Name: トランスジェニックの世代ハイドラ胚マイクロインジェクションによる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶ ハイドラ胚マイクロインジェクションによるトランスジェニック作成法。プラスミドDNAを1～8細胞期の胚に注入し、蛍光顕微鏡で発現を可視化する。安定した系統樹立により再生能力と遺伝子機能の研究に応用できる。

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この作品は、HLにG.ハロルド＆レイラY.マザーズ賞でサポートされているとRESCEJにNIHの助成金（R24 GM080527）はNRSA博士研究員（NIH F32GM9037222）され、現在国立からの指導研究員開発賞でサポートされていた老化に関する研究所（K01AG04435）。私たちは、有益なコメントを頂いた査読に感謝したいと思います。

プラスミドDNA、針及び注射料理の調製<ol><li>高速マキシやミディキットを用いてプラスミドDNAを調製し、エタノール沈殿を用いて溶液を2.5mg / DNAに集中する。 DNAペレットをヌクレアーゼフリーの脱イオン水に溶解されるべきである。 -20℃で10〜20μlのアリコート中のDN​​Aを保管してください。 （入手可能なベクターのリストについては、 補足表1を参照してください） </li><li> 100×15ミリメートルペトリ皿に胚を保持するためのトラフを構築するためにアガロース用いて射出料理を作る。 <ol><li>角度で100×15ミリメートルペトリ皿に75×50ガラス顕微鏡スライドを配置します。ペトリ皿にヒドラ媒体 24内で溶融、2％アガロースの約50ミリリットル注ぐ。あるいは、第皿にアガロースを注ぎ、トップの「マイクロインジェクション魚モールド」をフロート。 </li><li>アガロースが固化した後、ガラススライドや金型を削除します。ガラススライドを使用した場合、剃刀のbla過剰アガロースを切り取るドは、壁を形成する。皿にハイドラ培地を注ぎ、すぐにそれを使用したり、必要になるまで4℃で保管してください。注：使用の間、4℃で保存した場合、注入皿を再利用することができる。 </li></ol></li><li>彼らがあるように、ペトリ皿中の粘土の狭いストリップにそれらを押すことで、熱525、75を引いて、速度100、時間50店舗針：以下の条件を用いてプラーマイクロピペット上のフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーから針を引き出します皿の底に平行に保持。 </li><li>注射液を調製し、10％のフェノールレッドの2μlの2.5 mg / mlのプラスミドDNA溶液を3μlを組み合わせること。溶液を短時間ボルテックスし、次いで針を詰まらせる可能性のある粒子を除去するために微量に最大速度で10分間、それを回す。 </li><li>解剖顕微鏡下で、小さな開口部を作成するためにピンセットで先端から針数ミリメートルのクリップ。注：オープンの適切なサイズに多少の柔軟性があります圧力がこの変化に対応するために、ステップ3.3に調整することができるのでる。 </li><li>それは、先端を下にして垂直に針を保持しているように、ペトリ皿を置きます。針の後端に液体をピペッティングすることにより注射液の約0.5μlの針をロードします。毛細管現象を針の先端に解決策を引っ張るようにします。 </li></ol>注射用胚の作製<ol><li>毎日のように卵を生産するためのポリープハイドラ AEP株文化をスキャンします。これらのポリープを収集し、別の培養皿に保管します。卵形成の進行状況を監視するために、日中、これらのポリープを数時間ごとに観察します。卵は外胚葉を突破と後退外胚葉細胞のリングの上に座るとき、彼らは注射の25の準備ができている。受精を可能にするために、注入前に少なくとも1時間精巣を持つ複数のハイドラと皿にこれらのポリープを置きます。 ハイドラ&lt;/ em&gt;の男性は、特別な操作を行わずに精子を放出する。 </li><li>メスが完全に形成された約400μmの直径が25である、卵、または1〜8細胞期胚とAEPコロニーで発見された場合、また、注射のために、これらを収集します。すぐに切断し始めている胚を注入する。注：これは、完全に形成された卵や単細​​胞接合体の違いを見分けることができず、従って、これらは、注射前に男性と一緒にインキュベートされるべきである。 </li><li>注射の前に、＃15刃でメスを用いて胚の上下に親の組織の大部分を除去。取付体列の小片でのみ胚を残すが、必要に応じて鉗子で胚を操作するために使用される。注：胚から離れて解剖されている組織が ​​再生成され、女性はハイドラコロニーに残ることを保証するために保存する必要があります。 </li><li>パスツールピペットを用いて、それらの壁に平行に配置し、注入皿に胚を移動アガローストラフ。 </li></ol>プラスミドDNAの3マイクロインジェクション<ol><li>鉄板に座っ磁気スタンドにインジェクターをマウントします。ジョイスティックマイクロマニピュレーターで、針を保持しているマイクロインジェクターの一部であるインジェクションホルダーをマウントします。マグネチックスタンドで、鉄板にジョイスティックマニピュレータをマウントします。解剖顕微鏡の右側にあるこの全体のセットアップを置き、観察視野に表示されているように、注射ホルダーを配置します。 </li><li>アガローストラフの垂直壁が左にあるように配向解剖顕微鏡下で胚を注射料理を置きます。インジェクションホルダーに針を挿入し、皿にハイドラ媒体への針の先端を下げる。 </li><li>鉱物油は、針の上部を満たし、注射液の安定した流れがHydrに針を出観察されるまでゆっくりと時計回りの方向に注射器のノブを回すミディアム。ストリームが強すぎると、反時計回りにノブを回して圧力を下げる。日常（針がステップ1.5にクリップされたか、すなわち ）針開口部の大きさに依存する適切な圧力を得るために、このステップを練習。注：ストリームが強すぎると、胚は注入を生き残ることはありません。 </li><li>解剖顕微鏡を通して見ながら最初の胚は、フィールドの中心にあるように、注射用の皿を移動します。それがその胚に触れているように、針を移動します。針で胚を貫通するマイクロマニピュレーターを使用してください。注：アガローストラフの垂直壁は、針でわき押されてから胚を維持します。 </li><li>注射液は、胚1または2秒に流入し、その後すぐに針を除去することを許可します。胚は複数のセルを有する場合、個別のセルを注入する。針の先端で次のセルを整列させるために胚を再配向するために鉗子を使用してください。 </li><li>最初エンブリーの後oは次胚が注入位置となるように皿を移動し、手順を繰り返し、注入される;すべての胚が注入されるまで継続する。 </li></ol> 4。胚の培養および孵化<ol><li>精巣を持つ少数のハイドラと皿に注入した胚のすべてを移動します（これはすべての胚が受精していることを確認することです）。彼らは胚形成を継続しながら、18℃のインキュベーター内で胚をインキュベートする。 </li><li>キューティクル段階に達すると、 ハイドラ媒体が充填された24ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ注入された胚を移動させる。 </li><li> 18℃の暗所で2週間注入した胚をインキュベートする。 </li><li> 2週間の潜伏期間の後、解剖顕微鏡下でそれぞれ注入された胚をご確認ください。キューティクル段階の胚は、親組織の小片から切り離されており、親の組織が再生していたいずれの場合に注意してください。それはマイルにならないように、すぐにこの再生されたポリープを削除する新しい雛のためにstaken。 </li><li> RTで水槽の光の下で注入した胚の皿を移動します。毎日のプレートを確認し、孵化を収集します。 ハイドラポリープの典型的なピンク色は、彼らが食べるアルテミアから来ているので、新孵化は白になります。 </li><li>導入遺伝子の発現を検出するために、蛍光顕微鏡下で孵化を観察します。 </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
<li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li>
<li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+genome+of+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li>
<li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li>
<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
<li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li>
<li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals%3A+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li>
<li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li>
<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
<li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li>
<li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8(2009).</li>
<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません

Hydraは日常的に無性再現しますが、配偶子の生産を開始する環境刺激を必要とします。これらの刺激はほとんどハイドラ種について、明確に定義されておらず、歪み歪みと異なる場合があります。それは性的になるためにハイドラを誘導するために実験室の設定で困難な場合がありますので、トランスジェニックハイドラの生産に重要なハードルは定期的に胚を得ることである。 AEP株25は 、しかし、実験室で容易に配偶子を生産し、これは、トランスジェニック系統を作製するためにこれまで使用されてきた唯一の株である。配偶子産生を誘導するための最も一般的な方法は、食事操作によるものである。前述のように、動物は、時間配偶子1を生産される間に、3週間毎日与え5日間飢餓状態にし、その後週に二回供給されるべきである。それはまた、おそらく粗腐植をシミュレート、水槽26内の垂直プレート上AEP ハイドラを培養する私たちの経験をされています電子自然環境、動物を一定間隔で供給される場合でも、卵の産生をもたらす。また、AEP自己交配か...

Hydraは再生、パターン形成を研究し、約250年2のための幹細胞に使用されているHydraは 3つの細胞系統からなるシンプルなボディープランがあります。外胚葉上皮、内胚葉上皮と間質を。管状体は、単一の細胞層でそれぞれが外胚葉と内胚葉上皮系統によって形成される。体内の欄の上皮細胞のすべてが有糸分裂である。上皮細胞は、尾方端に経口端部または足に四肢3、ヘッド（口および触手）（基礎円板）に変位するとき、それらは、細胞周期のG2期で停止させると、細胞の運命4を変更する。間質細胞系統の細胞は、上皮細胞間の隙間内に存在する。この系統は、本体コラム5の外胚葉上皮層に位置している多能性幹細胞でサポートされています。間質幹細胞を3セルの体細胞を生じさせるLタイプ（神経、腺細胞、およびnematocytes）と生殖細胞6,7。 門刺胞動物、すべてbilateriansの姉妹グループの一員として、Hydraは多細胞動物の間で共有の基本的な生物学的プロセスに光を当てることができます。最近まで、これらの努力は、遺伝子機能の摂動のための信頼できる方法の欠如により妨げられた。しかし、トランスジェニック手法1の開発を、私たちは今、幹細胞機能、再生、およびパターニングなどの多細胞動物に共通する基本的なメカニズムのよりよい理解を得るためにハイドラを最大限に活用することができます。トランスジェニックヒドララインは、孵化のかなりの頻度でランダムな組み込みおよびキメラ発現をもたらす胚へのプラスミドDNAの注射によって確立される。特定の系列に均一発現とラインが無性繁殖によって確立することができる。クローン的transgを増殖させる能力ENIC ヒドララインは、有性生殖により増殖することができる動物モデルの大部分よりも有利で ​​ある。また、トランスジェニック細胞は、動物の透明性および内因性蛍光タンパク質8が存在しない場合にインビボで容易に追跡することができる。 第一のトランスジェニックヒドラ線が1行われたので、7年間、そのような線は、さまざまな用途に使用されてきた。異なる細胞型における蛍光タンパク質の発現は、細胞の動きを追跡する細胞形状の変化を観察し、野生型条件および化学的摂動1,5,9-12後の両方において細胞の運命を追跡することが可能となった。また、さまざまな系統の異なる蛍光タンパク質の発現は、特定の細胞集団のFACS単離を可能にする。この技術は、幹細胞特異的mRNAおよび系統特異的低分子RNA 13,14の配列決定のために使用されてきた。プロモーターの一方2 ヒドラアクチン遺伝子の一つは、最も広く使用されているいくつかの細胞型特異的プロモーターを同定し、トランスジェニックヒドラ 9,11,15,16でGFPの発現を駆動するために使用されている。将来的には、細胞型特異的プロモーターは、任意の特定の細胞型の観察および回収を可能にする。また、トランスジェニックアプローチは、成功しWnt3をプロモーター17のシス作用調節エレメントを定義するために使用された。 ハイドラにおけるトランスジェニック方法の開発が異所性発現、過剰発現、およびノックダウンにより遺伝子の機能をテストするための堅牢なアプローチを提供します。トランスジェニック動物は、機能および細胞局在18-20の両方を検討するために、蛍光標識タンパク質を発現することが行われている。また、GFP導入遺伝子の3&#39;UTR中のRNAヘアピンの発現は、標的遺伝子21,22のノックダウンにつながる。これらのアプローチでは、GFPを識別するために必要とされているトランスジェニックラインの作成中にトランスジェニック組織を追跡します。しかしながら、いくつかのケースではGFP分子は、タグ付きタンパク質の機能を妨害する可能性がある。最近の研究では、 イドラ遺伝子がオペロン構成に配置することができることを実証する、 すなわち、多シストロン性転写物はその後、トランス-スプライスリーダーを添加することにより分離し、個別に23翻訳される、作製される。タンパク質またはオペロンと下流位置における蛍光タンパク質遺伝子の上流位置でヘアピンRNAをコードする遺伝子を配置することによって、人は、タンパク質またはRNAヘアピンをコードする遺伝子をタグ付けすることなく、トランスジェニック組織を追跡することができる。この方法は、14遺伝子ノックダウンを達成するためにDsRed2のとオペロン構成のRNAヘアピンを発現するために使用されてきた。

<table><tbody><tr><td>AEPハイドラ株</td><td></td><td></td><td>メール:セリーナジュリアーノ celina.juliano@yale.edu または清水浩 bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>高速マキシキット</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mmシャーレ</td><td>BDファルコン</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mmガラス顕微鏡スライド</td><td>シグマ</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクション魚型IBI</td><td>サイエンティフィック</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス フィラメント</td>サ<td>ッター機器</td>付き <td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm 長さ</td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウン マイクロピペット プーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>フェノール レッド</td><td>シグマ</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>ジュエラーズ鉗子, ダーモント #5</td><td>シグマ</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード #15</td><td>フィッシャー</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>シグマ</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>成重</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>成重</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>鉄板</td><td>成重</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>ジョイスティック マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

トランスジェニックの世代ハイドラ胚マイクロインジェクションによる

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

すべての二国間動物の姉妹グループであるCnidaria門の一員として、Hydraは多細胞動物間で共有される基本的な生物学的プロセスに光を当てることができます。Hydraは、再生、パターン形成、幹細胞の研究のモデルとして使用されます。しかし、遺伝子摂動が分子機能を研究するための信頼性の高い方法がないため、研究努力が妨げられてきました。トランスジェニック法の開発により、Hydra生物学の研究が活性化しました1。トランスジェニックHydraは、生細胞の追跡、生化学的分析のための純粋な細胞集団を生成するための選別、ノックダウンおよび過剰発現による遺伝子機能の操作、およびプロモーター機能の解析を可能にします。初期段階の胚に注入されたプラスミドDNAは、発生の初期にランダムにゲノムに組み込まれます。これにより、3つの系統(外胚葉上皮、内胚葉上皮、または間質)の1つ以上の組織パッチに導入遺伝子を発現する孵化したばかりの子ガメが生まれます。トランスジェニック組織で孵化したばかりの子ガメを得る成功率は10%から20%の間です。トランスジェニック孵化したばかりの子ガメの無性繁殖は、特定の系統で一様にトランスジェニック系統を確立するために使用されます。トランスジェニックHydraの生成は驚くほど簡単で堅牢ですが、ここでは低コストで簡単に実装できるプロトコルについて説明します。

トランスジェニックハイドララインの確立 アルテミアノープリウスを2〜3日ごとジェニック孵化フィード。孵化は時に孵化後一日か二日のために食べてはいけない。いくつかの新しい孵化は食べることはありませんので、生き残ることはありません。雛は、外胚葉（ 図1A）または内胚葉上皮組織のいずれかでトランスジェニックであれば、動物はほとんどのトランスジェニック組織（ 図1B、C）を持っている芽を芽を収集することができます。トランスジェニック系統は、外胚葉（ 図1D）または内胚葉上皮細胞系統のいずれかで導入遺伝子の均一な表情で確立されるまで、新たな芽でこれを行うに進みます。同時に、第2行は、導入遺伝子を含むが（ 図1B）、それ以外の遺伝的に同一でないことを確立することができる。この行は、将来の実験の陰性対照として役立つ。トランスジェニック組織は私を移動していない場合つぼみNTO、それが動物をカットし、それがトランスジェニック組織は新しい...

安定トランスジェニックHydraは、プラスミドDNAの胚へのマイクロインジェクションと、それに続くランダムなゲノム統合と無性増殖によって作られ、均一な系統を確立します。トランスジェニックHydraは、RNAiを使用して細胞の動きを追跡し、遺伝子を過剰発現し、プロモーター機能を研究し、遺伝子発現をノックダウンするために使用されます。

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

この手順の全体的な目標は、血漿DNAをヒドラ胚にマイクロインジェクションしてトランスジェニック系統を作製することです。これは、最初に血漿DNA溶液を調製し、それを注射針にロードすることによって達成されます。次に、血漿DNA溶液を1〜8細胞段階の間のヒドラ胚に注入します。次に、ヒドラ胚を発育させて孵化させ、トランスジェニック組織を持つ幼体を選択します。最後のステップは、元のトランスジェニック動物の無性芽によって均一なトランスジェニック系統を作成することです。最終的に、蛍光顕微鏡法を使用して、ヒドラのトランスジェニック発現を視覚化します。この方法は、低コストでトランスジェニックハイドロラインを作成したい研究者向けに設計されているため、現在のハイドロ研究者だけでなく、このモデルを使い始めたばかりの研究者にとっても、この有用な技術をより広く適用できます。トランスジェニックヒドラは、組織動態、ノックダウンや過剰発現によるタンパク質局在遺伝子機能、さらにはプロモーター機能の研究に用いられます。テキストプロトコルに従って血漿DNAを調製した後、最初に75 x 50ガラス顕微鏡を配置して注射皿を調製します。100 x 15 mmのシャーレに斜めにスライドさせ、50ミリリットルのヒドラ培地に2%のアグロスを溶解します。冷まします。次に、それをペトリ皿に注ぎます アグロスが固まったら、スライドガラスを取り外し、かみそりの刃で余分なアグロスを切り取って壁を形成します。次に、すぐにヒドラメディウムを皿に注ぎ、すぐに使用するか、必要になるまで摂氏4度で保管します。注射液を調製するには、2マイクロリットル/ミリグラム/ミリリットルの血漿DNA溶液を3マイクロリットルと2マイクロリットルの10%フェノールレッド溶液を組み合わせます。.溶液を短時間ボルテックスした後、マイクロ遠心分離機で最高速度で10分間回転させ、解剖顕微鏡で針を詰まらせる可能性のある粒子を取り除きます。鉗子を使用して針を先端から数ミリメートルクリップし、小さな開口部を作ります。針の入ったシャーレの向きを、針が先端を下にして垂直位置になるようにします。次に、約0.5マイクロリットルの注射液を針の後端にピペットで入れます。胚を注入するためには、まず卵子を産生するポリープのEP株培養物であるヒドラをスキャンすることから始めます。これらのポリープを集めて、別の培養皿に移します。日中数時間ごとにこれらのポリープを観察して、卵形成の進行状況を監視します。卵が外胚葉を突破し、引っ込められた真皮細胞のリングに座ると、彼らは注射の準備ができており、卵子が注入の準備ができているポリープを、精巣を持ついくつかのヒドラのある皿に注射する準備ができています。これは、完全に形成された卵子または1〜8細胞期の胚を持つEPコロニーで女性が見つかった場合、受精を可能にします。また、注入前にこれらを注射用に収集します。15番の刃が付いたメスを使用して、切断を開始した胚の上下の親組織のほとんどを取り除き、親の体柱の小さな部分だけが付着したままになります。解剖した組織をヒドラ培地に保存しておけば、再生し、雌がヒドラコロニーに留まるようにします。牧草地のピペットを使用して、切断された胚を注入皿に移し、それらをアグロストラフの壁と平行に配置します。鉄板の上に座っている磁気スタンドに取り付けられたマイクロインジェクターを準備します。針を保持するマイクロインジェクターの一部であるインジェクションホルダーをジョイスティックマイクロマニピュレーターに取り付けます。マグネットスタンドを使用して、ジョイスティックマニピュレーターを鉄板に取り付けます。次に、セットアップ全体を解剖顕微鏡の右側に置き、観察フィールドに見えるように注入ホルダーを配置します。胚を入れた注射皿を、アグロストラフの垂直壁が左側になるように向きを変えた解剖顕微鏡の下に置きます。針を注射ホルダーに挿入し、針の先端を皿のヒドラ培地に下げます。次に、シリンジのノブを時計回りにゆっくりと回し、鉱油が針の上部を満たし、注射液の安定した流れが針からヒドラ媒体に出るのが観察されます。流れが強すぎる場合は、ノブを反時計回りに回して圧力を下げます。胚を視野の中央に配置し、針を動かして胚に触れるようにします。次に、マイクロマニピュレーターを使用して胚に針を突き刺し、注入液を1〜2秒間胚に流し込んでから、針をすばやく取り除きます。胚に複数の細胞がある場合は、各細胞を個別に注入します。すべての胚が注入されるまで続けます。すべての胚が注入されたら、精巣を持つEPポリープであるヒドラを数個入れた皿に移し、胚形成を続けながら摂氏18度でインキュベートします。胚がキューティクル段階に達したら、各胚をヒドラ培地で満たされた24ウェルプレートのウェルに移し、摂氏18度の暗闇で2週間インキュベートします。次に、解剖顕微鏡で、各胚が親組織の小片から剥離し、その組織の再生を確認します。存在する場合は、新しい孵化したばかりの子ガメと間違えないように、すぐに取り除きます。各胚を確認した後、室温の水槽用光の下で皿を動かします。毎日プレートをチェックし、孵化したばかりの子ガメを集めてください。新しい孵化したばかりの子ガメは、まだ食べていないため、色が白くなります。蛍光顕微鏡で観察し、導入遺伝子の発現を観察します。アートナポリを使用して、2〜3日ごとにトランスジェニック孵化したばかりの子ガメに餌をやります。皮電組織または内胚葉上皮組織のいずれかでトランスジェニックである孵化したばかりの子ガメが芽を産生すると、導入遺伝子の発現が評価されます。ここに示されているのは、アクチンプロモーターの制御下にある2つの導入遺伝子であるDs redのキメラ発現を持つ孵化したばかりの子ガメ、および外胚葉上皮細胞のパッチです。動物による連続的な出芽は、最終的に、皮電系または内胚葉上皮系譜のいずれかにおいて導入遺伝子の均一な発現を有する系統を産生することができる。ここに見られるように、元の孵化したばかりの子ガメは今、2つの新しい芽を生み出しています。アスタリスクでラベル付けされた芽にはトランスジェニック組織はなく、トランスジェニック株の存在を除いてトランスジェニック系統と遺伝的に同一である制御系統の創設動物として使用されました。この動物は、元の孵化したばかりの子ガメから作られたトランスジェニック組織を持つ最初の芽です。これらの生物学的機能に影響を与えない導入遺伝子を用いた実験により、上皮トランスジェニック組織と孵化するヒドラの約30%から均一な上皮細胞株が樹立されました。ここで見られるような均一な皮膚電気ラインは、内胚葉ラインよりも33〜50%少ない頻度で確立されます。したがって、このビデオを見た後、トランスジェニックハイドロラインの作り方をよく理解しているはずであり、これにより、このモデルで実行できる機能研究のレパートリーが追加されます。

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生物学

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