Name: タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ 高密度機能タンパク質マイクロアレイを用いたタンパク質間相互作用の検出法。蛍光標識抗体で結合を検出し、バイオインフォマティクス解析へ展開可能な並列ハイスループットアプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業はNIHからの助成金によって支援されました。図1に示すアッセイは、Joseph Fasolo博士によって行われました。Rui Chen博士の有益なコメントに感謝します。

1.プローブの準備<ol><li>培養し、以下のように他のタンパク質との相互作用を調べるために使用されるV5融合キナーゼプローブを精製します。 <ol><li>新しく作製した酵母株Y258を使用します（マタpep4-3、his4-580、ura3-53、leu2-3,112）（GATEWAYベクターpYES-DEST52から発現）V5融合タンパク質を含みます。マイクロアレイ上のプローブとして単離されたタンパク質を使用してください。合成完全ウラシル（SC-URA）/ 2％ブドウ糖/寒天に酵母をプレートと凍結培養（-80°Cグリセロールストック）から3日間30℃で成長します。 </li><li>単一コロニーからスターター培養物（5〜ml）を接種し、30℃でのプラットフォーム（220〜250 RPM）やホイールを振るのSC-URA / 2％デキストロース中で一晩成長します。 </li><li>翌朝は、0.1の最終OD 600に十分なスターター培養物を皮下-URA / 2％のラフィノース文化の400ミリリットルを接種します。 </li><li> 0.6の600は V5-キナーゼのfuのガラクトース誘導に続いてODまで接種を育てますシオンガラクトースの最終濃度が2％になるように3倍の誘導培地を希釈するのに十分に添加することにより、6％ガラクトースを補った3×酵母抽出物/ペプトン（YEP）の溶液を添加することによって表現を構築します。 </li><li>振盪プラットフォーム上で6時間30℃で細胞を誘導します。適切な通気を確保するために2 L三角フラスコを使用してください。 </li><li> 4℃で5分間、1000×gで細胞懸濁液を400mlの紡糸によってJA-10（または同等の）ローターを用いて収穫細胞。 </li><li>氷冷PBS緩衝液50mlで細胞を1回洗浄し、50mlコニカルチューブに移します。溶解のためのチューブキャップスナップ2ミリリットルに溶解し、転送に使用（洗剤または他の添加剤なし）の氷冷PBS緩衝液で再びペレットを洗浄。 </li><li>ペレットとピペット離れバッファに4℃で1分間20,000×gで細胞をスピン。 </li><li>氷の上にチューブを置き、溶解ステップに進みます。 </li><li> 0の細胞を溶解（250〜350μlのペレット）1：1 0.5ミリメートルのジルコニアビーズ1細胞ペレットの体積、ビーズ、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶解緩衝液と4℃で2分間隔で3回攪拌プラットフォームを用いて混合物をボルテックス。 </li><li> 4℃で10分間、卓上微量20,000×gで溶解物を遠心します。 </li><li>ピペットポリカーボネート高速遠心チューブに上清を4℃で15万×gで30分間ulracentrufugationにより明確にします。 </li><li>ヒスチジンをキャプチャするために4℃で2時間、ニューテーター上で予備洗浄のNi 2+親和性樹脂（〜100μl）を含むチューブに清澄化ライセートを移し、インキュベート（彼の）6XがV5融合タンパク質をタグ付けしました。 </li><li>洗浄緩衝液で4℃で10分間樹脂を3回洗浄します。 4℃、1,000×gで5分間、卓上遠心機を用いて樹脂をペレット化し、上清を吸引します。各洗浄のために新鮮な洗浄緩衝液を添加し、洗浄の間にチューブを攪拌するための旋回装置を返します。 </li><li>洗浄後のSTEPSは、溶出のために新たにG-25カラムに洗浄した樹脂を適用し、完了しています。 </li><li> 9画分の合計のための50mM刻みで500 mMイミダゾールに100 mMのイミダゾールで始まる段階的に溶出バッファー25μlのを適用します。 </li><li>アッセイアッセイで使用するための最も高度に濃縮された画分を同定し、に使用するまで-80℃で30％ストアにグリセロールを添加することがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）およびクーマシー染色を用いて回収した画分アッセイ。 </li></ol></li></ol> 2.アレイのプロービング注：このアッセイを開始する前に、抗体溶液を調製するために、このセクションのステップ2.6を参照してください。 <ol><li>相互作用を検出するために、プローブ·バッファ内の260 ng / mlでのV5 -フルオロフォアコンジュゲート抗体（ すなわちのAlexaFluor 647）を希釈し、振とうして十分に混合します。 注：使用してnutatにチューブを配置する30分前に、この抗体溶液を準備しますやホイール完全混合し、抗体の均質な懸濁液を確保します。 </li><li> 5-500 / mlの濃度範囲にわたってV5融合タンパク質プローブを希釈します。 注：プローブ緩衝液を用いて、各タンパク質 - タンパク質相互作用アッセイのために最適化。最適化は、バッファをプローブするための複数のプローブを加えることを含みます。典型的には10μg/ mlの出発点として使用され、信号強度に基づいて、それに応じて調整されます。 </li><li>冷凍庫（-20℃）からタンパク質マイクロアレイを削除し、使用直前に冷蔵庫に4℃にもたらします。 </li><li>タンパク質micorarraysを含むスライドホルダーに直接ブロッキングバッファー追加し、漏出を防ぐためにパラフィルムでトップをカバーしています。 4℃でのステージ上で50 rpmで振とうすることによって1時間ブロッキング緩衝液中の配列をブロックします。 </li><li>ブロックした後、4℃に冷却加湿チャンバーに配列を転送し、アレイ表面に直接希釈したプローブの90μlを添加します。 ARRをオーバーレイ1.5時間4℃で加湿チャンバーで上昇リフタースリップでaysと静的インキュベート（無振盪）。 </li><li> 3 50mlコニカルチューブにプローブバッファに1分ごとにアレイを3回洗浄します。完全にスライドを包むのに十分な予備冷却プローブ緩衝液を含むコニカルチューブにスライドを追加します。リフタースリップを静かタンパク質マイクロアレイ（これはアレイ表面に損傷を与える可能性があるので、それを強制的にオフにしない）のオフにスライドすることができます。 </li><li>直前のような隆起したリフタースリップで洗浄（ステップ2.5）とオーバーレイを完了した後、アレイに直接抗体溶液を適用します。加湿チャンバー内で4℃で30分間、アレイをインキュベートします。 </li><li> （プローブ緩衝液中で3回1分）前と同じ洗浄工程を行い、室温で5分間、卓上遠心機で800×gで50mlのコニカルチューブをスピン。 647 nmでの配列をスキャンする前に30分間、暗所でスライドホルダーの配列を空気乾燥させます。 </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+phosphorylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein phosphorylation in yeast.</a> Nature. 438, 679-684 (2005).</li>
<li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+%26+cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li>
<li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%3A+novel+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li>
<li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li>
<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
<li>Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIm%2C+H+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

プロトコルは提示本来インビボ 1 で新しいキナーゼ相互作用ネットワークの識別をもたらす酵母プロテインキナーゼの異なるファミリーおよび関連にわたって結合活性を比較するために85のユニークな酵母タンパク質キナーゼ-V5融合タンパク質を用いて行きました。新興プロテオミクスプロファイリング技術として、高スループット（HTP）ペプチドライブラリー、および、真核生物および原核生物のモデル生物8,17に依存していたタンパク質マイクロアレイを用いたプロテオームのスクリーニングの開発、後で、このアッセイプラットフォームは、植物およびヒト5,7などの高等真核生物に適用しました。現在のところ、市販の酵母タンパク質配列はありません。しかし、配列は、cDNAコレクションは、複数のリソースから入手できます。検証しました技術が強力なことができますが、心に留めておくべき注意点が1つのアッセイは、インビトロで行われ、こうして結果が偽陽性を持っているということです。したがって、op...

タンパク質生化学およびインビボでの結合活性のグローバル分析を実行する必要性は、タンパク質-タンパク質相互作用（のPPI）と全プロテオーム1,3-8の翻訳後修飾をプロファイリングするための新たな方法の開発をもたらしました。タンパク質マイクロアレイは、全長機能タンパク質4-6,8,9、または抗体10,11を含む分析タンパク質マイクロアレイを用いた機能性タンパク質マイクロアレイとして製造されています。これらは、12を解析幅広い生化学的に行うために必要な実験条件の多様を容易にするために、表面化学の様々な顕微鏡スライド上に配列されたタンパク質の高濃度を含むように操作されています。リジンを介して化学結合またはそのような他の13の中親和性結合のためのHisタグ付きタンパク質およびグルタチオンを取り付けるためのニッケルキレート化スライドのような親和性結合方法のためのニトロセルロースとアルデヒド表面化学。 </p&gt; タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための機能的なタンパク質マイクロアレイの使用は、高品質な機能性タンパク質のライブラリ14へのアクセスを必要とする。S.セレビシエは、ハイスループットクロマトグラフィー精製技術とタンパク質構築物をタグ付けし、高コピー親和性の対形成により、このようなライブラリーを作製に適しています。酵母ゲノムの大部分が、配列決定されており、ほぼ全プロテオームの精製および生化学12を分析するための高コピープラスミドから発現させることができます。タンパク質が得られ、384ウェル形式に配列されると、それらは迅速なパラレルマルチパラメトリック生化学分析およびバイオインフォマティクス尋問8,14-16を可能に顕微鏡スライド上にプリントされています。タンパク質マイクロアレイは、タンパク質、脂質、小分子、および他の多くの用途の中で核酸と酵素アッセイと相互作用するために使用されています。プロテオームの表面上のタンパク質のアクセシビリティアレイは、免疫​​親和性などの分析的検出の異なるタイプにそれらを敏感に反応する表面プラズモン共鳴、蛍光、および多くの他の技術を表面。また、それは、生体内で行うのは難しいかもしれない実験条件の微調整を可能にします。 このプロトコルの目的は、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、機能性タンパク質マイクロアレイの適切な使用を実証することです。このアプリケーションは、目的の高度に精製された分析物（タンパク質）を用いてタンパク質結合活性のハイスループット並列生化学的解析を可能にします。 C末端（カルボキシ末端）は、関心のV5融合ベイトタンパク質は、タンパク質精製のために最適化された酵母株における高コピープラスミドから生成されるタグ付き。 C末端タグは、全長タンパク質が翻訳されていることを保証します。この研究で使用されるタンパク質は、His6Xタグを介して、ニッケル親和性樹脂を用いて精製するTda1-V5融合タンパク質キナーゼです。 Tda1-V5融合constructは、アッセイで使用するための最も高度に濃縮された画分を溶出するためにイミダゾール勾配を使用して、シリアル溶出により精製されます。

<table><tbody><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>バクト酵母エキス</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>シグマ</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>ラフィノース</td><td>シグマ</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>ガラクトース</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura ドロップアウト培地</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>Small Culture tubes</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Erlenmeyer Flask</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge JA-10 rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube (50 ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBSタブレット</td>シ<td>グマ</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrepチューブ(2 mlスクリューキャップチューブ)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Zircon Beads</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ >2</サブシ</td><td>グマ</td><td>M8266&></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール(pH = 7.4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>コンプリート インヒビター カクテル (EDTA フリー)</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ インヒビター カクテル 1</td><td>シグ</td>マ <td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマ</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>振とうインキュベーター(30°C;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニッケルアフィニティ樹脂</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25カラム</td><td>GEライフサイエンス</td><td>27-5325-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ニューテーター</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ゲル (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal V5 Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 タグ付きモノクローナルV5</td>抗体 <td>Life Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Protein Microarraysキット</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix スキャナー</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リフター スリップ</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>溶解バッファー: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM イミダゾール (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail &ndash;EDTAフリー、ホスファターゼ阻害剤カクテル1、1 mM PMSF&nbsp;(使用直前に追加)</td><td></td><td></td><td>試薬を1x PBS(0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウム、0.137 M塩化ナトリウム、pH 7.4)に加えて、所望の量の溶解液を得る</td></tr><tr><td>ブロッキング緩衝液:1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%Tween-20</td><td></td><td></td><td>試薬を1x PBSに添加して、所望の量のブロッキング緩衝液を得る</td></tr><tr><td>プローブバッファー:2 mM MgCl2、0.5 mM DTT、0.05% Triton X-100、50 mM NaCl、500 &mu;M ATP(キナーゼ用)、1% BSA</td><td></td><td></td> 試薬を<td>1x PBSに加えて、必要な量のプローブバッファーを得る</td></tr><tr><td>Wash Buffer:0.1% Triton X-100、500 mM NaCl、0.5 mM DTT、50 mM イミダゾール(pH 7.4)、2 mM MgCl2</td><td></td><td></td>試薬を<td>1x PBSに加えて、必要な量のプローブバッファーを得る</td></tr><tr><td>溶出バッファー:0.1% Triton X-100、0.5 mM DTT、2 mM MgCl2、500 mM NaCl、50 &ndash;500 mMイミダゾール(pH 7.4)、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル&ndash;EDTAフリー、ホスファターゼ阻害剤カクテル1、1 mM PMSF(使用直前に追加)</td><td></td><td></td><td>始める前に、イミダゾールの濃度勾配(50 &ndash; 500 mM)に注意し、濃度ごとに別々のチューブを作成することが重要です(50 mM刻みを使用して間隔を作成することをお勧めします)。試薬を1x PBSに加えて、所望の量のプローブバッファー3x</td></tr><tr><td>YEP +6%ガラクトースを得る:酵母抽出物30 gとペプトン60 gを700 mlのH2Oに溶解し、オートクレーブします。フィルター滅菌した20%ガラクトース(wt / vol)</td><td></td><td></td>を300ml加えます<td>&nbsp;ガラクトースはオートクレーブ滅菌しないでください</td></tr></tbody></table>

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

〜4,200組換え酵母タンパク質を含む高密度機能タンパク質マイクロアレイは、読み出しのためのV5エピトープタグを含むアフィニティー精製酵母キナーゼ融合タンパク質を用いてキナーゼタンパク質 - タンパク質相互作用のために検査されます。精製されたキナーゼは、GAL、誘導性プロモーター下キナーゼ-V5融合構築物を含むプラスミドを有する高コピータンパク質産生のために最適化された酵母株の培養により得られます。酵母は2％ガラクトースで誘導し、続いて6時間、中性の炭素源と制限された培地中で成長させます。次に、培養物を回収し、キナーゼアッセイにおける使用のための高度に精製されたタンパク質キナーゼを得るために、標準的なアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて精製します。精製されたキナーゼアッセイのために適切な範囲のキナーゼ緩衝液で希釈し、タンパク質マイクロアレイは、タンパク質マイクロアレイにハイブリダイゼーションの前にブロックされます。ハイブリダイゼーション後、アレイをモノクローナルV5 antibでプローブしますキナーゼV5タンパク質によって結合したタンパク質を同定するODY。最後に、アレイは、標準的なマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンされ、データは、インビボでの下流の検証のためのタンパク質の相互作用の高い信頼度のセットを決定するために、下流インフォマティクス分析1,2のために抽出されます。

タンパク質-タンパク質相互作用活性は、約4,200ユニークS.を含む酵母機能的タンパク質マイクロアレイに対するベイトタンパク質として構築Tda1-V5タンパク質キナーゼ融合を評価するために、標準的なチップリーダーを用いて観察されましたセレビシエ GST融合タンパク質。 GENEPIXソフトウェアとさらに尋問は、様々な強度の結合事象の多くを明らかにしました。親和性は、その標的（V5-キナーゼ）に結合したモノクローナルV5 - フルオロフォアコンジュゲート抗体に由来する信号の段階的な強度から測りました。 ProCatスコアリングアルゴリズム2（それぞれのタンパク質は、アレイ上の二回スポットし）連でアッセイしたタンパク質のそれぞれのための2つの別個のタンパク質マイクロアレイを横切って、タンパク質-タンパク質相互作用を同定するために使用された後、閾値カットオフを観察し相互作用をスコアリングするために決定されました。 二つの配列を比較することによって、一つはint型を判断するために使用できる4技術的反復（N = 4）を取得します相関...

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

この手順の包括的な目標は、他の技術では不可能な、特定のプロテオーム内のタンパク質、タンパク質相互作用を並行して偏りなく特定することです。これは、顕微鏡スライドの表面上の座標平面に堆積した高度に精製された全長の機能的タンパク質ライブラリーと、目的のタンパク質を最初にハイブリダイズし、エピトープタグを付けることによって達成されます。タンパク質がアレイ上のそれぞれの標的タンパク質と平衡に達すると、結合していない画分を洗い流し、標準的なマイクロアレイスキャナーを使用して、蛍光部分に結合したエピトープに対するモノクローナル抗体でタンパク質相互作用を検出します。得られた画像は、結合タンパク質および蛍光シグナルに関する各特徴の強度に関する情報と織り交ぜられています。この情報は、マイクロアレイ解析ソフトウェアの助けを借りて外挿され、アレイ上の各特徴の強度値のリストが生成されます。タンパク質間相互作用ペアに関する情報は、下流のバイオインフォマティクス解析ソフトウェアにエクスポートして、特徴特異的なデータをスコアリングし、目的のタンパク質とマイクロアレイ上のタンパク質との間のタンパク質相互作用を同定することができます。生のシグナル強度データは、アッセイ間およびアッセイ内の変動を考慮して2つ以上のタンパク質マイクロアレイにわたってコンパイルされ、データは各相互作用をスコアリングするために正規化されます。得られた出力により、相互作用するタンパク質のターゲットリストが生成され、これを使用してタンパク質タンパク質の相互作用をさらに調査することができます。In vivo Functional protein microarrayは、15年以上前にMichael Snyderの研究室で開発されました。それ以来、この技術は、その汎用性と生化学的プロテオミクスアッセイにより、多くの成功を収めています。この技術は、タンパク質相互作用およびモジュラーシグナル伝達ネットワークの研究を容易にするだけでなく、代替接続性および以前に知られていたシグナル伝達カスケードV 5融合キナーゼプローブを培養および精製するために、V5融合タンパク質プレート、合成完全ウラシル、2%デキストロース寒天上の酵母を含む新たに縞模様の酵母株Y 2 58を使用し、凍結培養から3日間摂氏30度で増殖する。単一のコロニーからスターター培養物を接種し、合成完全ウラシルで一晩成長させます。摂氏30度の揺れるプラットフォームまたはホイールに2%のデキストロース。翌朝、400ミリリットルの合成完全ウラシルを接種します。600ナノメートルでの最終光学密度または0.1のOD600を達成するのに十分なスターター培養を含む2%ラフィノース培養。接種物をOD 600 0.6まで増殖させ、その後、十分な3 x 酵母抽出物を添加してV 5キナーゼ融合構築物の発現を誘導します。誘導媒体を3倍に希釈するために6%ガラクトースを添加したペップトーン、または最終的なガラクトース濃度2%の細胞を摂氏30度で6時間、振とうプラットフォーム上で加熱します。2リットルの三角フラスコを使用して、適切な通気を確保してください。細胞懸濁液400ミリリットルをGの1000倍で摂氏4度で5分間回転させることにより、細胞を回収します。細胞を50ミリリットルの氷冷PBSバッファーで一度洗浄し、50ミリリットルの円錐管に移します。ペレットを氷冷リン酸緩衝生理食塩水またはA PBS緩衝液で再度洗浄し、2ミリリットルのスナップキャップチューブに移して溶解します。細胞を20,000倍Gで摂氏4度で1分間回転させた後、ピペットで緩衝液を取り出し、チューブを氷の上に置きます。0.5ミリメートルのジルコニアビーズで、1対1の体積の細胞ペレットをビーズにPBS溶解、緩衝液で溶解します。次に、攪拌プラットフォームを使用して、摂氏4度で2分間隔で混合物を3回ボルテックスします。ライセートを 20 、 000 回、G で遠心分離し、卓上マイクロフュージで 4 °C で 10 分間遠心分離します。清澄化したライセートを、約100μLの予備洗浄済みニッケルアフィニティー樹脂を含むチューブに移し、ニュータネート上で摂氏4度で2時間インキュベートします。ヒスタミン6×タグVを捕捉するために、上清を除去した後、Gの1000倍および摂氏4度で5分間、卓上遠心分離機を使用して樹脂をペレット化する。レジンを洗浄バッファーで4°Cで10分間、ミューテーター上で洗浄します。新鮮な洗浄バッファーでさらに2回洗浄を繰り返します。200ミリモルオールの2つの100マイクロリットル容量でタンパク質を溶出します。グリセロールを最終濃度の30%まで添加し、アッセイで使用するまで摂氏マイナス80度で保存します。インタラクションを検出するため。V five fluoro four conjugated antibody in probe, buffer and and well by shakeing.(V 5フルオロ4標識抗体をプローブ中で260ナノグラム/ミリリットルに希釈し、緩衝し、十分に混合します。次に、V 5融合タンパク質プローブを5〜500マイクログラム/ミリリットルの濃度範囲で希釈します。次に、タンパク質マイクロアレイを冷凍庫から取り出し、使用直前に冷蔵庫で摂氏4度にしてください。ブロッキングバッファーをタンパク質マイクロアレイを含むスライドホルダーに直接追加し、上部をパラフォームで覆って漏れを防ぎます。ブロッキングバッファ内のアレイを、摂氏4度のステージで50RPで振とうして1時間ブロックします。ブロッキング後、アレイを加湿チャンバーに移し、摂氏4度にタイル張りにし、90マイクロリットルの希釈プローブをアレイ表面に直接追加します。アレイを隆起したリフタースリップで覆い、摂氏4度の加湿チャンバー内で振とうせずに1時間半インキュベートします インキュベーション後、スライドを完全に包み込むのに十分な予冷済みプローブバッファーを含む50ミリリットルの円錐管にスライドを追加し、リフタースリップがタンパク質マイクロアレイから穏やかに滑り落ちるようにします。アレイを3本の円錐形チューブでそれぞれ1分間3回洗浄します。洗浄が完了した直後に抗体溶液をアレイに直接塗布し、消去したリフタースリップでオーバーレイします。前回と同様に、加湿チャンバー内でアレイを摂氏4度で30分間インキュベートします。前回と同じ洗浄ステップを実行し、15ミリリットルのコニカルチューブでGの800倍で卓上遠心分離機で5分間回転させます。室温で、スライドホルダー内のアレイを暗闇で30分間風乾してから、アレイを647ナノメートルでスキャンします。この実験では、TDA one V fiveの結合活性を調べました。約4, 200の全長GST融合タンパク質と重複してスポットされた酵母タンパク質マイクロアレイを、エンプティベクターコントロールまたはTDA one V 5プローブでインキュベートしました。インセットパネルは、両方のアレイの同一領域を比較します。特に注目すべきはRIM 11で、興味深いことに、以前に発表された研究でTDA Oneのリン酸化標的としても特定されています。ターゲットが特定されたら、in vivoでの生化学的および機能的活性をテストできます。このビデオをご覧になっている方は、in vivoでのさらなる検証と調査のために、候補タンパク質タンパク質相互作用を同定する手段として機能的タンパク質マイクロアレイを使用する方法について、より深く理解しているはずです。

probing-high-density-functional-protein-microarrays-to-detect-protein

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、マイクロパターン化表面を使用することにより、タンパク質 -...

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

本研究では、特定のタンパク質のグリコシル化プロファイリングに使用することができるレクチン検出法による多重化、ハイスループット抗体マイクロアレイのための改良プロトコルを記述します。このプロトコルは、新しい信頼性の高い試薬を備えており、前の手順に比べて大幅に時間、コスト、およびラボ機器の要件を軽減します。...

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

このビデオでは、ビオチン化細胞透過性ペプチドを使用して細胞内のタンパク質間相互作用を検出する技術を示しています。細胞透過性ペプチドは、結合ペプチドが細胞内に侵入し、その相互作用タンパク質に特異的に結合するのを促進します。ビオチンは、アビジンに結合した後、細胞溶解物から相互作用するタンパク質の複合体を精製することができます。...

タンパク質間相互作用を検出するためのビオチン化細胞透過性ペプチドプローブ

このビデオでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)でのタンパク質間相互作用の可視化を示しています。体壁を単離した後、相互作用するタンパク質を一次抗体とPLA標識二次抗体でプローブします。相互作用するタンパク質が近接しているため、コネクターオリゴヌクレオチドによるプローブのライゲーションが促進され、環状DNAが形成され、ローリングサークル増幅によって増幅されます。蛍光プローブは増幅されたDNAに結合し、NMJでのタンパク質間相互作用の可視化を可能にします。...

近接ライゲーションアッセイを用いたショウジョウバエ幼虫のタンパク質間相互作用の検出

Peptideアレイスクリーニングは、タンパク質間相互作用部位を同定するためのハイスループットアッセイです。これにより、標的タンパク質の複数の相互作用をマッピングすることができ、タンパク質を標的とする阻害剤の部位を同定する方法として役立つことができます。ここでは、ペプチドアレイのスクリーニングと解析のためのプロトコールについて説明します。...

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

タンパク質は互いに相互作用し、これらの相互作用が彼らの機能の大部分を決定します。タンパク質相互作用パートナーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼタンパク質フラグメント相補アッセイ(DHFR-PCA)に基づく酵母適応度アッセイを使用して、in...

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ...

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。...

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

学ぶ 高密度機能タンパク質マイクロアレイを用いたタンパク質間相互作用の検出法。蛍光標識抗体で結合を検出し、バイオインフォマティクス解析へ展開可能な並列ハイスループットアプローチです。

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

さらに動画を探す