Name: 母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するためにサッカロマイセス·セレビシエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぶ磁気ソーティングと変動試験を組み合わせたSaccharomyces cerevisiaeの有糸分裂細胞老化におけるゲノム不安定性の分析方法。この手法により、細胞分裂と年齢特異的変異蓄積の違いを解明できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、この記事の内容は、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を反映するものではないPHMに国立衛生研究所の国立老化研究所からの助成金R00AG031911によって部分的にサポートされていました。

メディアアンドソリューションズの調製<ol><li>酵母エキス - ペプトン - グルコース（YPD）標準プロトコルのための富栄養培地を用いて細胞を成長させる。 2％バクトペプトン、1％酵母エキス、YPD培地、2％グルコース溶液を調製し、固形培地19、2％バクト寒天を追加する。滅菌するオートクレーブ。特定の成長条件または変異酵母株をテストするために、必要に応じて、代わりのメディアを使用してください。 </li><li>カナバニン耐性変異株を選択するために、60 mg / Lのカナバニン（SC-argが+カナバニン）とアルギニン不足している固体の合成完全培地を加えます。アルギニン（ドロップアウト·ミックス）のないアミノ酸、2％グルコース、0.2％完全なサプリメント混合せずに0.67％バクト酵母窒素ベース、2％バクト寒天19である溶液を調製する。オートクレーブの前に20 mg / mlのストック溶液（濾過滅菌し、4℃で保存）19からカナバニンを添加することに冷却する。 <ol><li> 5フルオロオロチン酸（5-FOA）を含む固体合成完全培地を加えます。 500を準備する、アミノ酸を含まない4％グルコース、0.4％完全なサプリメント混合物、及び0.2％の5-FOA 1.34％バクト酵母窒素塩基であり、19をフィルター滅菌溶液を加えた。その後、4％バクト寒天液のオートクレーブ500ミリリットル、涼しい簡潔に、そして500mlのフィルター滅菌栄養液と混合。他の突然変異試験のための適切な代替メディアを使用してください。 </li></ol></li><li>ビオチン標識のために500mlの137 mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10.14 mMのリン酸ナトリウム二塩基、及び4℃で1.77 mMのリン酸カリウム二塩基、pH8のストアを含む1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を作製し、上に保つ使用中に氷。 </li><li>無菌の超純水に新鮮な5 mMのビオチンのストックを作る。 </li><li>ビオチン標識をクエンチするために、1×PBS、100mMグリシンの500ミリリットルを加える。 4℃で保存し、使用中に氷上に保つ。 </li><li>使用される細胞および実験の期間の数に応じて、1×PBS、2mMのEDTA、0.5％boviを含むビーズ標識バッファー1-2 Lを作るNE血清アルブミン。フィルター滅菌し、脱ガスバッファ。 4℃で保存し、使用中に氷上に保つ。 </li><li> 1×PBS中の0.4％トリパンブルー溶液を調製し、フィルターは滅菌し、細胞生存率の測定に使用するためにRTで保存。 </li><li>コムギ胚芽凝集素（WGA）の蛍光結合体の一定分量、少量（〜100μl）を細胞齢を決定する際に使用するためにラップ箔（または不透明）マイクロチューブ内に-20℃で保存する。 </li></ol>突然変異率と周波数の2の決定<ol><li>標準的な培養条件下で増殖させた細胞について変動試験を用いて細胞世代あたりのベースライン突然変異率を確立する。成長11への7は、初期の定常期（〜10 8細胞/ ml）のに1,000〜5,000細胞/ mlの初期密度から1ミリリットルの培養物を複製する。 <ol><li>各反復文化のために、細胞を1希薄：2000およびコロニー形成単位/ mlに決定するために、非選択培地（YPD）上に1-4μLを広げた。 〜2400 xにおけるペレット残りのセル100μlの水中の微量遠心再懸濁中で1分間gが突然変異体を同定する選択培地上に広げた。 （細胞の増殖速度に基づいて、必要に応じて、インキュベーション時間を調節する）前に、コロニーを計数し、30°Cで3日間培養する。 </li><li>選択培地上で得られた変異コロニー（r）の数に基づいて裁判に発生した独立した変異（M）の数を決定します。 9以下の式におけるRの変異体コロニー数の中央値を代入してMを見つけるためにリー·コールソン中央値推定器を使用してください。式の左辺は実質的にゼロになるまで、そして、mの値を代入します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg"></li><li>突然変異率を決定するために、第一の複製培養物及び体積の平均コロニー形成単位/ mlに乗じて選択培地上に広げ、生存細胞の平均数を計算する選択培地上に加えスプレッドの文化の。セル生成あたりの突然変異率を得るために、生存細胞のこの平均数によって、ステップ2.1.2からのm値を割ります。 </li></ol></li><li>ステップ2.1.3で説明したように個別試験では各反復培養用の選択培地上に広げ、生細胞の数を計算する。変異頻度を得るために選択培地上に広げ、生存細胞数で培養について得られた突然変異体コロニー（r）の数を分割する。ベースライン変異頻度としてステップ2.1で複製培養物から個別の突然変異頻度の平均値や中央値を使用してください。 </li><li>突然変異蓄積の年齢別変化をテストする際に考慮する必要があるでしょう変異の頻度の変化での標識工程の結果かどうかを判断するためにビオチン標識細胞（3.2および3.4​​ステップ）の前と後の周波数測定を行います。 </li></ol> 3ビオチン標識<ol><li>セントreak S. cerevisiaeの YPD培地上に-80℃でグリセロールストックから1〜3日間30℃でインキュベートする。 </li><li>念頭に置いて水保管の1ミリリットル（またはそれ以上）にストリークプレートからの転送細胞はストリークの厚く成長した部分1〜1.5センチ、約10 8個の細胞を与えることを、滅菌したピペットチップを使用した。血球計数器を用いて正確な細胞密度を決定します。 </li><li>ラベル10 8変異頻度が決定されるで収集ポイントごと株（または処理条件）当たりの細胞または（工程2.2からの突然変異頻度に基づいて）選択培地上でのサンプリング当たり少なくとも5〜10の変異体コロニーを得るのに十分な集団の大きさ。歪み/条件あたりのベースライン測定のための追加の10 8細胞を含む。 </li><li>メーカーから、5 mMのビオチン試薬のストックを使用して、静かにインキュベーション中に岩を除いて、標準手順に従ってビオチン標識。すべての遠心操作は3,000×gで、4℃で5分間スピンはS4℃よりも高い温度で回転してインスは、増加した細胞の損失につながる可能性があります。最後の洗浄の後、水中10 8標識細胞/ mlの濃度に細胞を懸濁する。 </li><li>トリパンブルー染色を用いて細胞の生存率を確認してください。水23μlのおよび1×PBS中の0.4％トリパンブルーの67μlの細胞を10μlに希釈する。血球計数器を使用したライブ（未染色）と死んだ（染色）細胞を獲得する前に、室温で少なくとも40分間インキュベートします。 </li><li>ゲノム不安定性、細胞齢、およびその他の関連する特性値のベースラインを測定します（セクション5,6を参照して、図7）。 </li><li>三角フラスコ（約5×10 6細胞/ ml）に10 8個の細胞あたりYPD培地20mlにビオチン標識された細胞を移す。 10 8細胞/ ml（四から五細胞世代）のおおよその密度に培養物（複数可）、20℃で16〜18時間を育てるが、細胞が定常期に到達することはできません。 30℃で成長のためのより短いインキュベーション時間を使用してください。ビオチン標識Cキープ4℃でのエルまでの数時間前に培地に添加する、成長期間及び収集のタイミングを最適化する必要がある場合。 </li></ol> 4。ビーズ標識および磁気ソート<ol><li>増殖期の後、血球計を用いて細胞密度を決定するために、培養物のアリコートを希釈する。 3000×gで4℃で5分間の遠心分離により細胞をペレット化。上清を注ぐ。 </li><li>その後、ビーズ標識バッファー30ml中でペレットを懸濁させるボルテックス遠心分離し、4.1節のように上清を注ぐことにより、細胞を洗浄。繰り返し洗濯。 </li><li>完全にボルテックスで10 8の全細胞あたり50μlのビーズ標識バッファーで細胞を懸濁します。混合する2μlの10 8の全細胞、ボルテックス簡潔当たりの磁気ビーズを追加します。オンラインプロトコルから変更された（ミックスするために定期的に反転させ、10分間氷上でインキュベート<a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;）。 </li><li>ビーズ標識バッファー30mlで細胞を3回洗浄する。 </li><li>細胞が再懸濁するばかりまで中程度の設定で10合計8個の細胞あたり0.5ミリリットルビーズ標識バッファと簡単に渦ペレットを追加します。残りの細胞塊を除去するために50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを注ぐ。必要に応じて、カラム上にロードする前に1〜2時間氷上で細胞を残す。 </li><li>磁気カラムは、結合し洗浄し、磁気ビーズで標識された母細胞を溶出するために、製造業者の推奨プロトコルに従ってください。標識細胞の増加、回復のために、2×10 9の全細胞当たり少なくとも1つの列を使用しています。 <ol><li>彼らは流れをブロックするように、列をロードするときに発生した気泡を取り除きます。オンラインプロトコルから変更された（ビーズの間に閉じ込められたとなってから細胞を防止するための洗浄の間にセパレータの列を取り外し、交換し<a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf）。 </li><li>所望であれば、母細胞によって産生さ若い細胞を分析するための結合工程および洗浄工程のフロースルー保存する。ステップ4.7で説明したように細胞を濃縮する。 </li><li>一度に複数のサンプルを処理するための複数列の区切り文字を使用してください。処理時間削減し、細胞の損失を減少させるために同じコレクションチューブに同じサンプルの複数の列を溶出する。 </li></ol></li><li> 4°Cで5分間3000×gで遠心分離することにより溶出した母細胞を濃縮する。吸引し10 8元のビオチン標識細胞あたりすべてが、1ミリリットルのバッファ。残りのバッファーで細胞を懸濁させる簡単にボルテックスする。 </li><li>細胞のアリコートを希釈し、細胞密度および血球計数器を用いて細胞生存率を決定するためにトリパンブルーで染色し（ステップ3.5参照）。回収された細胞の総数を計算します。 <ol><li>セルの数が予想よりも実質的に高い場合には、若い細胞を汚染除去しようとする別のカラムに通し、溶出サンプルを渡す。セルの数が予想よりも実質的に低い場合には、母細胞の収率を改善しようとする別の列を介して試料を通して保存流れを通過させる。 </li></ol></li><li>せずに、（4.1-4.8.1ステップ）あるいは、セクション5および6に記載したように、さらなる分析のために細胞を使用し、その複製年齢（ステップ3.7）を増加させ、ビーズ標識によって従うことを再びYPD培養液中で細胞を増殖および並べ替えビオチン標識を繰り返す必要があります。 </li></ol>複製年齢5。決定<ol><li>このセクションのすべての手順を室温で5000×gで2分間細胞をスピン。 1.5ミリリットルの遠心管に回収された細胞（〜10 8個/ ml）を25μl入れて、1ミリリットル1×PBSで2回洗浄する。上清を吸引除去する。 <ol><li> WGA-コンジュゲートのアリコートを解凍し、ボルテックスして混合し、タンパク質凝集体を除去するために短時間スピンする。 180μlの1×PBSおよび目の表面の芽傷を標識するために蛍光分子に結合WGA20μlの中に細胞をサスペンド電子セル。ホイルで1.5ミリリットルの遠心管をカバーし、穏やかに30分間、30℃で揺らしながらインキュベートする。 </li><li> 1ミリリットルの1×PBSで3回洗浄する。 </li></ol></li><li>蛍光顕微鏡、ラベルスライドや抗フェード剤を使用して、標準的なプロトコルごとにマウントします。完全に撮像中に細胞運動を避けるために、カバースリップをシールする前に（数日まで）、暗所でスライドを治す。細胞齢の代表測定値を得るために、サンプルごとに少なくとも50個の細胞に芽傷跡を数える。必要に応じて保存、芽の傷跡を見るために1ヶ月までスライドします。 <ol><li>あるいは、ステップ5.1.2の後に1×PBS 1mlに懸濁した細胞にフローサイトメトリーを行うことにより、WGA結合体からの蛍光シグナルの強度を決定する。 WGA-アレクサ488用の505 nmのロングパスフィルターと405 nmの励起レーザーと530/30 nmの発光フィルターを使用し、各コレクションのポイントの染色していないコントロールを含めます。 </li></ol></li><li>上の顕微鏡検査により計数若い細胞と老化した細胞上のグラフ芽の傷跡x軸上の同一の細胞集団からWGA結合体の蛍光の正規化された幾何平均に対するy軸（染色された幾何平均/未染色の幾何平均）。この関係の線形傾向線の式を得る。その後の実験のために、式中のxの細胞集団のWGA-コンジュゲートの蛍光強度の正規化された幾何平均を代入し、サンプルの平均セル年齢を決定するために、yについて解く。 </li></ol> 6。変異頻度<ol><li>ステップ2.1.1で説明したようにスプレッドをYPD培地および選択培地上にステップ4.7から緩衝液中に再懸濁母細胞を選別した。 1分間5000×gで選択培地とスピン細胞について再懸濁母細胞の1ミリリットルを使用してください。 注：細胞が古い集団における非生存と老化細胞数の増加を補償するために、年齢の増加としてYPD培地上に希釈した細胞のより大きなボリュームを広げる。 <ol><li> YPD培地からの選択培地培養するそれぞれ、3および4日間30℃で6.1ステップ。非常に古い細胞や、ゆっくりと成長している菌株について1週間インキュベーション時間を増やします。ステップ2.2で説明したように突然変異頻度を計算します。 </li></ol></li></ol> 7。与えられた複製年齢に対する予測変異頻度の計算<ol><li>関連するソート用のソート母細胞の平均年齢から、初期の細胞集団の平均年齢を差し引くことにより、実験の過程でビオチン標識細胞の複製時代の平均増加を計算します。ステップ5.2ステップ5.2.2で計算されたセルの年齢を使用してください。 </li><li>ステップ7.1で算出した平均細胞齢の増加によってステップ2.1.3で得られた突然変異率を掛けます。関連する複製時代の細胞の予測変異頻度を決定するために、ステップ2.2で計算された初期集団のベースライン変異頻度にこの値を追加します。 </li></ol>

<ol><li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability%2C+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li>
<li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li>
<li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li>
<li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li>
<li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li>
<li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5%26%2334%3B-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast%3A+5-fluoro-orotic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li>
<li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae%3A+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li>
<li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mother+enrichment+program%3A+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li>
<li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015(2011).</li>
<li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li>
<li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li>
<li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li>
<li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li>
<li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li>
<li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li>
<li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+analysis+CalculatOR%3A+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+estimator+of+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li>
<li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

このプロトコルは、リソースを有効にするために複数の方法を組み合わせて、効率的に有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性の研究に適用される出芽酵母モデル系で利用可能に近づく。表現型選択を介してゲノム不安定性の異なる形態を定量化するための多種多様なアッセイは、突然変異または染色体再配列の特定の形態の蓄積を可能年齢特異的な変化を研究するために、磁気選別と組み合わせることができる。全ゲノム配列決定アプローチは年齢とともにゲノムに生じる変化の全体的な種類の詳細な情報を提供できるが、突然変異率の測定値を得るために表現型の選択系を使用すると、優先的に遺伝子変化の特定のタイプを単離する能力は、機構的研究のための重要な利点である加齢に関連するゲノム不安定性の側面。細胞齢とphysiologiの並列測定を行う可能性の決定を合理化フロースルーCALの変化は、フローサイトメトリー、特定の年齢層の間に他の細胞の変化とゲノム不安定性を相関させる効果的な手段を提供する。蓄積変異の率の潜在的な年齢依存性の変化の測定が必要です。1）慎重に若い細胞集団における金利の決定、細胞齢の2）正確な決定、及び3）確実に再現性よく測定するために母細胞の十分に大きな集団を豊かにする機能老後のゲノム不安定性。このアプローチは、酵母モデル系は速度および/または有糸分裂活性細胞におけるゲノム不安定性の周波数の年齢依存性変化の原因基礎となるメカニズムを定義することに貢献することができます。さらに、遺伝的要因と環境要因が急速に年齢依存ゲノム不安定性への寄与について評価することができる。最終的には、これらの特徴付けは、変異が複製老化の間に蓄積される方法を考慮したモデルの開発につながる可能性があります。 この方法は、そのような事象の発生率を測定するために選択可能な表現型の出現を通して突然変異またはゲノム不安定性の他のタイプを検出する能力に依存する。しかし、アッセイデザインにおける創造性を調査するゲノム不安定性の多くの側面を可能にすることができる。例えば、URA3及びCAN1遺伝子は、結果に対するゲノム位置の任意の影響をテストするために異なるゲノムの部位に配置することができる。機能的遺伝子の対立遺伝子に特異的な非機能的遺伝子の対立遺伝子の復帰は、特定の突然変異のプロセスをテストすることができます。また、遺伝子または反復配列を有する遺伝子に隣接する複数の不活性な対立遺伝子の導入は、それぞれ、修復または遺伝子機能の喪失を介して組換え事象を調べるために使用することができる。変動試験は、これらのさまざまなゲノム不安定性事象9の速度を決定するための標準的なアプローチである。プロトコルは牟田を決定するために、十分に受け入れられ、比較的単純リー·コールソン中央値推定器を使用して書かれているション率はMSS-最尤推定法は突然変異率9を決定するための最善のアプローチと考えられているにもかかわらず、多様な研究者にとってよりアクセスしやすくします。 MSS-最尤推定量は、以前に詳細9に概説されており、代替方法として使用することができるが、より高度な計算を必要とする。代替的に、この方法で突然変異率を計算するためのフリーソフトウェア22は使用可能になった。突然変異率の再現性のある措置を得ることは、10,000倍以上で人口規模が大きくなるに十分低い初期細胞密度で培養物を接種すること、十分な反復培養の使用を含む実験計画のいくつかの側面、に注意を必要とし、全体のように、適切な培養容量を選択する細胞の集団は、選択培地上に塗布することができる。後者の点については、前述の式は、培養テスト=の割合に基づいて突然変異率を調整するために使用することができD 9。培養物の増殖速度の変化が再現可能な突然変異率の決定を複雑にすることができ、そのような状況では、より再現性のある結果を生じ得る修飾された中央値に基づく推定器は、最近23に記載されている。 正確細胞齢を測定する能力は、古い細胞におけるゲノム不安定周波数による若い細胞内イベントの発生率が期待値と異なるかどうかを確立するために重要であるもう一つの要因である。私たちは、WGA染色はWGAは、異なる蛍光分子にコンジュゲート利用可能であるので、両方の背景と柔軟性の観点から、白染色をカルコフロールすることが好ましいことを見出した。この柔軟性は、蛍光試薬と他の細胞の特性の同時測定のためのより多くの機会を提供することができる。 WGA染色および細胞上の蕾瘢痕対応する数のための信号強度との関係を確立するための最初の作業は、より多くをもたらすことができるフローサイトメトリーを介して細胞齢を迅速に決定。このアプローチは、典型的には、測定の再現性改良のために顕微鏡で検査されるより大きな集団サイズの使用を可能にする。すべての年代測定は、細胞の顕微鏡検査を通じて行うことができる一方で、私たちは、フローサイトメトリーのアプローチは年齢依存ゲノム不安定性に影響を与える要因の迅速なスクリーニングを容易にすると考えています。 確実にセル年齢を測定することに加えて、考慮事項は、母細胞が細胞を増殖および並べ替えの各連続ラウンドを受けることが許可されている細胞分裂の数を与えられる必要がある。小さい初期集団の大きさ以上の培養液量を使用すると、細胞が所望の細胞密度に到達する前に、より細胞分裂を受ける可能性があります。例えば、他の研究者は、より少ないexperime古い細胞を得る明白な利点を有する非常に古い酵母細胞16を得るために選別つだけのラウンドを使用しているNTALステップ。細胞がソーティングの前にそれ以上の細胞分裂を完了できるように培養液量を増やすかどうかを検討する際、念頭に置いて、単一の列で処理することができる細胞の総数に制限を続ける。より大きな培養容量の使用は、一つの細胞集団をソートする複数の列の使用を必要とすることができる。細胞は、ソート/収集ポイント間の細胞分裂の少ないラウンドを受ける場合も、その後寿命の間に異なる時点で予想される突然変異頻度からの偏差を観察するより多くの機会がある。例えば、製品寿命中のみで、早期のサンプリング及び後期の時点は、データの変異頻度が着実に増加を示したが、すぐに、その後プラトーその突然変異頻度が増加を示す可能性が寿命の間に追加の中間の時間でサンプリングを生成することができる。このプロトコルは古い母細胞を分離するので、年齢とともに突然変異率の変化のより直接的な測定値を得るための機会がある。変動試験は、bの可能性eは、突然変異率は、若い細胞を用いて得られた速度と異なるかどうかを決定するために、異なる年齢の母細胞を用いて行った。彼らが成長するにつれて、これらの変動試験のための培養は古く、若い細胞の混合物となりますが、若い細胞で出発して得率からの逸脱は、古い出発集団の使用に起因する可能性がある。 再現性よく正確にゲノム不安定性を測定するために、高齢者の母細胞の十分な大きさの集団を得る能力は、このアプローチの成功に不可欠です。プロトコルがこの目的のための特定の磁気ソーティングシステムの使用を説明しているが、他のグループは、代替システム14,18（ 材料の表を参照）、酵母母細胞を選別している。製造業者のプロトコルのいくつかの最適化が必要になることができたにもかかわらずこのような代替システムはまた、この方法で動作するはずです。関係なく、使用される特定のシステムの、人口規模が必要ですdは研究のために選択突然変異またはゲノム再編成の種類の周波数によって異なる。最低でも、変異頻度を計算するために、人口あたり少なくとも1つの変異体コロニーを得るために十分な母細胞が存在しなければならない。唯一のゼロ5に対する変異コロニーは人口規模、人口規模の小さな増加から期待されている場合は、五から十突然変異体コロニーが期待されていることを、大幅に再現性を向上させることができますので、実際には、結果は、非常に可変することができます。ビオチン出発集団を標識する場合、各ソートのための回収効率は、古い母細胞における変異頻度を測定するために必要な適切な集団の大きさを特定するために考慮に入れる必要がある。各ソート後の母細胞の90％の回収率では、元の人口のわずか59％の成長と選別の5ラウンド後に回収されることになる。これは〜33％の成長率の5ラウンド後、元の人口の回復とラベルされた母細胞のわずか80％が回復している場合は、ソートに低下各ソート中に編。母集団の大きさの二から三倍の減少が簡単に人口あたりの突然変異体コロニーの信頼性の低い数字につながる可能性があるため、低周波イベントを測定する際の測定と回復を最大化することは非常に重要です。 上の拡張または有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性のより広い理解を得るために、このプロトコルを変更するための多数のオプションがあります。簡単な例としては、遺伝子機能、メディアの変更、またはその他の環境条件の変化の変化は年齢とともに変異の蓄積を変える方法を分析することを含む。改変された遺伝子機能又は適切な条件で若い細胞のための突然変異率を測定し、対照細胞集団に比べて異なった速度値により予測と比べて変異が異なって蓄積するかどうかを決定するために使用される。複製老化中の異なる点での細胞集団は、そのような活性酸素種またはDNA損傷剤のような特定のストレス要因にさらされる可能性があります。 A酸化ストレスに対する一過性の軽度の曝露は、実質的に細胞選別（ 図3）を実行する機能には変わりはありませんでしたが、厳しいストレスは、細胞の回復を複雑にするかもしれない。予備実験は、母細胞はまだ特定のストレスの後に効率的に回収できることを確認することが必要であろう。さらに、単離された母細胞の細胞特性は、活性酸素種、ミトコンドリアおよび液胞形 ​​態、及び3を老化と関連している他の生理学的特性のレベルを含む、詳細に分析することができた。また、母細胞は、さらなる処理または操作のための出発集団であってもよい。母と娘細胞が物理的手順の間に分離されているので、娘細胞は、依然として、分析のために用意されています。例えば、娘細胞または酵母母と娘細胞との間の損傷を受けた巨大分子の非対称継承の生理学的特性の変化<sアップ&gt;図24は、変異頻度/レートのいずれかの興味深い変更のタイミングと比較することができた。娘細胞集団のための突然変異頻度はまた、複製老化の間の変異の非対称の継承があるかどうかをモデル化しようとするために得ることができた。要約すると、変動試験と磁気細胞ソーティングを通して母細胞の濃縮を組み合わせてSの利点を可能にする·セレビシエモデル系は、効率的に、有糸分裂細胞老化中の遺伝的変化の蓄積に関与するメカニズムを調査に適用される。

酵母サッカロマイセス·セレビシエなどの微生物は、突然変異率を調査するための優れたモデルであるが、これらのモデルは、完全に細胞の有糸分裂熟成中変異の蓄積を調査するために利用されていない。核ゲノムにおける突然変異の蓄積は、遺伝子機能の1（または変動）進行性の喪失をもたらすことによって老化に寄与することが仮定されている。エージング中に突然変異の蓄積のメカニズムと影響を研究するために微生物系を使用する能力が大幅ため容易遺伝子系および微生物における稀な表現型の変化を定量化が容易で、このプロセスに影響を与える遺伝的および環境的因子の同定を加速する可能性がある。 DNA修復因子およびDNA損傷応答タンパク質は、十分に多様な種2を超えて保存され、そして生物の老化の根本的な類似性は、S.限り多様な生物のために同定されているセレビシエ ANそれは可能性が高いことを作るD哺乳類3は 、酵母における研究から得られた結果は、多くの生物の老化に関係するであろう。 Sに高齢化に関する研究サッカロミセス·セレビシエは加齢による老化や細胞の複製老化を測定する2高齢化のモデルを利用する。加齢による老化に起因栄養枯渇3に非分裂状態（定常期）にある酵母細胞集団における生存能力の進行性の喪失によって特徴付けられる。加齢による老化モデルでは、大きな細胞集団を容易に変異細胞のための表現型選択を行うために、このモデルで得られるので突然変異が、加齢4に蓄積することを実証するために使用されている。この場合には、突然変異の蓄積は、増殖シグナル伝達経路および酸化ストレス5によって影響されるようであり、これらの各要因は、多細胞真核生物3の老化の理解に関連する。複製老化モデルは、非対称ディビジのを悪用S.の間での連続した細胞世代3で発生する老化を調査するためのサッカロミセス·セレビシエ母と娘細胞。酵母複製老化は、多くの場合、マイクロ流体デバイス6,7酵母細胞の小集団のビデオ顕微鏡を通して母と娘細胞、またはより最近では、小集団のマイクロマニピュレーションにより測定された。リミテッド人口のサイズは、全ゲノム情報が単一細胞から得られた、または非常に高い周波数の遺伝的変化は8で測定されていない限り、分裂熟成中の突然変異の蓄積を調査するためのこれらのアプローチはあまり適しています。単一細胞の全ゲノム配列決定は、変異の蓄積を調査するため、実質的なデータセットを提供するが、表現型選択システムは、突然変異の蓄積のメカニズムを研究するために突然変異率を測定する手段を提供するという重要な利点を有する。 haploiにおける表現型の選択を介して突然変異頻度や料金を検討する研究複製老化の間のd個の酵母菌株は、まだ報告されていない。 突然変異率は、一般的に変動試験9を用いて測定される。変異頻度の値は、集団における遺伝子配列における変異を有する細胞の総数を反映する。これは独立した突然変異が発生した細胞単に既存の突然変異を継承するそれらの細胞の任意の子孫を含む。対照的に、変動試験により測定された突然変異率は、新たに、各セルの生成を生じる独立した突然変異の数を表す。これらのテストは、典型的には、標的配列内の既存の変異を有する細胞を添加ほぼ飽和した培養物を増殖し、選択培地上での増殖によって突然変異細胞を同定する可能性を低減するために低細胞密度で、多くの複製培養物を接種することを含む。レプリケート集団で同定された変異体細胞の数は、その後、iの数を推定するために、いくつかの数学的モデルのいずれかで使用されている成長の9時に生まれたndependentの突然変異。平均集団サイズに独立した変異の数を比較して突然変異率の尺度を提供する。 S.でこれらの遺伝子における機能喪失変異は、選択可能な表現型を生成するので、 サッカロミセス·セレビシエ 、突然変異頻度や料金は頻繁に、URA3及びCAN1遺伝子を用いて測定される。 URA3によりコードされたタンパク質は、毒性分子10内に5-FOAに変換するので、URA3機能の喪失は、5 -フルオロオロチン酸（5-FOA）に耐性の細胞をレンダリングします。 CAN1によってコードされるタンパク質が細胞11内にアルギニン及びカナバニンを搬送するので、CAN1の機能の喪失は、細胞がカナバニンに耐性になることができ、有毒なアルギニン類似体。 遺伝的および物理的な両方のソーティング戦略は成功しS.のより大きな集団を得るために使用されている複製老化の調査を容易にするために、 サッカロミセス·セレビシエ母細胞。遺伝的戦略は、集団の中の娘細胞の生存に対して選択する巧妙な手法を含む。母濃縮計画（MEP）loxP部位 12を含むように操作された2つの必須遺伝子の娘特有の混乱につながる唯一の娘細胞におけるCreリコンビナーゼの発現のベータ-エストラジオール誘導を伴う。 MEP株は誘導物質の非存在下では正常に成長させることができますが、母細胞が娘細胞が細胞周期から12彼らの最初の進行の間に、一般的なM期で逮捕する一方、誘導後に分裂していきます。このシステムは広く熟成中の変異の蓄積を研究するために使用されていないが、それは老化母細胞13,14におけるヘテロ接合性の消失、二倍体酵母株におけるゲノム不安定性の比較的頻繁な形態、ならびに生化学的変化を研究するために使用されている。同様に、娘避雷器システムは、Sの娘特異的発現を伴うcereviSIAE URA3遺伝子15。 5-FOAがれるURA3を発現しているポイントの娘細胞が死んでしまう、培地に添加されるまで、母細胞が15を成長させ続けている娘、アレスタ株は、正常に成長。これらは、母細胞を濃縮するための有用なシステムであるが、それらは選択システムを構成する遺伝子機能の維持に依存している。選択システムの1つまたは複数の構成要素におけるランダム変異は、選択を脱出し、指数関数的に増殖する娘細胞を生じる可能性がある。 MEP株の開発中に、適切な集団サイズは選択12を逃れる可能性突然変異娘細胞の出現を回避するために決定した。しかし、人口規模で、この制限は、複製老化の間にゲノム不安定性のまれな形態の検出を損なう。集団サイズに対するこの制限は、部分的にほとんどは、選択システムに貢献する各遺伝子の2つのコピーを二倍体酵母株を用いることによって克服することができ変異はおそらく12劣性となる。しかし、二倍体株の使用を容易に簡単に一倍体酵母細胞中で検出可能なものと比較して検出することができる突然変異事象の種類を制限する。 物理選別戦略は母細胞の大集団を濃縮するために、非標識の娘細胞からの標識細胞表面と母細胞の単離を含む。観察S.の細胞表面タンパク質（細胞壁タンパク質）が出芽は、彼らが16を産生する娘細胞を標識することなく母細胞を標識するために利用されてきた時にセレビシエ娘細胞が新たに合成される。例えば、ビオチンでその表面上に標識した酵母細胞の初期集団を成長させることができ、次いで、初期集団によって生成された娘細胞がその表面にビオチンを含有しないので、抗ビオチンマイクロビーズ、磁気選別16を使用して娘細胞から単離さ。シリアル成長とソートは、母細胞の漸進古い集団が得られ、分析されることを可能にする。この手順は、酵母13,14,17,18の複製老化の間の細胞生理学および遺伝子発現の変化を調べるために首尾よく使用されてきた。現在の方法は、潜在的にまれな変異または表現型の選択を介してアッセイしたゲノム不安定性の他の形態の蓄積を測定する目的で母細胞を濃縮するために、このビオチン標識および磁気選別技術を適応させる。シリアル成長および物理的ソートが漸進的により古い母細胞において、ならびにそれらの娘細胞集団における突然変異の蓄積の分析を可能にする。世代当たりの突然変異率の決定は、予測された変異頻度は、細胞分裂の特定の数を受けた母細胞のために計算されることを可能にする。予測された周波数値に起因観察mutatiにおける細胞分裂のさらなるラウンド、実質的な偏差に増加が予想に基づいていますので予測された値と比較した周波数での変異を蓄積率の年齢別の変更のための証拠を提供しています。このプロトコルを使用して、フローサイトメトリーによって分析と結合した母細胞における細胞分裂の部位に対応芽瘢痕の蛍光染色を迅速にソートされたおよび未選別集団の年齢分布を決定するために用いることができる。このような反応性酸素種を検出するために使用されるもののような付加的な蛍光試薬もまた、このプロトコルの間に使用することができる。全体的に、このプロトコルは、老化関連ゲノム不安定性に影響を与える遺伝的要因と環境要因を研究に非常に適したモデル生物において加齢に伴う細胞生理学的変化との相関の可能性を持つゲノム不安定性における年齢依存性変化の効率的な解析を可能にします。

<table><tbody><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>抗ビオチンマイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>モノクローナルマウス抗ビオチン抗体(アイソタイプ:マウス IgG1)に結合した 2 ml MicroBeads モノクローナルマウス抗ビオチン抗体(アイソタイプ:マウス IgG1)</td></tr><tr><td>MACS LS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>QuadroMACS セパレーターに適した 25 カラム</td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-976</td><td>セパレーターのみ</td></tr><tr><td>QuadroMACS スターティングキット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td>含まれるもの: QuadroMACS セパレーター (130-090-976)、MACS マルチスタンド (130-042-303)、LS カラム (130-042-401)、MACS 15 ml チューブラック (130-091-052)、MACS MicroBeads の 2 ml ユニット 1 個。注:代替システムには、Dynabeads Biotin BinderおよびMagnaBind Magnetic Beads</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer、40 & micro;m</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>352340</td><td>40 &micro;mはBD Falcon 50 mlコニカルチューブと併用します。パックあたり50</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T6146</td><td>パウダー、溶解後のろ過 微粒子を除去するために重要</td></tr><tr><td>小麦胚芽凝集素 アレクサ Fluor488</td><td>Life Technologies</td><td>W11261</td> 異なる<td>励起/発光スペクトルを持つコンジュゲートも使用できます</td></tr><tr><td>ProLong Gold退色防止試薬</td>Life <td>Technologies</td><td>P36930</td><td>10 ml、他の退色防止試薬も使用できます</td></tr></tbody></table>

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するためにサッカロマイセス·セレビシエ

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

出芽酵母は、ゲノム不安定性のメカニズムと影響を調べるための優れたモデル系となっている。 DNA修復およびDNA損傷応答因子が十分に多様な種を超えて保存されているので、この酵母モデルから得られた情報は、ヒトを含む多くの生物に関連しています。しかし、S.サッカロミセス·セレビシエは、まだ完全には技術的な制約のために複製（有糸分裂）、年齢の増加と共に突然変異変化を蓄積する速度かどうかに対処するために使用されていない。例えば、マイクロマニピュレーションを通して酵母複製寿命の測定は、稀な変異の検出を禁止する細胞の非常に小さな集団を伴う。娘細胞の死を誘導することにより、集団における母細胞を濃縮するための遺伝的方法が開発されているが、集団サイズは依然として選択システムを危険にさらすランダム突然変異が発生する頻度によって制限される。現在のプロトコルは、磁気sortiを利用しています表現型の選択を介して稀な突然変異を定量化するために高齢の母親細胞の十分な大きさの集団を得るために表面標識酵母母細胞ngの。変動試験により測定された突然変異率、および突然変異頻度は、最初の若い細胞に対して確立や各種複製年齢の母細胞における突然変異の頻度を予測するために使用される。突然変異頻度は、次に、ソート母細胞のために決定され、母細胞の年齢は、細胞分裂中にそれらの細胞表面上に形成された芽の傷を検出する蛍光試薬で染色してフローサイトメトリーを用いて決定される。実験的に与えられた複製年齢の母細胞について観察された頻度に細胞分裂の数に基づいて予測された突然変異頻度の比較はその後の突然変異の蓄積率の加齢変化があるかどうかを識別することができる。この基本的なプロトコルのバリエーションは、特定の遺伝子機能の変化の影響を調査するための手段を提供するか、または複製老化中にゲノム不安定性のメカニズムに対処するために、突然変異の蓄積上の特定の環境条件。

変動試験により測定された若いサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞における突然変異率が異なる複製年齢の母細胞のための突然変異頻度を予測するために使用される。磁気ソーティングフローサイトメトリー予測さ突然変異周波数からの逸脱を識別するために、実際の突然変異頻度及び母細胞の年齢を測定するために使用される。

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

次の実験の全体的な目標は、replicativeの増加に伴う突然変異頻度の変化かどうかを判断することです。酵母細胞の年齢は、単に細胞分裂の追加ラウンドまたは突然変異の蓄積速度の年齢特異的な変化によるものです。これは、まず、細胞を選択培地と非選択培地に広げて若い細胞の突然変異頻度と突然変異率を測定し、細胞分裂の各ラウンドで突然変異の蓄積により年齢が増加する細胞の予測突然変異頻度を計算することによって達成されます。次に、酵母細胞集団を液状培養液で増殖させたビオチンで標識し、元の標識細胞を磁気選別により回収し、数回の細胞分裂を経た老化した母細胞を得ます。次いで、老化した母細胞を、それらの年齢を増加させるために再増殖させ、次いで、再度選別するか、または突合せ瘢痕について染色し、次いで、それらの平均複製年齢および突然変異頻度を決定するために、選択的および非選択的培地上に広げる結果が得られる。その結果は、実験的に観察された突然変異頻度と、その細胞の予測突然変異頻度との比較に基づいて、蓄積する突然変異に年齢特異的な増加または減少があるかどうかを示す結果が得られる。観察された平均年齢。この方法は、遺伝的損傷の蓄積速度の変化が正常な老化に寄与しているのか、それとも突然変異率の変化が一因となって、さまざまな遺伝的要因や環境要因の寿命を変化させる影響なのかなど、老化の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるメリッサ・パターソンで、標準培養条件下で増殖した細胞の変動試験を使用して、細胞世代ごとのベースライン突然変異率を確立するために。各複製培養について、細胞を1〜2000個希釈し、1〜4マイクロリットルを非選択的培地に広げて、ミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定します。残りの細胞を2, 400Gでマイクロ遠心分離機で1分間ペレット化し、100マイクロリットルの水を使用して再懸濁してから、選択的培地に広げて変異体を同定します。プレートを摂氏30度で3日間インキュベートした後、コロニーをカウントし、ビオチンでチャーミーCCIを標識する添付のテキストプロトコルに従って初期突然変異率および頻度を決定するまず、グリセロールストックからYPD培地に培養物をストリークし、摂氏30度で1〜3日間インキュベートする。滅菌ピペットチップを使用して、プレートから細胞を少なくとも1ミリリットルの水に移します。縞の密集した部分の1〜1.5センチメートルが8つの細胞に約10を与えることを覚えておいてください。ヘモサイトメーターを使用して、各菌株または治療条件の正確な細胞密度を決定します。5ミリモルのビオチン試薬ストックを使用して、メーカーの標準的な手順に従って、収集ポイントごとに10個を8個の細胞に標識します。最終洗浄後、すべての遠心分離ステップを摂氏4度で5分間実行します。水を使用して標識細胞を最終濃度10〜8細胞/ミリリットルに懸濁し、細胞生存率を確認し、10マイクロリットルの細胞を23マイクロリットルの水と67マイクロリットルの0.4%トライアムブルーで希釈し、1つのXPBSで細胞を室温で40分間インキュベートしてから、ヘモサイトメーターを使用して生細胞または未染色細胞、死細胞または染色細胞をスコアリングします。細胞の年齢と突然変異の頻度のベースライン値を測定した後、テキストプロトコルに従って、ビオチンで標識した細胞を20ミリリットルのYPD培地に移します。8つのセルのふりをします。20°Cで16〜18時間培養物を1ミリリットルあたり約10〜8セルまで成長させます。細胞が固定相に到達しないようにし、必要に応じて、細胞を摂氏4度に数時間保ち、成長期間と収集のタイミングを最適化します。細胞密度を決定し、細胞を摂氏4度でペレット化した後、30ミリリットルのビーズ標識、バッファー、ボルテックスを加えて細胞を洗浄し、懸濁液を回転させて上清を注ぎます。2回目の洗浄後、細胞を50マイクロリットルのビーズ標識緩衝液に懸濁します。ボルテックスによって合計8つのセルのふりをします。2マイクロリットルの磁気ビーズを追加し、合計8つの細胞のふりをし、ボルテックスした後、氷上で10分間インキュベートし、定期的に反転させます。次に、30ミリリットルのビーズ標識緩衝液を使用して、細胞を3回洗浄します。次に、0.5ミリリットルのビーズラベリングバッファーを追加します。合計8つの細胞のふりをして、細胞が再懸濁されるまで、ペレットを培地の設定で短時間ボルテックスします。懸濁液を40ミクロンのセルストレーナーに通して50ミリリットルのチューブに注ぎ、残っている細胞塊を取り除きます。必要に応じて、カラムにロードする前に、セルを氷上に1〜2時間放置します。磁気カラムについては、メーカーが推奨するプロトコルに従って、10の2倍から合計9個のセルを使用します。カラムをロードするときはエアラブルを取り外し、洗浄の合間にセパレーターのカラムを取り外して交換し、細胞がビーズの間に閉じ込められるのを防ぐように注意してください。同じサンプルの複数のカラムを処理するためにマルチカラムセパレーターを使用する場合は、それらをすべて同じコレクションチューブに溶出して、処理時間を短縮し、必要に応じて細胞の損失を減らします。母細胞が産生した若い細胞を3000Gで4°Cで5分間遠心分離し、1ミリリットルを除くすべての緩衝液を吸引して、母細胞が産生した若い細胞を分析するための結合および洗浄ステップからのフロースルーを保存します。8つの元のビオチン標識細胞のふりをします。次に、一時的にボルテックスして、残りのバッファー内のセルを懸濁します。Triam Blueを使用して希釈した細胞のアリコートを染色し、ヘモサイトメーターを使用して細胞密度と生存率を測定します。次に、回復したセルの総数を計算します。細胞数が予想よりも大幅に多い場合は、溶出サンプルを別のカラムに通して、汚染された若い細胞の除去を試みます。セルの数が予想よりも大幅に少ない場合は、保存されたフローを通過させます。必要に応じて、別のカラムでサンプリングし、母細胞の収量を改善しようとします。細胞を再増殖させて複製年齢を延ばし、ビオチン標識なしでビーズの標識と選別に従います。反復年齢を決定するには、回収された細胞の25マイクロリットルを1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移し、1ミリリットルのXPBSを使用して細胞を2回洗浄し、細胞表面の芽の傷跡を標識します。180マイクロリットルの1つのXPBSと20マイクロリットルの蛍光標識WGAを使用して細胞を再懸濁し、1.5ミリリットルの遠心分離チューブをホイルで覆い、インキュベーション後30分間、摂氏30度で穏やかに揺さぶってインキュベートします。1つのXPBSを使用して細胞を3回洗浄します。次に、蛍光顕微鏡検査では、Antifa試薬を使用して細胞をスライド上にマウントし、イメージング中の細胞の動きを回避します。スライドを暗闇で最大数日間完全に硬化させます。サンプルあたり少なくとも50個の細胞の芽の傷跡をカウントして、細胞年齢の代表的な測定値を取得します。あるいは、1つのXPBSに細胞を懸濁した後、Y軸上の顕微鏡でカウントされた若年細胞および老化細胞の芽傷跡のテキストプロトコルグラフに概説されている設定を使用してフローサイトメトリーを実行します。最後に、この関係の線形トレンドラインの方程式を取得します その後の代用では、WGAの正規化された幾何平均が方程式のXの細胞集団の蛍光強度を共役し、Yを解いてサンプルの平均細胞年齢を決定します。このグラフは、1つの遺伝子の突然変異率がビオチン標識の前後で類似していたことを示しています 独立した若い酵母集団では、20°Cまたは30°Cで増殖した場合、ビオチン標識の前後で若い細胞でも突然変異頻度が類似していました。ここに示すグラフは、ビオチン標識後に回収された細胞をカウントし、未処理の細胞または最初のソーティング後に1ミリモルの過酸化水素で処理した細胞を選別した場合に観察される可能性のあることを示しています。最初のソーティング後に細胞の数が予想よりも多く表示される場合があり、ソーティングを続けると細胞がわずかに進行的に失われることが予想されます。複製年齢は、この図に示すように、蛍光標識されたが、細胞上の瘢痕を手動でカウントすることによって決定されました。フローサイトメトリーからの蛍光性ではあるが瘢痕シグナルを手動カウントと比較し、母親細胞集団とコントロール細胞集団の複製年齢をフローサイトメトリーによって決定できる線形関係を得ました。これらのグラフは、母細胞の平均年齢と若年細胞集団について得られた突然変異頻度と突然変異率から計算された予測頻度と比較して、老化母細胞の観察された突然変異頻度が類似または上昇した例を示しています。ゲノムのゲノム位置に応じて、この手順に従うことができます 1つの遺伝子。活性酸素種や円形の形態の染色など、他の方法を使用して、細胞生理学のどのような変化が突然変異蓄積の加齢に伴う変化に関連しているかなどの追加の質問に答えることができます。

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ-...

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

ここでは、エージング中規制またはゲノムDNAの不安定性に寄与する遺伝子/経路を研究するために酵母の時系列の寿命モデルと組み合わせることができるDNAの突然変異試験のセットを説明します。...

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。...

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

老化中の成体幹細胞の内因性分子変化を理解するには、目的の細胞を分離する必要があります。ここで説明する方法は、老化中の任意の時点で、ショウジョウバエの腸幹細胞と腸芽細胞前駆細胞をFACSによって濃縮し、単離するためのシンプルで堅牢なアプローチを示しています。...

大人から腸管幹細胞を単離ショウジョウバエ FACSによる中腸は老化中の幹細胞の挙動を研究するために

私たちは、成体マウスの脳の脳室下ゾーン(SVZ)から神経幹細胞(NSC)とその子孫を単離するための蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースの方法を報告します。蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)トランスジェニックマウスに適用することで、ライブイメージングによる細胞周期の進行を研究することができます。...

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

フローサイトメトリーを用いたマウス精子細胞の選別戦略を記述します。精子細胞は、円形(精子形成ステップ1-9)、早期伸長(精子形成ステップ10-12)、後期伸長(精子形成ステップ13-14)、細長い精子細胞(精子形成ステップ15-16)の4つの高純度集団に分類されます。DNAの染色、サイズ、および顆粒度が選択パラメータとして使用されます。...

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

この記事では、マイクロ流体チップの生産と寿命と、単一の酵母細胞の細胞表現型を測定するためのマイクロ流体実験のセットアップのために最適化されたプロトコルを提示します。...

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

ここでは、有分裂・マイオシス時の生きた核分裂酵母細胞におけるタンパク質挙動や核ダイナミクスを研究者が研究できる非毒性顕微鏡法である生細胞イメージングを紹介する。...

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

ここでは、 サッカロミセスセレビシエの増加したコピー数サプレッサー画面を介して遺伝的相互作用を識別するためのプロトコルです。この方法により、研究者は短命酵母変異体のサプレッサーを同定、クローン化、および試験することができます。オートファジーヌル変異体における SIR2...

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。...

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S.

出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析

学ぶ磁気ソーティングと変動試験を組み合わせたSaccharomyces cerevisiaeの有糸分裂細胞老化におけるゲノム不安定性の分析方法。この手法により、細胞分裂と年齢特異的変異蓄積の違いを解明できます。

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するためにサッカロマイセス·セレビシエ

さらに動画を探す