母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するためにサッカロマイセス·セレビシエ

次の実験の全体的な目標は、replicativeの増加に伴う突然変異頻度の変化かどうかを判断することです。酵母細胞の年齢は、単に細胞分裂の追加ラウンドまたは突然変異の蓄積速度の年齢特異的な変化によるものです。これは、まず、細胞を選択培地と非選択培地に広げて若い細胞の突然変異頻度と突然変異率を測定し、細胞分裂の各ラウンドで突然変異の蓄積により年齢が増加する細胞の予測突然変異頻度を計算することによって達成されます。

次に、酵母細胞集団を液状培養液で増殖させたビオチンで標識し、元の標識細胞を磁気選別により回収し、数回の細胞分裂を経た老化した母細胞を得ます。次いで、老化した母細胞を、それらの年齢を増加させるために再増殖させ、次いで、再度選別するか、または突合せ瘢痕について染色し、次いで、それらの平均複製年齢および突然変異頻度を決定するために、選択的および非選択的培地上に広げる結果が得られる。その結果は、実験的に観察された突然変異頻度と、その細胞の予測突然変異頻度との比較に基づいて、蓄積する突然変異に年齢特異的な増加または減少があるかどうかを示す結果が得られる。観察された平均年齢。この方法は、遺伝的損傷の蓄積速度の変化が正常な老化に寄与しているのか、それとも突然変異率の変化が一因となって、さまざまな遺伝的要因や環境要因の寿命を変化させる影響なのかなど、老化の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるメリッサ・パターソンで、標準培養条件下で増殖した細胞の変動試験を使用して、細胞世代ごとのベースライン突然変異率を確立するために。各複製培養について、細胞を1〜2000個希釈し、1〜4マイクロリットルを非選択的培地に広げて、ミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定します。残りの細胞を2, 400Gでマイクロ遠心分離機で1分間ペレット化し、100マイクロリットルの水を使用して再懸濁してから、選択的培地に広げて変異体を同定します。

プレートを摂氏30度で3日間インキュベートした後、コロニーをカウントし、ビオチンでチャーミーCCIを標識する添付のテキストプロトコルに従って初期突然変異率および頻度を決定するまず、グリセロールストックからYPD培地に培養物をストリークし、摂氏30度で1〜3日間インキュベートする。滅菌ピペットチップを使用して、プレートから細胞を少なくとも1ミリリットルの水に移します。縞の密集した部分の1〜1.5センチメートルが8つの細胞に約10を与えることを覚えておいてください。

ヘモサイトメーターを使用して、各菌株または治療条件の正確な細胞密度を決定します。5ミリモルのビオチン試薬ストックを使用して、メーカーの標準的な手順に従って、収集ポイントごとに10個を8個の細胞に標識します。最終洗浄後、すべての遠心分離ステップを摂氏4度で5分間実行します。

水を使用して標識細胞を最終濃度10〜8細胞/ミリリットルに懸濁し、細胞生存率を確認し、10マイクロリットルの細胞を23マイクロリットルの水と67マイクロリットルの0.4%トライアムブルーで希釈し、1つのXPBSで細胞を室温で40分間インキュベートしてから、ヘモサイトメーターを使用して生細胞または未染色細胞、死細胞または染色細胞をスコアリングします。細胞の年齢と突然変異の頻度のベースライン値を測定した後、テキストプロトコルに従って、ビオチンで標識した細胞を20ミリリットルのYPD培地に移します。8つのセルのふりをします。

20°Cで16〜18時間培養物を1ミリリットルあたり約10〜8セルまで成長させます。細胞が固定相に到達しないようにし、必要に応じて、細胞を摂氏4度に数時間保ち、成長期間と収集のタイミングを最適化します。細胞密度を決定し、細胞を摂氏4度でペレット化した後、30ミリリットルのビーズ標識、バッファー、ボルテックスを加えて細胞を洗浄し、懸濁液を回転させて上清を注ぎます。

2回目の洗浄後、細胞を50マイクロリットルのビーズ標識緩衝液に懸濁します。ボルテックスによって合計8つのセルのふりをします。2マイクロリットルの磁気ビーズを追加し、合計8つの細胞のふりをし、ボルテックスした後、氷上で10分間インキュベートし、定期的に反転させます。

次に、30ミリリットルのビーズ標識緩衝液を使用して、細胞を3回洗浄します。次に、0.5ミリリットルのビーズラベリングバッファーを追加します。合計8つの細胞のふりをして、細胞が再懸濁されるまで、ペレットを培地の設定で短時間ボルテックスします。

懸濁液を40ミクロンのセルストレーナーに通して50ミリリットルのチューブに注ぎ、残っている細胞塊を取り除きます。必要に応じて、カラムにロードする前に、セルを氷上に1〜2時間放置します。磁気カラムについては、メーカーが推奨するプロトコルに従って、10の2倍から合計9個のセルを使用します。

カラムをロードするときはエアラブルを取り外し、洗浄の合間にセパレーターのカラムを取り外して交換し、細胞がビーズの間に閉じ込められるのを防ぐように注意してください。同じサンプルの複数のカラムを処理するためにマルチカラムセパレーターを使用する場合は、それらをすべて同じコレクションチューブに溶出して、処理時間を短縮し、必要に応じて細胞の損失を減らします。母細胞が産生した若い細胞を3000Gで4°Cで5分間遠心分離し、1ミリリットルを除くすべての緩衝液を吸引して、母細胞が産生した若い細胞を分析するための結合および洗浄ステップからのフロースルーを保存します。

8つの元のビオチン標識細胞のふりをします。次に、一時的にボルテックスして、残りのバッファー内のセルを懸濁します。Triam Blueを使用して希釈した細胞のアリコートを染色し、ヘモサイトメーターを使用して細胞密度と生存率を測定します。

次に、回復したセルの総数を計算します。細胞数が予想よりも大幅に多い場合は、溶出サンプルを別のカラムに通して、汚染された若い細胞の除去を試みます。セルの数が予想よりも大幅に少ない場合は、保存されたフローを通過させます。

必要に応じて、別のカラムでサンプリングし、母細胞の収量を改善しようとします。細胞を再増殖させて複製年齢を延ばし、ビオチン標識なしでビーズの標識と選別に従います。反復年齢を決定するには、回収された細胞の25マイクロリットルを1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移し、1ミリリットルのXPBSを使用して細胞を2回洗浄し、細胞表面の芽の傷跡を標識します。

180マイクロリットルの1つのXPBSと20マイクロリットルの蛍光標識WGAを使用して細胞を再懸濁し、1.5ミリリットルの遠心分離チューブをホイルで覆い、インキュベーション後30分間、摂氏30度で穏やかに揺さぶってインキュベートします。1つのXPBSを使用して細胞を3回洗浄します。次に、蛍光顕微鏡検査では、Antifa試薬を使用して細胞をスライド上にマウントし、イメージング中の細胞の動きを回避します。

スライドを暗闇で最大数日間完全に硬化させます。サンプルあたり少なくとも50個の細胞の芽の傷跡をカウントして、細胞年齢の代表的な測定値を取得します。あるいは、1つのXPBSに細胞を懸濁した後、Y軸上の顕微鏡でカウントされた若年細胞および老化細胞の芽傷跡のテキストプロトコルグラフに概説されている設定を使用してフローサイトメトリーを実行します。

最後に、この関係の線形トレンドラインの方程式を取得します その後の代用では、WGAの正規化された幾何平均が方程式のXの細胞集団の蛍光強度を共役し、Yを解いてサンプルの平均細胞年齢を決定します。このグラフは、1つの遺伝子の突然変異率がビオチン標識の前後で類似していたことを示しています 独立した若い酵母集団では、20°Cまたは30°Cで増殖した場合、ビオチン標識の前後で若い細胞でも突然変異頻度が類似していました。ここに示すグラフは、ビオチン標識後に回収された細胞をカウントし、未処理の細胞または最初のソーティング後に1ミリモルの過酸化水素で処理した細胞を選別した場合に観察される可能性のあることを示しています。

最初のソーティング後に細胞の数が予想よりも多く表示される場合があり、ソーティングを続けると細胞がわずかに進行的に失われることが予想されます。複製年齢は、この図に示すように、蛍光標識されたが、細胞上の瘢痕を手動でカウントすることによって決定されました。フローサイトメトリーからの蛍光性ではあるが瘢痕シグナルを手動カウントと比較し、母親細胞集団とコントロール細胞集団の複製年齢をフローサイトメトリーによって決定できる線形関係を得ました。

これらのグラフは、母細胞の平均年齢と若年細胞集団について得られた突然変異頻度と突然変異率から計算された予測頻度と比較して、老化母細胞の観察された突然変異頻度が類似または上昇した例を示しています。ゲノムのゲノム位置に応じて、この手順に従うことができます 1つの遺伝子。活性酸素種や円形の形態の染色など、他の方法を使用して、細胞生理学のどのような変化が突然変異蓄積の加齢に伴う変化に関連しているかなどの追加の質問に答えることができます。