HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

次のビデオの全体的な目的は、哺乳類の発現システムを使用してタンパク質またはタンパク質複合体を良好な収量で生成するためのシンプルで手頃な価格の手法を実証することです。これは、HEC 2 93 F細胞を、5%の二酸化炭素に維持された雰囲気の加湿振盪器で懸濁液中で培養することによって達成されます。第2のステップとして、細胞に1つ以上の高コピー数発現プラスミドを一過性にトランスフェクトします。

トランスフェクション剤ポリエチレンEINまたはPEIを使用して、細胞を48時間増殖させてから回収しました。次に、アフィニティー樹脂を用いてタンパク質を精製し、続いて目的のタンパク質複合体を精製するためのゲルろ過を行い、構造的および機能的な研究を行います。最終的に、この手頃な価格でシンプルな哺乳類発現システムにより、細菌細胞では発現が困難なタンパク質やタンパク質複合体の発現と精製が可能になります。

このアプローチの主な利点は、タンパク質複合体の発現に対するその利便性と汎用性です。これは、特にタンパク質発現ベクターを混合して一致させることができるため、細菌でタンパク質を作るのとほぼ同じくらい簡単です。この方法は、最初はタンパク質圧縮の発現をテストするために小規模で使用できますが、構造的および機能的な研究のために、成功の鍵は、細菌や酵母感染のない健康な状態に細胞を維持することです。

培地中の抗生物質はタンパク質の収量を大幅に減少させます。まず、1ミリリットルあたり2,000万個の細胞密度のHEC 2 9 3 F細胞を1ミリリットルの液体窒素から取り出し、摂氏37度の水浴ですばやく解凍します。数回ピペッティングして塊を砕き、内容物全体を34ミリリットルのプレウォーム培地を含む250ミリリットルの円錐形細胞培養フラスコにピペットで移します。

48時間後に、37°C、120 RPM、5%二酸化炭素の加湿眼振とうインキュベーターに培養物を置きます。トライアンブルーで細胞生存率を確認します。この段階での正常な細胞生存率は、細胞が1ミリリットルあたり約100万個の細胞数に達すると約70%になります。

それらを1ミリリットルあたり35万個の細胞の最終数までマッサージし、60ミリリットルの予温培地を含む250ミリリットルの円錐形細胞培養フラスコに入れ、48時間ごとに、または1ミリリットルあたり約200万個の細胞のアカウントに達したときに細胞をマッサージし続けます。ここに示されているのは、トランスフェクションのために播種する準備ができているストックから、1ミリリットルあたり230万個の細胞でTrian blue stain HEC 2 9 3 F細胞のサンプルであり、細胞は単一細胞または分裂細胞としてのみ存在するべきです。細胞が生い茂りすぎると、この写真に示すように、細胞は大きな塊を形成し、生存率が非常に低くなります。

細胞がクラスターを形成している場合、これらは25秒間の激しい渦によって分裂する可能性があります。大規模な培養を開始するには、各1リットルのローラーボトルで300ミリリットルの最終容量に1ミリリットルあたり50万個の細胞を播種します。加湿オービタルシェーカーで、摂氏37度、135 RPM、二酸化炭素5%の加湿オービタルシェーカーで、細胞が1ミリリットルあたり100万個の細胞密度に達するまで24時間インキュベートします。

次に、フィルター滅菌したDNAの合計300マイクログラムを30ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSにピペットで移し、3秒間激しくボルテックスします。次に、1.2ミリリットルあたり0.5ミリグラムを追加します。滅菌したPEIをPB SDNA溶液にろ過し、さらに3秒間激しくボルテックスします。

混合物を室温で20分間インキュベートしてから、ベビーベッドに続く細胞に混合物を添加します。トランスフェクションは、加湿された眼窩振盪器内で細胞を加湿したインキュベーターで、摂氏37度、135 RPM、および48時間後に5%二酸化炭素でさらに48時間インキュベートします。細胞をGの3000倍で5分間遠心分離することにより、細胞内タンパク質を回収します。

セルペレットがすぐに使用できない場合は、マイナス80°Cで保存できます。このプロトコールは、タンパク質の1つがフラグタグを持つ核からのタンパク質複合体の精製に最適化されています。精製resusを開始するには、細胞パレットを約40ミリリットルの予冷溶解液に懸濁し、培養物1リットルあたりの緩衝液、数回のピペッティングアップとピペッティングの組み合わせ、およびガラスホモジナイザーで15秒の3サイクルの超音波処理を行います15秒オフ。

次に、108, 000倍のGを摂氏4度で25分間遠心分離し、仰臥位の被覆を保持します。次に、樹脂平衡緩衝液で3回洗浄することにより、培養物1リットル当たり1.2ミリリットルのアンチフラッグ充填アロス樹脂をインキュベートし、1つ以上の50ミリリットル遠心チューブ内の全細胞抽出物をアフィニティー樹脂で表し、摂氏4度で30〜120分間静かに回転させ、その後、摂氏4度で3000倍Gで1分間遠心分離する。すくみを捨てた後、樹脂を15ミリリットルの遠心分離管に移し、合計45ミリリットルの予め冷やした緩衝液で洗浄し、1つは遠心分離機の前に廃棄し、その後、高塩緩衝液を使用して洗浄と遠心分離を繰り返す後、低塩緩衝液とTEV切断緩衝液を使用します。

各洗浄がレジンを完全に再懸濁するのに十分であることを確認してくださいが、それ以上ではないことを確認してください。次に、10 μリットルの樹脂サンプルを採取し、結合したタンパク質サンプルを表すために、2 倍のタンパク質ローディングバッファーの 1 容量に希釈して分析します。還元剤は樹脂から抗体を放出するため、使用しないでください。

次いで、樹脂を1リットル当たり約40μgのTEVプロテアーゼで予め冷却したTEV切断緩衝液10ミリリットルに再懸濁し、チューブを数回反転させて混合する。TEVプロテアーゼのレベルは、発現タンパク質の量に応じて最適化できます。タンパク質の酸化を防ぐためにチューブの雰囲気を100%窒素ガスに交換してから、翌日4°Cで一晩中穏やかに回転させます。

サンプルをGの3000倍で10分間遠心分離し、その後、サピネートを適切な分子量カットオフの超遠心フィルターに移し、500マイクロリットルまで濃縮します。濃縮タンパク質の10マイクロリットルのサンプルを採取し、分析のためにタンパク質ローディングバッファーの2倍の1容量に希釈します。このサンプルは TEV 溶出液サンプルを表しています。

次に、樹脂の10マイクロリットルのサンプルを採取し、タンパク質ローディングバッファーの2倍の1容量に希釈します。このサンプルは、ポストTEV樹脂サンプルを表しています。次のステップは、タンパク質をサイズ排除カラムに通すことであり、目的の複合体のサイズに応じて適切なゲルろ過マトリックスを使用する必要があります。

この場合、10 x 300 mm S 200 サイズ排除クロマトグラフィーカラム A を使用し、サイズ排除クロマトグラフィーカラムとゲルろ過バッファーを同等にしました。0.22ミクロンのフィルターでタンパク質をろ過し、サンプルをカラムにロードします。カラムから外れたフラクションの収集に進みます。

最終工程として、収集したサンプルに対してSDSポリアクリルアミドゲルのエレクトロフェレーシスまたはSDSページを行い、ゲルろ過画分と同様に、ヒストンDS SLA oneまたはHD oneのサプレッサーの不良サイレンシング3またはSDS3およびsyn 3、HDAC相互作用ドメインまたはsyn three、HIDが安定なターニー複合体を形成する。ターニー複合体の親和性精製は、SDSページを通じて観察できます。ここに示されているのは、コットによって生成され、2リットルの細胞を横切る精製された複合体です。

結合したタンパク質レーンは、アフィニティー樹脂に結合した複合体を示す。TEV消化後、sin 3 A HIDに存在するタグが切断され、複合体が言及されます。ここに示す樹脂は、10 x 300 mm S 200 サイズの排除クロマトグラフィーカラムを使用して精製されたタンパク質複合体のクロマトグラムです。

純粋な錯体は、溶液中で二量体を形成するため、ボイドボリュームの近くで回避されることに注意してください。最後に、SDSページ分析により、ゲルろ過画分中の精製タンパク質が明らかになります。このビデオを見れば、懸濁液で成長したHEC 2および3アプリ細胞の増殖、維持、およびコトランの方法、およびタンパク質の親和性、精製、濃縮の方法について十分に理解できるはずです。

複雑な健康な細胞は実験の成功に不可欠であるため、それらが成長し、その条件で維持され、定期的に継代することを確認してください。組織培養に先延ばしにしないでください。構造生物学者は、哺乳類細胞から大量のタンパク質やタンパク質複合体を発現させ、精製するのは簡単です。