単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

この手順の包括的な目的は、ERミトコンドリア膜上の目的のタンパク質を任意の抗体で免疫標識し、ミトコンドリア機能と並行して分析することです。これは、最初にラットから脳、脊髄、肝臓などの目的の組織を収集することによって達成されます。2番目のステップは、ミトコンドリアを組織(この場合は脊髄)から分離することです。

脊髄はダンスで均質化されます。ホモジナイザーやその他のオルガネラ、および細胞日の破片は、ミトコンドリアを12%optiの溶液と混合することにより、中枢神経組織の主要な汚染物質であるミエリンが達成されるまで、一連の遠心分離ステップを通じて除去されます。次に、単離したミトコンドリアを選択した一次抗体で標識し、続いてFluorに結合した二次抗体で標識します。

最後のステップは、ミトコンドリアの同一性またはむしろ機能パラメータを確認するために蛍光色素を追加することです。最終的に、フローサイトメトリーは、正常な生理機能または疾患全体にわたるミトコンドリアアルト膜の相対的な存在量を示すために使用されます。この手法が顕微鏡法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、数千の個々のミトコンドリアのハイスループットと迅速な定量を可能にすることです。

この研究で使用された動物は、カナダ動物ケア航空評議会によって概説された国家基準に従って、C-R-C-H-U-M動物保護委員会によって承認されたプロトコルに厳密に従って扱われました。この手順を開始するには、ラットから採取した無傷の脊髄全体を、5容量のホモジナイザーを含む5ミリリットルのガラス製ホモジナイザーに入れます。ガラスホモジナイザーを氷の上に置き、大きな組織がなくなるまで手で組織を均質化しますが、これには約8回のストロークが必要です。

ホモジネートを2つまたは3つのマイクロ遠心チューブに移し、1、300回Gで4°Cの10分間遠心分離します。750マイクロリットルの均質化緩衝液をペレットに加え、ペレットを穏やかに再懸濁します。次に、懸濁液を遠心分離し、ペレットを再懸濁します。

小さな破片を取り除くためにさらに2回、すべての上清を同じ5ミリリットルの超遠心チューブに引き込み、チューブを超遠心ローターに入れます。スイングバケットを装備し、チューブを17、000倍Gで摂氏4度の15分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、細胞質画分が目的の場合は、さらなる処理のために上清を保存します。

次に、50ミリモルの塩化カリウム遠心分離機を含む4ミリリットルの均質化緩衝液中の粗ミトコンドリア画分であるペレットを懸濁します。スイングバケットローターで摂氏4度で15分間Gの17,000倍に再懸濁したペレットを、その後、すくいを廃棄し、再懸濁したペレットの正確に800マイクロリットルの新しい5ミリリットルの超遠心チューブ内の均質化緩衝液の800マイクロリットルでペレットを静かに再懸濁します。次に、再懸濁したペレットの800マイクロリットルに200マイクロリットルのiod dalをピペットで入れて、最終濃度の12%iod Dalを作成します。

P 1000ピペットでチューブの内容物を穏やかに、しかし徹底的に混合し、次にスイングバケットローターで摂氏4度で15分間Gを17, 000倍で遠心分離し、チューブの上部にあるミエリンの層を吸引し、パレットが緩んでいる可能性があるため、穿蔽液を慎重に廃棄します。Resusは、ペレットを4ミリリットルの均質化緩衝液に懸濁します。次に、スイングバケットローターで摂氏4度で15分間、Gの17,000倍でゲインを遠心分離します。

supinateを捨てて再帰します。ペレットを4ミリリットルの均質化緩衝液に懸濁します。その後、再度遠心分離を繰り返し、仰臥位の薬剤reusを除去します。

最終ペレットを100〜200マイクロリットルの均質化緩衝液で曲げ、1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。バイオニック酸アッセイやBCAなどの標準的なタンパク質定量アッセイを使用して、各サンプル中のタンパク質の量を測定します。定量用のサンプルを調製する際は、サンプルと標準曲線を2%硫酸ナトリウムで希釈し、ミトコンドリアが適切に可溶化されるようにします。

試験する染色混合物ごとに、単離されたミトコンドリア25μgを1.7ミリリットルのマイクロセントリチューブにピペットで移します。各実験に未染色のサンプルだけでなく、各抗体の適切なアイソタイプコントロールを含めるようにしてください 試験した各抗体の遠心分離機で、各サンプルを17, 000倍Gで2分間、摂氏4度で遠心分離します。次に、すり酸を取り出し、単離したミトコンドリアを50マイクロリットルのミトコンドリア緩衝液に再懸濁します。

10%脂肪酸を含まないBSAを添加し、溶液を摂氏4度で15分間インキュベートし、溶液1ミリリットルあたり20μgの一次抗体を添加します。単離したミトコンドリアを一次抗体と4°Cで30分間インキュベートして、未結合の抗体を洗い流し、各サンプルを遠心分離して仰臥位のナタントを廃棄します。次に、ペレットを200マイクロリットルのミトコンドリア緩衝液に穏やかに再懸濁し、次に遠心分離ステップを繰り返し、仰臥位の被覆体を廃棄し、ペレットを50マイクロリットルのミトコンドリア緩衝液に再懸濁します。

サンプル1ミリリットルあたり0.5マイクログラムの二次抗体を添加します。次に、サンプルを4°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。インキュベーションが完了したら、各サンプルを遠心分離し、結合していない二次抗体を含む仰臥躙を廃棄します。リース。

ペレットを200マイクロリットルのミトコンドリア緩衝液に懸濁し、サンプルを遠心分離します。又。次に、supinateとReeseを取り外します。ペレットを500マイクロリットルのミトコンドリア緩衝液に懸濁して、観察されたイベントが実際にミトコンドリアであることを確認します。

VitrogenのMITトラッカーグリーンなどのミトコンドリア特異的蛍光色素でサンプルを暗所で15分間染色します。他の機能パラメータを調べるためにこれ以上の染色が必要ない場合は、標識したサンプルをフローサイトメーターへのローディングに適したチューブに移します。サンプルを氷上に保持し、単離されたミトコンドリアが無傷の膜貫通電位を有することを確認するためにフローサイトメーターに進み、ミトコンドリアを100ナノモルのテトラエチルロッドドミンメチルエステルで染色し、室温で15分間、テトラエチルロッドドミンで染色するためのコントロールとして暗所で確認します。

メチルエステルは、100マイクロモルのシアン化カルボニルmクロロフェノールHydroOneの存在下で、100ナノモルのテトラエチルロッドドミンメチルエステルで単離されたミトコンドリアを染色します。この化学物質はミトコンドリアのアンカップリングであり、ミトコンドリアを脱分極して単離されたミトコンドリアがスーパーオキシドを生成することを確認し、ミトコンドリアのスーパーオキシド産生のコントロールとして、室温で15分間、暗闇でVitrogenからミトコンドリアを赤く染めます。10マイクロモルのアンチマイシンの存在下で染料を使用して単離されたミトコンドリアに滞在します。

アンチマイシンAは、呼吸鎖の複合体3の阻害剤であり、獲得が始まる前にミトコンドリアのスーパーオキシド産生を増強します。付属のテキストプロトコルで説明されているように、機器をセットアップします。次に、チューブを軽くたたいてサンプルを混合しますが、ボルテックスはしないでください。

ゲート中に低圧で初期イベントの収集を開始します。総人口に基づいてゲートするようにしてください。次に、それに応じてヒストグラムの電圧を調整します。

未染色サンプルのピークは、通常、2番目の10年に対応します。次に、ゲートが確立され、サンプルが処理されたら、圧力を高フローサイトメトリーに切り替えます。脊髄製剤の分析により、イベントの94%がミトコンドリア特異的色素に対して陽性であることが特定されました。

この実験では、ミトコンドリア陽性事象の30%を、ミトコンドリアの外膜の融合に関与するタンパク質であるMIT融合2に特異的な抗体で標識しました。テトラエチルルミンメチルエステルを用いたミトコンドリア膜貫通電位の解析により、単離されたミトコンドリアの95%が無傷の膜貫通電位を有することがわかった。この染色は、ミトコンドリアの存在下で行われたときに染色の有意な減少が見られ、膜透過性色素を使用して測定すると基礎量のSUP酸化物を生成することがわかったため、特異的であることが示されました。

それがSUP酸化物との蛍光P反応になります。アンチマイシンAによるミトコンドリアの処理は、習得するとスーパーオキシド産生が約10%増加します。この手法は、適切に実行すれば6〜7時間で実行できます。