Name: ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶ ルシフェラーゼ発現ウイルスの高スループット滴定法。Vero細胞を用いて発光強度からウイルス価を迅速に定量し、細胞生存能も同時評価できます。従来のプラーク法に代わる効率的なウイルス学手法です。

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Vanessa Garciaは、クイーン・エリザベス2世オンタリオ州科学技術大学院奨学金と、コーリー・バテンチャック自然科学工学研究評議会のフェローシップによって資金提供を受けています。

1試料の調製<ol><li> 96ウェルプレートに滴定し、転送のためのルシフェラーゼを発現するウイルス（例としてここにVSVΔ51-Flucを）を含むサンプルを得る。あるいは、直接に96 - ウェル組織培養プレートおよび使用上清中の感染を行う。 </li><li>標準曲線を含めるために、未処理の2つの列を残します。 96ウェルプレート中で直接行われた実験のために、後日、-80℃及び力価における実験（40時間後に感染症）またはストアの終わりに力価。 </li></ol>ウイルス力価測定のための許容細胞の調製<ol><li>滴定前の24時間は、2.5×10 5〜10％ウシ胎児血清（FBS）、30mMのHEPESを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中の細胞/ mlおよび1％ペニシリン/の濃度でVero細胞の懸濁液を調製ストレプトマイシン。注：このプロトコルは、Vero細胞を用いたが、VSV感染のための任意の適切な許容細胞系は、bの可能性eが使用。 </li><li>マイクロプレートディスペンサーを用いて、96ウェル白色固体平底プレートに2.5×10 4個の細胞（100μl）をシード。 <ol><li>プライミングのためにプレートあたりの細胞懸濁液12ミリリットルを加えた5ミリリットルを用意します。 </li><li>滅菌水50mlでチューブをフラッシュすることでクリーンマイクロプレートディスペンサーカセット。 </li><li>細胞懸濁液をマイクロディスペンサ線を記入し、細胞懸濁液5mlを介して流す。 </li><li>白壁の96ウェルプレートの各ウェルに100μLを分注するプログラムを選択します。分注、および追加のプレートについて、必要に応じて繰り返します。不透明な底の白壁プレートは細胞の健康と密度の検証に使用されている場合にも96ウェル透明平底プレートにいくつかのウェルをシード。 </li><li>元の容器に終了し、フラッシュセル。チューブを通して暖かいの滅菌水50ml、続いて70％エタノール50ミリリットルを実行して、カセットを清掃してください。 </li><li>カセットとチューブは、pであることを確認してくださいpropriately使用の間に掃除した。 </li></ol></li><li>加湿した5％CO 2インキュベーター中で37℃で24時間細胞をインキュベートします。 </li></ol>ウイルス標準曲線の調製<ol><li> 10 8 pfu / mlで、10 7 pfu / mlでの、：無血清DMEM中でVSVΔ51-Fluc細胞の標準曲線を作成など、次のようにベロ細胞上への転写後に、1ml当たりのプラーク形成単位（pfu）の最終濃度になる10 6 pfu / mlで、10 5 pfu / mlで、10 4 pfu / mlで、10 3 pfu / mlで、10 2 pfu / mlで、および10 1 pfu / mlで。 Vero細胞のプレートあたり各濃度の50μlを加えた余分な10％を準備します。 注：ルシフェラーゼウイルスストックの力価は、絶対定量を可能にする標準曲線を生成するために、古典的な方法10で評価する必要があります。さもなければ相対定量は、任意に基づいて、ウイルス力価を設定することにより、正確な力価情報なしで達成することができる希釈工程上。例えば、標準曲線の最初の希釈は、のように、10 7、10 8ウイルス性単位及び以下の10分の1の希釈に設定してもよい。絶対的定量は正確ではないので、この文脈では、一方が予め定められたサンプルと比較した倍数変化として値を表すべきである。 </li></ol>許容細胞へのサンプルの上清の4譲渡<ol><li>単層が少なくとも95％コンフルエントであることを確認する光学顕微鏡下で透明底の96ウェルプレートに播いたベロ細胞を確認する。 </li><li>白壁プレートに播種し、Vero細胞上にサンプル上清25μlを転送します。標準曲線のために指定2列に上清を転送しないでください。注：これは96チャンネルの液体ハンドラーを使用して、単一のプレート上の全てのウェルについて同時に行うことができる。 </li><li> 8または12チャンネルマルチチャンネルピペッターを使用して、中のVero細胞に、ステップ3で作成した標準曲線の各希釈液25μlを追加2指定された列。 </li><li> RTで430×gで5分間遠心プレート。 </li><li>加湿した5％CO 2インキュベーター中、37℃で5時間インキュベートする。 </li></ol>細胞生存の5評価<ol><li>注：透明な96ウェルプレートで行っ感染実験から得られた上清から開始する場合、サンプルの生存率は、レサズリンとして細胞生存率指標色素で定量する前に評価することができる。 </li><li>ウイルスおよび細胞を含有する試料の96ウェルプレートの各ウェル中の体積の10％に等しい量のレザズリン加える。セルは専用それぞれ、100％および0％の生存率の値を決定するために、メディアのみの対照と同様に制御して組み込みます。 </li><li> 2-4時間（細胞の種類および色素の商業的に入手可能であるか、または再構成された粉末の濃度に依存して変化するインキュベーション時間）の後、読み取り、蛍光プレートリーダー（530〜560nm励起、590発光）を用いて信号を記録する。レポートセルviabili×100％式相対代謝活性=（ - - ネガティブコントロール信号）/（細胞のみ信号を制御する負の制御信号）を（試験サンプル信号）による試料のためのティ</li></ol>ルシフェリン基質の6。準備<ol><li> 30分で5時間のインキュベーションの終了前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で2 mg / mlの溶液を得たルシフェリンを準備。プレート当たり2.5ミリリットルを加え、余分な2ミリリットルを準備します。光からソリューションを保護します。 NOTE：ルシフェリンはまた、以前の日に調製し、使用するまで4℃で保存することができる。 </li></ol> 7。読書生物発光<ol><li> 5時間のインキュベーション期間の後、白色固体プレート中のVero細胞の各ウェルに、25μlのルシフェリンを加える。手動で、またはルミノメーターに統合自動化されたディスペンサーでルシフェリンを追加します。注：単一およびエンドポイントを持つ機器の使用は、ルシフェラーゼ互換溶解BUFの添加を必要とすることが読み取るFERの一貫性を改善するためにルシフェリン基質を添加する前に。 </li><li>次のパラメータを使用してプレートをお読みください。 <ol><li> 5秒間振る。 </li><li> 30秒待ちます。 </li><li>適切な固定感度/露出値での発光をお読みください。オプションは、機器上で利用可能である場合には、マルチポイントの精度を向上させるために（ 例えば、3×3の行列）を読み取る使用しています。 </li></ol></li><li>定量化された生物発光強度を記録し、保存します。 </li><li>自動化されたディスペンサーは、ルシフェリンを追加するために使用された場合は、ルシフェリン、プライム暖かい滅菌水でラインをパージする。 </li></ol> 8。データ解析<ol><li>正確な結果を得るために、標準曲線のヒルの方程式を生成するために、非線形回帰を解く。ウイルスの発現ユニットを算出するために力価測定サンプルにこの式を適用します。一部のウイルスや状況は、直線的な関係を持つ標準曲線を生成することができる。この場合の一次方程式を解く。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するルシフェラーゼベースのアプローチは、その使いやすさ、素早さ、最小限の機器の必要性、および比較的低コストなど、他の既存の方法に比べて多くの利点を提供する。これに対する主要な貢献者は、シリアル希釈工程の回避である。それにもかかわらず、このプロトコルの連続希釈系誘導体は確かに実現可能であり、最近では、高スループットの抗ウイルススクリーン11におけるルシフェラーゼ発現エボラウイルス力価を評価した。本質的に時間がかかり、より高価ながら、必要に応じて、このような適応は、ウイルスの定量化のために大きなダイナミックレンジを提供することができる。ハイスループットスクリーニングの文脈においてウイルス力価を評価するために特によく適していることに加えて、私たちのワンステップルシフェラーゼベースのウイルスの定量法は、ウイルスを複製する場合には、感染性ビリオンの正確な推定値を生成する。さらに、同じ実験から、細胞毒性データとともに発光の読み出しは、よりを与える標的細胞に対する実験条件の影響の全体像は、腫瘍溶解性ウイルスおよび薬物スクリーニングの文脈において特に有用である。 ここに示した例では、複製する負の単鎖RNAウイルスを使用しています。しかしながら、このプロトコルは、いくつかのマイナーなプロトコルの調整にウイルスを複製および非複製の数に適合させることができる。これは、ワクシニア、HSV、およびAAV（ 図5参照）のようなDNAウイルスを含む。例えば、そのようなワクシニアウイルスのような細胞内のウイルスに感染したサンプルは、前の定量化へのウイルスの放出工程（ 例えば 、少なくとも1つの凍結-解凍サイクル）を必要とする。他のウイルスにこの手法を適用する場合、それはルミノメーターによりプレートの読み取りにウイルス上清または溶解物から転送インキュベーション時間を最適化する必要がある。このパラメータは、許容細胞系およびpの強度におけるウイルスの複製サイクルに主に依存するromoterルシフェラーゼ発現を駆動する。これは、最良の最適化ステップで完全な標準曲線を使用して行われる。これを行うためには、準備された標準曲線のさまざまな複製物との適切な許容細胞系に感染し、それぞれが異なる時点転写後に複製する読まなければなりません。理想的には、インキュベーション時点は期待サンプル力価範囲にわたるLOG（RLU）とLOG（力価）との間の線形関係をもたらすが選択される。 VSVΔ51-Fluc細胞の場合、これは典型的には10 4 PFU / mlの10 7 PFU / mlの5時間のインキュベーション時間。より低い又はより高い力価は試料から予想される場合、人は単に、それぞれ、インキュベーション時間を増大または減少させることができる。あるいは、サンプルは、ELISAのために典型的に行われる限り範囲内に入るように希釈することができる。 上述したように、この方法は、ステップのほとんどは自動化することができるように、薬物ライブラリーを用いてハイスループット薬物スクリーニングを行うのに適している。細胞は、電子をメッキすることができるfficiently自動マイクロディスペンサーを用いて、薬剤ライブラリは、96チャンネルの液体ハンドラーを使用して追加することができ、ウイルスは、マイクロプレートディスペンサーを使用して追加することができ、プレートを自動化された照度計を用いて読み取る。理論的には、これはまた、384ウェルまたは小さなフォーマットに適合させることができる。しかし、このための制限は、メッキすることができるセルの数、与えられた少数の細胞が（力価）の関係を記録するためにLOG（RLU）の直線で狭い範囲につながるです。最後に、レサズリンまたは他の代謝色素を用いて細胞生存率の評価は容易に抗ウイルススクリーンまたはウイルス12との組み合わせで相乗的殺傷をもたらす化合物の同定における細胞毒性化合物の識別を可能にする、ワークフローに組み込むことができる。それにもかかわらず、この方法の限界は常に可能なわけではないルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するウイルスの要件、および十分に寛容な細胞株の利用可能性を含む。しかし、適応することが可能性が高い他のレポーター遺伝子と共に使用するための方法（ 例えば 、GFP）をレポーターの定量方法は、信号対雑音比に適した線形性及び信号を有することを条件とする。全体的に、説明した高スループット方法は、多くの異なるウイルスに合わせて変更し、多様な用途に合わせて調整することができる。

古典的なウイルスプラークアッセイは、悪名高い時間がかかり、実験結果を得るための重大なボトルネックを構成する可能性があるにもかかわらず、ウイルス研究の主力であり続けています。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、ELISA、フローサイトメトリー1-4など、より迅速な間接的なウイルス定量法が登場しています。Virocytウイルスカウンターなどの最近のイノベーションは、高度なフローソーティング技術を使用し、タンパク質とDNA/RNA色素の組み合わせにより、ウイルスを直接カウントすることができます5。これらの方法がウイルス研究のペースを速めたことは間違いありませんが、それぞれの方法には長所と短所があります。例えば、qPCRは特定のウイルスゲノム配列の定量を可能にしますが、感染性と欠陥のあるウイルスを効果的に区別することはできません6。ELISAは非常に特異的ですが、目的の標的ウイルスタンパク質に対する適切な抗体が必要であり、非常に高価になる可能性があります。フローサイトメトリー技術には多くの利点があり、大幅に改善されていますが、それでも、高度に専門化された機器へのスループットとアクセス性は依然としてハードルです。重要なことは、これらの手法はすべて、ウイルス定量ステップの容易さと時間の要件が非常に重要であるハイスループットスクリーニングには理想的ではないということです。
ここでは、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)導入遺伝子を発現する力価ウイルスに対するハイスループットで容易に自動化可能な技術について説明します。この方法では、既知のウイルス量の標準曲線を並行して使用して読み取られた発光シグナルに基づいて、試験サンプルにおおよそのウイルス力価が生成されます。未量のルシフェラーゼ発現ウイルスを含むサンプルを、標準的なウイルス希釈曲線と並行して許容性の「プラーク」細胞株に移し、数時間のインキュベーション時間後にウイルス関連発光を読み取ります。これにより、目に見えるプラーク7-9を手動でカウントするために通常数日間のインキュベーションを必要とする従来のプラークアッセイプロトコルとは異なり、迅速で定量的な、多くの場合同日の結果の生成が可能になります。
このプロトコルは、Fluc導入遺伝子(VSV∆51-Fluc)をコードする腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルスを例に使用した滴定方法のステップを概説し、1の概要を提供します。サンプル調製 2.自動ディスペンサーを使用したウイルス滴定用の許容細胞株のプレーティング3。ウイルス標準曲線の調製 4.サンプル上清を96ウェル手動ピペッター5を使用して許容細胞株に移します。細胞生存試薬を用いたサンプルの細胞毒性の評価 6.ルシフェリン基質の調製 7.生物発光の読みと8.データ分析。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコス改良型イーグルスミディアム(DMEM)</td><td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>1 mM溶液、pH 7.3</td></tr><tr><td>alamarBlue&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin、カリウム塩</td>、<td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr>、<tr><td>96ウェル、固体、白色、平底、ポリスチレン、TC処理マイクロプレート</td><td>、Corning</td><td>3917</td>、<td>384ウェルプレートは、より高いスループットにも使用できます</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>モノクロメーター マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>メトラー・トレド</td><td>LIQ-96-200</td><td>96チップ手動ピペッティングシステム</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS フィルターで滅菌されたチップ</td><td>メトラー・トレド</td><td>LQR-200F</td><td>任意の滅菌フィルター付きチップが適切です</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>96ウェルプレートの細胞をプレート化するために使用されます</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td><td>マイクロプレート蛍光光度計</td></tr></tbody></table>

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

感染性ウイルス力価を決定するための標準的なプラークアッセイは、時間がかかり、大量のサンプルには適さず、プラークを形成しないウイルスでは行うことができません。 プラークアッセイの代替法として、1日で大量のサンプルを同時に滴定できるハイスループット滴定法を開発しました。 このアプローチには、Fireflyルシフェラーゼタグ付きウイルスによるサンプルの感染、感染したサンプルの適切な許容細胞株への移漬、その後のルシフェリンの添加、発光測定値を得るためのプレートの読み取り、そして最後に発光からウイルス力価への変換が含まれます。 代謝生存率色素を使用した細胞毒性の評価は、並行してワークフローに簡単に組み込むことができ、薬物スクリーニングのコンテキストで貴重な情報を提供できます。 この手法は、標準的なプラークアッセイの代替として、ウイルス力価を測定するための信頼性の高いハイスループットな方法を提供します。

ハイスループット方法を説明するワークフローの概要を図1に示されている。 図2は、典型的な標準曲線ofVSVΔ51-Fluc細胞の結果を示す。 4パラメータの非線形回帰分析は、未知の入力pfuの（ウイルス力価の推定値）を補間することが可能なヒルプロットを生成した。これらの推定された力価は、ウイルス発現ユニット（VEU）と呼ばれる。 図3Aは VEUsおよび同一サンプル10を標準的なプラークアッセイを行うことによって得られた力価を示す。サンプルは、さまざまな化学物質が786-0細胞でVSVΔ51-Flucをの複製および拡散を強化するために使用された実験に由来する。標準曲線から補間VEUsは、Vero細胞（この場合には、希釈係数が5である）に転写されたサンプルの上清の希釈に基づく係数を乗算しなければならない。力価とVEUの間の線形相関関係を図3Bに示されている</strong&gt; 0.8083のR 2及び0.899のピアソンのrのスコア（P &lt;0.0001）で。 図4では、代謝アッセイから得られた典型的な細胞傷害性データは、前VSVΔ51-Flucを持つ感染に対する化学物質で処理786-0細胞について示されている。最後に、 図5は、各種のウイルス（単純ヘルペスウイルス（HSV）、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）、すべてを発現するホタルルシフェラーゼ）で得られた典型的な標準曲線を示し、必要に応じて、インキュベーション時間および凍結融解のサイクルを記述する。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> VSVΔ51-Flucをを使用したハイスループットのウイルス力価測定および細胞毒性アッセイの図1のワークフロー。 （A）は、ウェル当たり2.5×10 4 Vero細胞（100μl）をシードし、37℃でインキュベートする。（B）24時間後に転送Vero細胞（プレートあたり2列）に標準曲線を25μl。（C）転送残りVero細胞上に力価を測定するサンプルの25μlの。遠心プレートし、37℃でインキュベートする。（D）ウェル内の体積の10％に相当する量では、元のサンプルを含むプレートにレサズリン試薬を追加します。 3時間後、37℃。（E）で培養する、読み、記録蛍光および細胞毒性を評価。（F）5時間後、Vero細胞の各ウェルにルシフェリンの2 mg / mlの溶液25μlを加える。発光を読み、ウイルス発現単位を計算します。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> 図2は、VSVΔ51-Flucを標準曲線を期待。ルシフェラーゼ発現は、私だったasuredルミノメーターおよび生物発光を使用してウェル内の五つの異なる点での5時間後に上清転送は、平均相対光単位（RLU）で表した。 RLUは、既知の入力のpfu / mlの非線形回帰を解決し、Hill式を生成するためのに対してプロットした意味する。 2反復曲線と標準エラーバーの平均（R 2 = 0.9993）が示されている。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> ハイスループット法で得られたものと標準的なプラークアッセイ力価の図3の比較。 （A）VEU / mlの間のpfu / mlの高スループットのルシフェラーゼアッセイを用いて力価測定し、同じサンプルから計算されたウイルス力価（VEU / ml）を比較したVero細胞に、標準的なプラークアッセイによって得られる。（B）の線形関係におけるウイルス力価力価は、標準のpを介して得られるラッカーのアッセイ。線形回帰曲線と判断（R 2）の係数が示されている。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Vero細胞上の前上清転送に図4のサンプルの生存率。サンプルの生存率は、市販のレサズリン溶液を用いて細胞の代謝活性を評価することにより決定した。生の蛍光値は、未処理の、非感染ウェルのそれに対して標準化した。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> 図5は、HSV、ワク、およびAAVウイルスの標準曲線を期待。ルシフェラーゼ発現がうまくルミノメーターを用いて内5異なる点で測定し、生物発光は、平均のRelAにおいて発現させた電性光単位（RLU）。（A）HSV標準曲線は、Vero細胞上に添加した17時間後のsupernantant転送（R 2で作成しましたウェル（100μL）およびルシフェラーゼ測定当たり2.5×10 4細胞の密度で24時間以前のメッキ= 0.9489、n = 1である）。ヒルの方程式は、非線形回帰を解くことによって生成された。Vero細胞を24時間早くウェル当たり2.5×10 4細胞（100μlの）の密度をプレーティングし、37℃で2.5時間インキュベート上に（B）ワクシニア標準曲線を添加したルシフェラーゼ測定が行われた後にC（R 2 = 0.9892）。線形方程式は、線形回帰を解くことによって生成された。（C）AAV標準曲線は、ヒト肺癌細胞（A549）に添加したウェル（100μl）を、ルシフェラーゼ測定当たり2.5×10 4細胞の密度で24時間以前のメッキ24時間後に感染しました。ヒルの式は、非線形回帰を解くことによって生成した。平均5複製曲線と標準エラーバーの（R 2 = 0.9926）を示している。

この記事では、自動および手動のリキッドハンドラーを使用して、さまざまなRNAおよびDNAウイルスを滴定するハイスループットのルシフェラーゼ発現ベースの方法を紹介します。

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

本実験の全体的な目的は、ハイスループット定量法を用いて、ルシフェラーゼ標識ウイルスのウイルス力価を推定することです。これは、力価を測定するサンプルの上清およびウイルス標準曲線を、ルシフェラーゼの発現を可能にする感受性細胞株に接種することによって達成されます。第2のステップとして、元のサンプルにレサズリンを添加し、細胞生存率を評価することができます。次に、適切なインキュベーション時間を経た後、バイオルミネッセンスを定量するためにルシフェリンを細胞に添加します。この結果から、ルシフェラーゼの発現に基づいたサンプル中のウイルス量を算出します。プラーク法のようないわゆる既存の手法と比較した本手法の主な利点は、多数のサンプルを迅速かつ同時に処理できる点にあります。また、本手法はプラーク形成に依存しないため、プラークを形成しないルシフェラーゼ発現ウイルスにも適用可能です。さらに、細胞毒性の読み取りをワークフローに容易に組み込むことができ、薬剤スクリーニングにおいて有用であると考えられます。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるVanessa、Ramya、Colinの3名が行います。まず、Firefly Luciferaseを発現するVSV-Delta 51を用いて、96ウェル組織培養プレートで感染させます。適切なインキュベーション後、これらのプレートの上清を回収し、タイターを測定します。タイター測定の24時間前に、10% FBS、30 mM HEPES、および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEMを用いて、Vero細胞を2.5 × 10⁵ cells/mLの濃度で懸濁液として調製します。マイクロプレートディスペンサーを使用して、96ウェル白色不透明平底プレートに2.5 × 10⁴ cellsを播種します。細胞懸濁液を調製する前に、チューブを50 mLの滅菌水でフラッシングし、マイクロプレートディスペンサーのカセットを洗浄してください。次に、マイクロプレートディスペンサーのラインに細胞懸濁液を満たし、5 mLの細胞懸濁液を流します。白壁の96ウェルプレートの各ウェルに100 µLずつ分注するプログラムを選択します。分注を行い、必要に応じて他のプレートに対しても同様の操作を繰り返します。また、細胞の生存率と密度の確認のため、透明な白底96ウェルプレートの数ウェルにも細胞を播種します。完了後、細胞を元の容器に回収します。チューブ内に70% ethanolを50 milliliters、続いて温めた滅菌水を50 milliliters流し、カセットを洗浄します。その後、細胞を5%carbon dioxide加湿インキュベーターにて37 degrees Celsiusで24時間培養します。Vero細胞に転移させた後の1mLあたりのプラーク形成単位（PFU）の最終濃度が以下となるように、無血清DMEMを用いてVSV-Delta-51の標準曲線を作成します。Vero細胞のプレート1枚につき、各濃度の試料を50 µL、さらに予備として10%分を追加して調製します。標準曲線は96深井プレートに移して管理できます。次に、透明底96ウェルプレートに播種したVero細胞を光学顕微鏡で観察し、単層のコンフルエンスが少なくとも95%に達していることを確認します。12チャネルマルチチャンネルピペットを用いて、標準曲線の各希釈液25 µLを、白壁プレートに播種したVero細胞の指定された2列に転移します。プレートを室温で430 gで5分間遠心分離します。その後、加湿5% CO2インキュベーター内で37 °Cで5時間インキュベートします。この時点で、ウイルスと細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに、ウェル内容量の10%に相当する量のresazurinを添加します。2〜4時間後、蛍光プレートリーダーを用い、励起波長530〜560 nm、蛍光波長590 nmでシグナルを測定し、記録してください。以下の計算式に従って、サンプルの細胞生存率を算出します。5時間のインキュベーション終了の30分前に、ルシフェリンを準備し、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水を用いて2 mg/mLの溶液を作成します。この溶液は遮光して保存してください。5時間のインキュベーション期間後、ルミノメーターに組み込まれた自動ディスペンサーを用いて、白色ソリッドプレートのVero細胞の各ウェルにルシフェリンを25 µL添加します。以下のパラメータでプレートを測定します。5秒間振盪し、30秒間待機します。適切な固定感度または露光値でルミネッセンスを測定し、定量された生物発光強度を記録して保存します。ルシフェリンの添加に自動ディスペンサーを使用した場合は、ルシフェリンをパージし、滅菌水でラインをプライミングしてください。正確な結果を得るために、非線形回帰を行い、標準曲線からヒル式を算出します。この式をタイター測定したサンプルに適用し、ウイルス発現ユニットを算出します。ここでは、VSV-Delta 51の典型的な標準曲線の結果を示しています。4パラメータ非線形回帰分析によりヒルプロットを作成し、そこから未知の入力プラーク形成単位を補間することができます。Vero細胞を用いた標準的なプラークアッセイで得られたウイルス力価を、高スループットルシフェラーゼアッセイを用いて測定した同一サンプルの算出ウイルス力価と比較しました。これらのサンプルは、786-0細胞におけるVSV-Delta-51の複製および拡散を増強するために様々な化学物質を用いた実験から得られたものです。力価とウイルス発現ユニットの間の線形相関（R² = 0.8083、ピアソン相関係数 R = 0.899）をここに示します。また、VSV-Delta-51感染前に化学物質で処理した786-0細胞について、代謝アッセイから得られた典型的な細胞毒性データをここに示します。さらに、すべてホタルルシフェラーゼを発現している単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの典型的な標準曲線をここに表示します。この手法を習得すれば、目的のウイルスを用いて化合物のライブラリを高スループットスクリーニングし、力価および細胞毒性データを算出することができます。本手順を実施する際は、ウイルスの発現単位を補間するために不可欠な標準曲線を適切に希釈することを忘れないでください。生ウイルスを取り扱うことは極めて危険であるため、本手順の実施中は、生物学的安全キャビネット内での作業や適切な個人用保護具の着用など、常に十分な予防策を講じてください。このビデオを視聴することで、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現に基づくハイスループット定量法を用い、標準曲線から未知のウイルス発現単位を補間してバイオルミネッセンスを測定し、ウイルス力価を推定する方法について十分に理解できるはずです。また、適切な生存率アッセイにより、サンプルの細胞毒性を同時に決定することも可能です。

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

レンチウイルスを作成するには、DNAベクターは、ヒト293細胞にトランスフェクトされています。収穫後、上清を濃縮し、ウイルス力価は、フローサイトメーターと蛍光式によって決定されます。...

レンチウイルスの生産

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

このビデオは、ルシフェラーゼタグ付きタンパク質の定量に使用されるルシフェラーゼアッセイを示しています。このアッセイでは、目的のタンパク質と結合した小さなフラグメントと結合する大きなフラグメントで構成される人工的なルシフェラーゼ酵素を使用します。結合したサブユニットは活性酵素を形成し、基質の存在下で発光シグナルを放出します。次に、この信号をルミノメーターを使用して定量化します。...

ルシフェラーゼアッセイ:人工ナノルシフェラーゼシステムベースのバイオレポーターを使用して発光シグナルを測定するハイスループットアッセイ

このビデオは、組換えHBVレポーターシステムを介してB型肝炎ウイルス(HBV)感染を検出するin...

ウイルス感染検出のためのin vitro組換えウイルスレポーターシステム

このビデオでは、組換えルシフェラーゼと蛍光タンパク質発現バイレポーターのインフルエンザAウイルスを使用して、マウスモデルでウイルス感染を追跡する方法を示します。この方法により、in vivo と ex vivo...

ウイルス感染を追跡するためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

このビデオは、ポックスウイルス感染細胞の翻訳制御を研究するためのアッセイを示しています。非感染細胞とウイルス感染細胞に、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)およびレニラルシフェラーゼ(Rluc)をコードするmRNAを同時トランスフェクトし、Fluc mRNAには5'ポリ(A)リーダー配列が含まれていました。溶解した細胞に生物発光基質を添加した後、両方のルシフェラーゼからのシグナルを測定して、リーダー配列によって付与されるウイルス感染細胞におけるFluc...

ポックスウイルス感染細胞における翻訳制御を研究するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。...

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

ここでは、高病原性ウイルス中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群コロナのスパイク ・ プロテインを組み込む BSL 2 設定で新規のパーティクルを生成するプロトコルを提案する.これら新規粒子には、ターゲット ホストの細胞にウイルスのエントリの定量化を許可するルシフェラーゼ...

バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 '-非翻訳領域 (UTR) および 3 '-UTR を含む、mRNA...

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

インフルエンザA型ウイルス(IAV)は、毎年の流行や時折のパンデミックを引き起こす伝染性呼吸器病原体です。ここでは、新規組換えルシフェラーゼおよび蛍光発現バイレポーターIAV(BIRFLU)を用いて生体内のウイルス感染を追跡するプロトコルについて説明する。このアプローチは、研究者に生体内でIAVを研究するための優れたツールを提供します。...

ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。...

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

学ぶ ルシフェラーゼ発現ウイルスの高スループット滴定法。Vero細胞を用いて発光強度からウイルス価を迅速に定量し、細胞生存能も同時評価できます。従来のプラーク法に代わる効率的なウイルス学手法です。

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

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