li>術後7日目のマウスを麻酔。 suturを削除ES角膜移植を確保。縫合糸が除去され、動物が完全に目覚めた後は、そのケージに戻す。 </li></ol> 4.臨床評価<ol style="margin-left: 40px;"><li> 、白内障（レンズの曇り）、前房出血（前房中の血液）、適切な深さではない前房、あるいは角膜のかなりの不透明度を含む処置合併症の兆候に目を調べます。 「妥協」として、これらの合併症を証明するものを考えてみましょうとCO 2吸入によってそれらを安楽死させる。 <ol><li>無麻酔のマウスのすべての検査を実行します。一方、目のより良いビューを有効にするために目をproptoseできるように、このようにしてマウスを拘束片手でマウスを保持する。観測が完了すると、そのケージに動物を返す。 </li></ol></li><li>治療群に不慣れでは角膜移植の兆候を2〜3回、週に移植した角膜を評価するオブザーバを持っている拒絶反応または角膜移植の失敗。手術用顕微鏡またはこれらの観​​察のための水平細隙灯生体顕微鏡のいずれかを使用します。 <ol><li>以下のようにスケールが定義されている0〜5のスケールを使用して不透明度毎に角膜を評価する。 <ol><li>不透明度の兆候を持っていないもの角膜0~10のスコアを割り当てます。 </li><li>最小限の表面的な不透明性を示すもの角膜にスコア1を割り当てます。 </li><li>マイルドで深い不透明度を表示しますが根底にある瞳と虹彩はまだ識別可能である角膜へ2のスコアを割り当てます。 </li><li>虹彩は、瞳孔の余白を除いて詳細に見ることができない、請求間質不透明度を表示角膜3のスコアを割り当てる。 </li><li>密な間質不透明度を表示しない根本的な構造は閲覧できない場合角膜に4のスコアを割り当てます。 </li><li>完全に覆い隠さ瞳孔と虹彩との完全な不透明度と集中的な間質浮腫を表示角膜に5のスコアを割り当てます。 </li></ol></li><li><html>また、これを達成するために1〜8の評価尺度を使用して、血管浸潤（新血管形成）の程度ごとに角膜を評価する4つの等しい四分円からなるとして角膜を表示​​し、これらの象限のそれぞれの中の血管の量を決定するその象限の広範な血管新生のために0（無血管）から2の範囲で得点。最終的な血管新生スコアを計算するために各象限から個々のスコアを追加します。 </li><li>彼らは5週間までの時点で連続する2つの観察のための3のスコアを持っているかのように急性拒絶された角膜を分類します。 </li><li>その角膜5週目で透明であったマウスを分類しますが&gt; 45日の時点で混濁を開発後期長期角膜同種移植片拒絶を受けたように、2つの連続した​​時点で3のスコアで、移植を投稿してください。移植片生存を分析するために、カプラン - マイヤー生存曲線を使用する。 </li></ol></li></ol>モデル5.操作中左：40px; &quot;&gt; <li>脾臓からの単一細胞の調製。 <ol><li>単一細胞を調製するため、第一のドナーマウスを安楽死させる。その後、脾臓を除去します。 </li><li>セルストレーナーに脾臓を置き、それを3ミリリットルのシリンジからシリンジプランジャを混乱させる。 </li><li>ハンクス平衡塩類溶液10mlに再懸濁細胞を洗ってください。 </li><li>細胞懸濁液10μlを削除し、0.4％トリパンの10μlに青追加し、混ぜる。血球計数器にそれを追加し、中央のグリッド内のセルを数える。チューブ内の細胞数は、細胞数×10 4×2（トリパンブルーで希釈係数）10（チューブ内の容積）×である。 </li></ol></li><li>前房内への注入。 <ol><li>前述のようにマウスを麻酔。 </li><li>解剖顕微鏡を使用して注射を行う。各房内注入のために、10 6 0.005ミリリットルボリューム内の脾臓細胞と33 Gの針を取り付け0.25ミリリットルのマイクロシリンジを使用しています。 注：その他の操作モデルの特定の因子が、同所角膜同種移植手術後の果たし得る役割を決定するためのいずれかのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する試薬で動物を処理することによって行うことができる。 </li></ol></li></ol>

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著者には競合する金銭的利益はありません。

ここで説明する角膜移植のマウスモデルは、因子が最良の拒絶15,17,18,20、26-30と角膜の受け入れ21-25両方に関連付けられているかを予測するモデルでのヒト角膜同種移植片拒絶を研究する研究者を可能に同種移植片。患者が治療又は予防のいずれか拒絶31のいずれかに局所または全身ステロイド治療を与えられたヒト角膜移植とは異なり、このモデルは、典型的には、そのような治療の非存在下での同種移植拒絶に関連するこれらの要因を決定するために使用される。通常、移植の30〜40日以内に起こる急性の角膜同種移植拒絶反応のためのモデルに加えて、我々はまた、マウスと後期の多くの機能を模倣で45日後に移植を生じるような拒絶反応の後期長期モデルを提示これまでの動物でモデル化されていない-termおよび慢性拒絶32,33。 T彼のモデルの強みは1つが、角膜同種移植の受け入れの比較的高速の責任だけでなく、角膜の同種移植失敗の最も責任あるメカニズムを決定され、様々なメカニズムを分析することができますということです。このモ...

角膜移植は、ヒトで行わ移植の最も成功したと一般的なタイプの一つです。この手術が行われる理由は、損傷、感染症1、または非感染性角膜疾患2の他の形態の結果である。アメリカのアイバンク協会からフィギュアは、46000の上には、（：restoresight.org/eye_banks/eye_banks.htmlでのWebサイトを参照してください）​​2011年に行われたことを示している。その成功の指標は、同種移植片、角膜1年間故障率10〜15％の範囲で5年での成功率が70％3-8を超えているということである。多くの研究が示したように、角膜の同種移植の成功は、直接目に免疫学的特権部位であるという事実に関連している。免疫特権部位として角膜の状態を担当する要因は、角膜内の両方血管およびリンパ管の欠如は、抗原提示細胞の相対的欠如、suppres角膜によって産生される因子を含むの免疫エフェクターfuntions 9-15、MHCの低発現は16抗原、およびFasLの17-20の発現。 しかし、成功のためのこれらの移植片を素因これらの要因にもかかわらず、それらは拒絶3-7を受けない。したがって、この拒絶反応を媒介するそれらのメカニズムを理解するだけでなく、拒絶反応を防止するために、様々な治療法をテストする非常に重要である。そのために、我々はここで、制御の実験環境での角膜移植を研究するために20年以上にわたって使用されている角膜移植のマウスモデルを記述する。移植応答が最終的な移植組織が ​​失敗したか成功したかどうかを決定する協調して働いて、さまざまな要因が関与するので、任意のインビトロモデルにおけるこれらの要因の重要性を理解することは不可能である。結果的に、無傷の動物を用いた研究が成功またはfailuどちらにとって重要などのような要因を決定するために必要とされている移植された組織の再。 動物の他の種は角膜移植を研究するために使用されてきたが、他の種を用いて比較した場合、マウスモデルは、いくつかの利点を有する。最初は、特定の遺伝子を発現するかまたは機能移植におけるより良い研究することができる特異的な免疫学的因子の発現を欠くように遺伝子標的化されたマウスの多くの株が存在することである。また、動物の多くの他の種は存在しないマウスに特異的な多くの試薬（因子を中和する組換え因子および抗体の両方）がある。これらの要因が存在するため、このモデルは、急性角膜の同種移植片の応答15、17,18,20 -29に関与し、関連する因子を同定するために広く使用されている。さらに、角膜移植に関与する因子の多くは、他の組織の移植において機能的であることが知られている。

<table><tbody><tr><td>ツァイス手術用顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>再構築</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>3 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vannus はさみ</td><td>Stortz</td><td>E-3387</td><td></td></tr><tr><td>11-0 縫合糸</td><td>アルコン</td><td>717939M</td><td></td></tr><tr><td>トレフィン 2.0 mm</td><td>Katena</td><td>K 2-7520</td><td></td></tr><tr><td>トレフィン 1.5 mm</td><td>Katena</td><td>K 2-7510</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン 塩酸塩 0.5%</td> <td>アルコン</td><td>NDC 0065-0741-12</td><td></td></tr><tr><td>ヒーロン</td><td>アボット</td><td>ヒーロン OVD</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>7-0 縫合糸</td><td>アルコン</td><td>8065</td><td></td></tr><tr><td>2.5% フェニレフリン HCl</td><td>アルコン</td><td>NDC 61314-342-02</td><td></td></tr><tr><td>1%トロピカミド</td><td>バウシュ&Lomb</td><td>NDC-24208-585-59</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>ハミルトン</td><td>7654-01</td><td></td></tr><tr><td>33ゲージ針</td><td>ハミルトン</td><td>90033</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー(100 &mu;mナイロン)</td><td>BDファルコン</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Cardinal Health</td><td>B3175</td><td></td></tr>トリ<tr><td>パンブルー</td><td>シグマ</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

ネズミ角膜移植：固体臓器移植の最も一般的な形態を研究するためのモデル

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

角膜移植は、米国で最も一般的な臓器移植の形態であり、毎年45,000件から55,000件の手術が行われています。 この手順にはいくつかの動物モデルが存在し、マウスが最も一般的に使用される種です。 マウスを使用する理由は、この種を使用する際の相対的なコスト、免疫応答の研究を可能にする多くの遺伝的に定義された系統の存在、およびこの種の応答をさらに定義するために使用できる広範な試薬の存在です。 このモデルは、免疫抑制療法がない場合に角膜同種移植片が急性拒絶反応を生き残ることを可能にする、この組織の相対的な免疫特権状態に関与する角膜の因子を定義するために使用されています。 また、そのような同種移植片の拒絶において最も重要な要因を定義するためにも使用されてきました。 したがって、角膜同種移植片の受け入れと拒絶の両方のメカニズムに関して私たちが知っていることの多くは、角膜移植のマウスモデルを使用した研究によるものです。 急性角膜同種移植片拒絶反応のモデルを説明するだけでなく、後期角膜同種移植片拒絶反応のモデルを初めて提示します。

角膜移植のマウスモデルが正常角膜同種移植片拒絶19-23と角膜同種移植の受け入れ13、15,16,18、24-27両方のメカニズムを特徴づけるために20年以上にわたって使用されてきた。このモデルは、FasLのを欠く動物は、角膜の同種移植片15を受け入れることができなかったという点で、角膜の同種移植片の受け入れにFasL発現の重要性を確立するために使用した。また、血管内皮増殖因子受容体1モルホリノ処置は、角膜移植片生存28を増加させることを実証するために使用されてきた。コルチコステロイドは、任意の治療上の利点29を開催して、非常に最近の報告では、このモデルは、角膜移植の前にマウスの前処理かどうかをテストするために使用された。著者らは、このような前処理は、角膜の同種移植片29の生存率を改善したことを示した。これらのレポートは明らかにこのモデルの主な利点があることであることを実証1は、生きている動物にヒトで角膜移植の成功にとって重要であると考えられているそれらのものを学ぶことができます。 <...

マウスは、角膜移植を含む多くの移植形態を研究するためのモデルとして使用されてきました。 このレポートでは、急性および後期の角膜移植の両方のマウスモデルについて説明します。

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

次の手順の全体的な目標は、急性角膜同種移植片拒絶反応のモデルを導入することです。これは、最初にドナーの角膜を切除することによって達成されます。手順の次のステップは、レシピエントグラフトベッドを準備し、ドナーの角膜を所定の位置に縫合することです。次に、グラフトの完全性がテストされ、漏れがない場合は、まぶたを縫合して閉じます。1週間後、角膜移植片の混濁を評価して、同種移植片の拒絶反応を測定します。最終的に、このモデルは、固形臓器移植の同種移植拒絶反応に関連する最も重要な要因を定義するために、さまざまな治療戦略をテストできます。角膜移植は、米国で最も一般的です。この手順に使用できる動物モデルはいくつかありますが、マウスが最も一般的に使用されます。このモデルは、角膜移植の拒絶反応と受容の両方を含む要因を定義するために使用されてきました。ドナーマウスとレシピエントマウスに麻酔をかけ、つま先つまみで麻酔状態を確認した後、手術を受けていない眼に純粋な潤滑油軟膏を塗布します。次に、首を横切るテープのストリップを使用して、ドナーの目を頑丈で可動式のサポートに対して水平にして頭を固定します。次に、先端をメチルブルーに染めた直径2mmのタインを使用して、角膜中央移植部位の輪郭を描きます。次に、15度の眼科用ナイフブレードで角膜を貫通し、下にあるレンズの損傷を防ぎます。粘弾性溶液を前房に注入して、チャンバーが深くなるようにします。次に、ヴェネツィアのはさみでドナーグラフトを切除し、グラフトを氷上のHBSSの皿に移し、マドレスを達成するために使用するまで、レシピエントの目に1%tpicエイドと2.5%エフリン塩酸塩を数滴投与します。次に、前述のように1.5ミリメートルのタインを使用して移植部位の輪郭を描き、15度の眼科用ナイフブレードを使用して角膜を貫通し、粘弾性溶液を前房に注入して深くします。ドナー角膜と水晶体との間のスペースを維持するために、これにより、下にある水晶体とドナー内皮が損傷する可能性が減少します。ヴェネツィアのはさみで、輪郭が描かれた中央の角膜ボタンを受取人から取り外して廃棄します。角膜ボタンを取り外して空いた領域に粘弾性媒体を追加し、レンズとの直接接触による損傷から角膜内皮細胞を保護します。次に、超微細先端のマイクロ鉗子を使用して、ドナーの角膜を移植ベッドの上に置きます。11.0ナイロン縫合糸の最初のバイトをドナー側に、ドナー角膜を通して全体の厚さの約90%まで配置します。次に、同じ深さでレシピエント側に移動し、次に結びます。移植した角膜を、中央の枢機卿の中断縫合糸を使用して固定し続けます。必要な縫合糸は合計8〜10本です。次に、生理食塩水を注入して前房を改革して洗浄します。あるいは、前房に空気を注入して再形成します。注入後、セルローススポンジを使用してグラフトの完全性を穏やかにテストします。最後に、目を評価します。瞳孔が丸いかどうか、および前房が正常に見えるかどうかを判断します。移植片が良好に見える場合は、抗生物質軟膏を塗布し、必要に応じて術後にランニング7.0シルク縫合糸でまぶたを閉じます。マウスが完全に目覚めるまでマウスを監視し、その後、ホームケージで2日間観察を続けます。手術後4〜7日の間に麻酔をかけたマウスから縫合糸を取り出します。縫合糸を抜いた後、マウスを数日間観察します。不透明度スケールを使用して、すべての角膜を0から5のスコアで評価します。ゼロは不透明度がないことを示します。スコア 1 は、表面的な不透明度が最小であることに対応します。スコア2は、軽度から深い不透明度を示し、その下に識別可能な瞳孔があることを示します。そして、虹彩は、瞳孔の縁を除いて虹彩が詳細に見ることができない間質混濁を伴う角膜に3のスコアの兆候です。密集した間質混濁があり、基礎となる構造が見られない場合は、グラフトに4のスコアを与えます。もし、集中的な間質浮腫を伴う完全な混濁があり、瞳孔と虹彩の両方が完全に隠されている場合、移植片に5点をつけてください。テキストプロトコルは、血管浸潤のスケールを0から8にすることも示唆しています。グラフトモデルを使用して、さまざまな操作を行うことができます。例えば、脾臓細胞は、ドナーマウスから前房に追加することができる。ドナーが安楽死させられた後、脾臓を取り出し、3ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して細胞ストレーナーに移し、脾臓を破壊し、次に脾臓細胞を10ミリリットルのHBSSで洗浄し、洗浄した細胞を10ミリリットルのHBSSに再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞をカウントします。細胞は、後で使用するまで室温に保ちます。角膜移植を行う前に、解剖顕微鏡を使用して対側眼の前房に細胞を注入し、33 ゲージの針から 5 マイクロリットルの HBSS に 100 万個の脾臓細胞を注入します。このモデルは、ドナー角膜同種移植片によって発現される同種抗原に対する全身性同種抗原T細胞耐性が移植片の生存を改善するかどうかをテストするために使用されました。BCマウスは、B10脾臓細胞を前房に注入することにより、C57黒10アロ抗原に寛容化した。これは角膜同種移植片の受容を改善しませんでした。研究によると、DTH応答によって測定される同種抗原に対する抗原特異的耐性の確立は、皮膚または角膜同種移植片の結果に影響を与えないことが示されています。同様の研究では、BAB cマウスでB 10アロ抗原に対するDTH耐性が確立された場合、B 10アロ抗原の一部または全部を温存する皮膚移植片は生存率を増加させなかったことが示されました。したがって、抗原特異的DTHが確立された腸Cは、角膜または皮膚の同種移植片から測定可能なほど有益ではありませんでした。今日の実験からわかるように、角膜移植は技術的に難しい手順です。ただし、これは、グラフの成功または失敗を決定する細胞と要因を研究するのに最適なモデルです。

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