タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

この手順の包括的な目標は、他の技術では不可能な、特定のプロテオーム内のタンパク質、タンパク質相互作用を並行して偏りなく特定することです。これは、顕微鏡スライドの表面上の座標平面に堆積した高度に精製された全長の機能的タンパク質ライブラリーと、目的のタンパク質を最初にハイブリダイズし、エピトープタグを付けることによって達成されます。タンパク質がアレイ上のそれぞれの標的タンパク質と平衡に達すると、結合していない画分を洗い流し、標準的なマイクロアレイスキャナーを使用して、蛍光部分に結合したエピトープに対するモノクローナル抗体でタンパク質相互作用を検出します。

得られた画像は、結合タンパク質および蛍光シグナルに関する各特徴の強度に関する情報と織り交ぜられています。この情報は、マイクロアレイ解析ソフトウェアの助けを借りて外挿され、アレイ上の各特徴の強度値のリストが生成されます。タンパク質間相互作用ペアに関する情報は、下流のバイオインフォマティクス解析ソフトウェアにエクスポートして、特徴特異的なデータをスコアリングし、目的のタンパク質とマイクロアレイ上のタンパク質との間のタンパク質相互作用を同定することができます。

生のシグナル強度データは、アッセイ間およびアッセイ内の変動を考慮して2つ以上のタンパク質マイクロアレイにわたってコンパイルされ、データは各相互作用をスコアリングするために正規化されます。得られた出力により、相互作用するタンパク質のターゲットリストが生成され、これを使用してタンパク質タンパク質の相互作用をさらに調査することができます。In vivo Functional protein microarrayは、15年以上前にMichael Snyderの研究室で開発されました。

それ以来、この技術は、その汎用性と生化学的プロテオミクスアッセイにより、多くの成功を収めています。この技術は、タンパク質相互作用およびモジュラーシグナル伝達ネットワークの研究を容易にするだけでなく、代替接続性および以前に知られていたシグナル伝達カスケードV 5融合キナーゼプローブを培養および精製するために、V5融合タンパク質プレート、合成完全ウラシル、2%デキストロース寒天上の酵母を含む新たに縞模様の酵母株Y 2 58を使用し、凍結培養から3日間摂氏30度で増殖する。単一のコロニーからスターター培養物を接種し、合成完全ウラシルで一晩成長させます。

摂氏30度の揺れるプラットフォームまたはホイールに2%のデキストロース。翌朝、400ミリリットルの合成完全ウラシルを接種します。600ナノメートルでの最終光学密度または0.1のOD600を達成するのに十分なスターター培養を含む2%ラフィノース培養。

接種物をOD 600 0.6まで増殖させ、その後、十分な3 x 酵母抽出物を添加してV 5キナーゼ融合構築物の発現を誘導します。誘導媒体を3倍に希釈するために6%ガラクトースを添加したペップトーン、または最終的なガラクトース濃度2%の細胞を摂氏30度で6時間、振とうプラットフォーム上で加熱します。2リットルの三角フラスコを使用して、適切な通気を確保してください。

細胞懸濁液400ミリリットルをGの1000倍で摂氏4度で5分間回転させることにより、細胞を回収します。細胞を50ミリリットルの氷冷PBSバッファーで一度洗浄し、50ミリリットルの円錐管に移します。ペレットを氷冷リン酸緩衝生理食塩水またはA PBS緩衝液で再度洗浄し、2ミリリットルのスナップキャップチューブに移して溶解します。

細胞を20,000倍Gで摂氏4度で1分間回転させた後、ピペットで緩衝液を取り出し、チューブを氷の上に置きます。0.5ミリメートルのジルコニアビーズで、1対1の体積の細胞ペレットをビーズにPBS溶解、緩衝液で溶解します。次に、攪拌プラットフォームを使用して、摂氏4度で2分間隔で混合物を3回ボルテックスします。

ライセートを 20 、 000 回、G で遠心分離し、卓上マイクロフュージで 4 °C で 10 分間遠心分離します。清澄化したライセートを、約100μLの予備洗浄済みニッケルアフィニティー樹脂を含むチューブに移し、ニュータネート上で摂氏4度で2時間インキュベートします。ヒスタミン6×タグVを捕捉するために、上清を除去した後、Gの1000倍および摂氏4度で5分間、卓上遠心分離機を使用して樹脂をペレット化する。

レジンを洗浄バッファーで4°Cで10分間、ミューテーター上で洗浄します。新鮮な洗浄バッファーでさらに2回洗浄を繰り返します。200ミリモルオールの2つの100マイクロリットル容量でタンパク質を溶出します。

グリセロールを最終濃度の30%まで添加し、アッセイで使用するまで摂氏マイナス80度で保存します。インタラクションを検出するため。V five fluoro four conjugated antibody in probe, buffer and and well by shakeing.(V 5フルオロ4標識抗体をプローブ中で260ナノグラム/ミリリットルに希釈し、緩衝し、十分に混合します。

次に、V 5融合タンパク質プローブを5〜500マイクログラム/ミリリットルの濃度範囲で希釈します。次に、タンパク質マイクロアレイを冷凍庫から取り出し、使用直前に冷蔵庫で摂氏4度にしてください。ブロッキングバッファーをタンパク質マイクロアレイを含むスライドホルダーに直接追加し、上部をパラフォームで覆って漏れを防ぎます。

ブロッキングバッファ内のアレイを、摂氏4度のステージで50RPで振とうして1時間ブロックします。ブロッキング後、アレイを加湿チャンバーに移し、摂氏4度にタイル張りにし、90マイクロリットルの希釈プローブをアレイ表面に直接追加します。アレイを隆起したリフタースリップで覆い、摂氏4度の加湿チャンバー内で振とうせずに1時間半インキュベートします インキュベーション後、スライドを完全に包み込むのに十分な予冷済みプローブバッファーを含む50ミリリットルの円錐管にスライドを追加し、リフタースリップがタンパク質マイクロアレイから穏やかに滑り落ちるようにします。

アレイを3本の円錐形チューブでそれぞれ1分間3回洗浄します。洗浄が完了した直後に抗体溶液をアレイに直接塗布し、消去したリフタースリップでオーバーレイします。前回と同様に、加湿チャンバー内でアレイを摂氏4度で30分間インキュベートします。

前回と同じ洗浄ステップを実行し、15ミリリットルのコニカルチューブでGの800倍で卓上遠心分離機で5分間回転させます。室温で、スライドホルダー内のアレイを暗闇で30分間風乾してから、アレイを647ナノメートルでスキャンします。この実験では、TDA one V fiveの結合活性を調べました。

約4, 200の全長GST融合タンパク質と重複してスポットされた酵母タンパク質マイクロアレイを、エンプティベクターコントロールまたはTDA one V 5プローブでインキュベートしました。インセットパネルは、両方のアレイの同一領域を比較します。特に注目すべきはRIM 11で、興味深いことに、以前に発表された研究でTDA Oneのリン酸化標的としても特定されています。

ターゲットが特定されたら、in vivoでの生化学的および機能的活性をテストできます。このビデオをご覧になっている方は、in vivoでのさらなる検証と調査のために、候補タンパク質タンパク質相互作用を同定する手段として機能的タンパク質マイクロアレイを使用する方法について、より深く理解しているはずです。