Name: HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶHEK 293F懸濁細胞を用いた構造生物学向け組換えタンパク質発現法。PEIによる一過性トランスフェクションとアフィニティ精製により、細菌系で発現困難なタンパク質複合体を効率的に産生・精製するスケーラブルな手法です。

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私たちは、この仕事とレスターコアテクノロジー·サービス大学のために使用される発現構築物を調製するための博士孝文ヤン（PROTEXクローニングサービス）を感謝したいと思います。この作品は、BBSRCの学生の身分によってサポートされていました、ウェルカムトラストプログラムとシニア調査官補助金WT085408＆WT100237とBBSRCはRM31G0224を付与します。

注：プロトコルは、そのための試薬のボリュームと量が比例的にスケールされるべきである、式の任意のスケールに適しています。適切な哺乳動物発現ベクターは、このプロトコルを使用しなければならない。ここでは、便利なクローニング（ 図1）で使用される制限酵素の選択に応じて親和性タグの包含または除外することができ変更されたpcDNA 3.1発現ベクターを使用していました。以下のプロトコルは、大規模なトランスフェクションについて説明します。 1Lのローラーボトル中で1大規模文化/トランスフェクション標準的なプロトコルに従ってHEK293F懸濁適応細胞を成長させ、維持する。典型的には30〜100 mLのスターター培養物を250 mlコニカル細胞培養フラスコ中で増殖させる。 <ol><li>各1リットルのローラーボトル300 mlの最終体積中に0.5×10 6細胞/ mlの種子細胞。 注：ローラーボトルは、最大に150ミリリットルの最小値を受け入れる懸濁培養を300ml。より大規模なトランスフェクションのために複数のボトルを使用しています。 </li><li>細胞は1.0×10 6細胞/ mlの密度に達するまで、37℃でオービタルシェーカーインキュベーター内で24時間、120rpmで、5％CO 2でインキュベート（細胞が約24時間ごとに分割します）。 </li><li>ろ過滅菌したDNAの300μgの合計ピペット3秒間激しくPBS 30mlおよび渦に（補助メソッドを参照してください）​​。 注：百トランスフェクションされた細胞あたり1μgのDNAの合計を使用してください。二つ以上のプラスミドをする同時トランスフェクトされた場合細胞に対するDNAの比が一定となるようにそれぞれの量を減らす。 </li><li> 3秒間、PBS / DNA溶液激しく渦に0.5 mg / mlのフィルター滅菌PEIの1.2ミリリットルを追加します。 </li><li> 20分間RTでミックスをインキュベートする。 </li><li> 1×10 6細胞/ ml（ステップ1.3）の密度であるべきである- DNA / PEIを細胞に混ぜ入れる。 </li><li>同時トランスフェクションの後、細胞をインキュベートさらに37℃で48時間、120 rpmで、5％CO 2、オービタルシェーカーインキュベーター中。 </li><li> 5分間3000×gで細胞を遠心分離することによって細胞内タンパク質を収穫し、-80℃でペレットを格納します。 注：上記の培養雰囲気がCO 2 5％で置き換え、そしてボトルの蓋が密閉されている場合あるいは、振盪インキュベーター標準（非CO 2）を使用。雰囲気は各継代（通常は2日ごと）に交換する必要があります。 </li></ol>全細胞抽出物から2タンパク質複合体精製このプロトコルは、フラグ標識タンパク質を用いた核複合体の精製のために最適化されています。 <ol><li>あらかじめ冷却溶解緩衝液（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール、0.3％トリトンX-100、プロテアーゼ阻害剤）の培養物1Lあたりの約40中への細胞ペレットを解凍。 </li><li>再懸濁（ボルテックス、発泡を避けるためにしないでください）​​上下にピペッティング数倍ペレットを。 </lI&gt; <li>完全にガラスホモジナイザーを用いて細胞を再懸濁。 3サイクル（15秒、15秒オフ）のために超音波処理。 4℃で25分間30,000×gで遠心分離し、上清を保持している。 </li><li>樹脂の平衡化緩衝液（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5）で3回洗浄することによって培養物のリットル当たり抗フラグパックアガロース樹脂1.25mlの平衡。 </li><li>一つ以上の50ml遠心チューブ中の親和性樹脂と歩調2.3からの全細胞抽出物をインキュベートし、穏やかに、4℃で30〜120分間、サンプルを回転させる。 </li><li> 4℃、廃棄上澄みで1分間3000×gで遠心分離します。 </li><li>予め冷却した緩衝液45mlを1（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール、0.3％トリトンX-100）で樹脂を洗浄する。 1分間3000×gで遠心分離し、上澄みを捨てる。 </li><li>高塩緩衝液を用いて手順を繰り返し2.7低塩緩衝液（50mMの酢酸カリウム、50 mMトリスpHを7に続く（300 mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール）0.5、5％グリセロール）及びTEV切断緩衝液（50mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5の、0.5 mMのTCEP）。 注：各洗浄は、すなわち完全にもはや樹脂を再懸濁し、するのに十分短いことを確認します。 </li><li>樹脂の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファー（結合したタンパク質制御）の1体積中に希釈する。樹脂から抗体を解放する避けるために還元剤を使用しないでください。 </li><li> 15mlの遠心管にあらかじめ冷却TEV切断バッファーと転送8-10中へ樹脂を再懸濁する。 </li><li>追加〜40元の培養1L当たり（1 mg / mlの時ストックから）TEVプロテアーゼμgの上下に数回ピペッティングしてよく混ぜます。 </li><li>タンパク質の酸化を防止するために、100％のN 2ガ ​​スでチューブ雰囲気を交換してください。 </li><li>静かに、4℃でO / N回転させます。 </li><li> 10分間の3000×gで遠心分離します。適切な分子量カットオフの超遠心フィルターに上清を移し、集中500μlのまで。 </li><li>濃縮されたタンパク質の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファーの1の体積に希釈する。 （TEVは、コントロールを溶出）。 </li><li>樹脂の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファー1体積中に希釈する。樹脂から大量の抗体を解放しないようにするために、還元剤は使用しないでください。 （ポスト-TEV樹脂制御）。 </li><li>ゲルろ過バッファー（50mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5の、0.5 mMのTCEP）でのサイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化する。 </li><li> 0.22μmのフィルターに通してタンパク質をフィルター</li><li>カラムに試料をロードし、画分を収集します。 </li><li>ステップ2.9、2.15と2.16と分析のためのSDS-PAGEおよびクーマシー染色の手順2.19からゲル濾過分画から実行サンプル。 注：それは、標的タンパク質の発現を確認するためのステップ2.9、2.15および2.16以前のゲル濾過からのサンプルのSDS-PAGEを実行することをお勧めします。</li>
</ol>

<ol><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
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<li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977(2008).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

私たちは、哺乳動物細胞から組換えタンパク質及び多サブユニット複合体を大量に発現させ、精製するために（PEIは、市販の親油性のトランスフェクション試薬よりもはるかに少ない費用）簡単かつコスト効果的な方法を開発した。プロトコルセクションに記載したように、高純度のプラスミドDNA（1.8と2.0との間の280分の260）はPEIと組み合わせて使用​​される場合、最適なトランスフェクションおよび発現効率に達することができる。細胞を血清および抗生物質を含まない培地で培養されなければならないので、滅菌技術は厳密にコストと時間がかかる感染症を避けるために継代し、細胞をトランスフェクトするために必要とされる。細胞の生存率が90％以上でなければならず、文化が2.5×10 6個の細胞よりも大きな密度まで成長させることはありません/すぐにトランスフェクションの前に、そうするように、タンパク質収量が減少しますミリリットル。成功したトランスフェクションのために、培養物を単一または分裂細胞にのみ含まれている必要があります。クラスタは活力によって分割することができるOUはボルテックス20〜30秒（ 図5）。同時トランスフェクションに用いた各プラスミドの比率が研究され、複合体の化学量論に従って、ユーザによって変更することができる。適切な発現時間を確立することができるように、発現効率は、目的のタンパク質に対して最適化することができる。精製は、望ましくないタンパク質分解の危険性を減らすために常時冷たいタンパク質試料を保持行われるべきである。彼らはしばしば減少溶解性および/または酵素活性の損失をもたらす、構造要素または特定のタンパク質の活性部位を妨害することがあるので、タグ及び精製緩衝液の選択は、重要である。小規模トランスフェクションは、大きなタンパク質複合体の精製のための異なる構築物を試験するために特に有用である。 今日では、代わりの方法論の多種多様な組換え真核生物のタンパク質（ 表2）の発現のために利用可能である。たとえば、Baculovi昆虫細胞におけるコーラス発現は広く、その高い形質導入効率および他のウイルス種6と比較して細胞毒性の欠如に使用される。しかし、ウイルスを作製するプロセスは、時間がかかり、その不安定性は、ウイルスが長期間保存することはできません。一方、酵母発現系は、高いタンパク質収率7で得られた、増殖する細胞の発酵槽培養物における非常に高い密度の可能性を提供する。しかし、彼らはまだ、真核生物のタンパク質が正しく折り畳まおよびそれらのタンパク質パートナーと相互作用することに必要な翻訳後修飾の完全な多様性を欠いている。 HDAC3は、例えば、発現されるが、Eにフォールドしない大腸菌 。 293F細胞内で発現した場合しかし、私たちはそのプレッサー（SMRT）および原核細胞には見られない、イノシトール四リン（IP4）8の分子との複合体中の活性酵素を精製することができました。また、このメソッドは、STを精製し、結晶を解決するために私達を許可している同様IP4 9によって活性化されるNuRD複合体でMTA1との相互作用HDAC1のructure。理想的には、私たちは常にその自然、生理的環境における真核生物のタンパク質を表したいと思います。バイオリアクター10-12にHEK 293-EBNA1細胞を用いた哺乳動物発現系が記載およびタンパク質の非常に高いレベルをもたらすが、これらは使用するのが複雑であることができるされている。 本手法は、細菌、酵母およびバイオリアクター系における発現への簡単アクセス可能な代替手段です。表現方法は、高速であり、ローラーボトルまたはフラスコの雰囲気は、5％CO 2で置換されている、標準的な振とうインキュベータが使用される場合は特に、高価な機器の使用を必要としない。私たちは、複数のプラスミドトランスフェを共同文化の&gt; 1 mg / Lの収率で最大5つのタンパク質と複合体を精製するために、これらのプロトコルを使用している。興味深いことに、システムは安定行儀複合体の識別を支援します。たとえば、元HDAC1とSin3Aの二元複合体のpressionは、タンパク質の制限された収量を与え、まだSDS3の追加は、5倍高い量をもたらし、したがって、結晶化に適した構築物および安定な複合体の選択における構造生物学者を案内する。

分子細胞生物学の急速な進歩と医療における改善された薬物についての一定の必要性は、構造生物学者は、ますます複雑なタンパク質の構造を見てする必要性を作成しています。これらは、しばしば、その精巧なフォールディングおよび酵素活性をサポートするために特定の翻訳後修飾、分子シャペロン、および補因子を必要とし得る。タンパク質データバンクに存在する構造体の大部分は、細菌発現系を用いて得られている一方で、原核生物は、これらの修飾の多数を実行することができず、多くの必須の真核生物の補因子を欠いている。これは、小さなシグナル伝達分子によってだけでなく、核、細胞表面や精巧な折りたたみ式機械を必要とする分泌タンパク質のために活性化される大きなマルチサブユニット複合体の研究のために問題となることがあります。 Eの数大腸菌株は、これらの制限1のいくつかを克服するように操作されている。 mが、近年では、しかし、使用ammalian発現系は、それらが確実に他のシステム2で表現する他の方法で問題となる真核生物のタンパク質を産生するために増加している。今日では、化学物質媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入の範囲のさまざまな技術を通じて安定かつ一過性の哺乳動物発現細胞株を得るために、そのようなエレクトロポレーションおよび直接噴射3のような物理的遺伝子導入が可能である。これらの方法の全ては、長所と短所の独自のセットを有するが、それらのほんの数は、構造研究があまりにも高価および/または時間を消費するのいずれかであるのに適している。 ここでは、非常に、シンプルで高速、安価なまだサスペンション成長し、哺乳動物細胞における構造生物学のためのタンパク質複合体を発現させるための非常に効率的な方法を説明します。アプローチは、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞株（ 例えば、フリースタイル、HEK 293F細胞）の一過性同時トランスフェクションを使用しています。これらの細胞は、HEK 293 CEから誘導されているllのラインは、（例えば、フリースタイル293発現培地など）を、無血清培地を用いて高密度に達し、懸濁培養中で増殖するように適合されている。次いで、細胞を一過性ポリエチレンイミン、分枝バージョン（PEI）、エンドサイトーシス5によって宿主細胞に入るDNA / PEI複合体を形成することによって、哺乳動物細胞4の広い範囲のために機能することが報告されている安価なポリマー試薬を用いてトランスフェクトされる。この方法は、（300ミリリットルまで）小規模（30ml）および大規模の両方に適しており、実験および精製されたタンパク質複合体を高レベルで生成することができる。これは、複雑な折り畳み機械、細菌、酵母、および昆虫細胞によって行うことができない補因子、または特定の翻訳後修飾を必要とするタンパク質を研究するために特に有用である。 このプロトコルでは、Sin3A転写抑制複合体からの3タンパク質中央足場の発現および精製を提示する。これはヒストンで構成されていデアセチラーゼ1（HDAC1）、不良サイレン3（SDS3）のサプレッサーおよびスイッチに依存しない3（Sin3A）。精製された複合体は、ハイスループット結晶化試験のために使用される。

<table><tbody><tr><td>FreeStyle HEK 293Fセル&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 三角フラスコ(ベントキャップ付き</td>) <td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>ローラーボトル(ベントキャップ付き</td>) <td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン、25 kDa、分岐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>H2Oで0.5 mg / mlのストックを作成し、希薄なHClでpHを7.0に調整し、-20〜4&ordmで保存します。C</td></tr><tr><td>哺乳類発現ベクトル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m 遠心フィルターユニット</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 超遠心フィルター (10 kDaカットオフ)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

hek 293f懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

大量の組換えタンパク質複合体の発現と精製は、構造生物学研究のための必須要件です。20年以上にわたり、大腸菌などの原核生物の発現系は、高価で効率の悪い真核細胞株よりも科学文献を支配してきました。細菌における組換えタンパク質の発現収量とコストの点で明らかな利点があるにもかかわらず、特定の補因子、シャペロン、翻訳後修飾の欠如は、機能の喪失、ミスフォールディングを引き起こし、特定の真核生物のマルチサブユニット複合体、表面受容体、および分泌タンパク質のタンパク質間相互作用を破壊する可能性があります。哺乳類細胞発現システムの使用は、真核生物の発現環境を提供するため、これらの欠点に対処できます。しかし、このような方法のタンパク質収量の低さと高コストは、最近まで構造生物学での使用を制限していました。ここでは、懸濁液で成長させたHEK(Human Embryonic Kidney)293F細胞の一過性トランスフェクションを行うことにより、ミリグラム量のタンパク質を発現および精製するためのシンプルでアクセスしやすい方法について説明します。

ここでは、HDAC1、SDS3、Sin3A三元複合体の2 L（8×250ミリリットル培養）一過性の同時トランスフェクションおよび精製を示している。 HDAC1とSDS3はSin3AのHDAC-相互作用ドメイン（HID）を介してSin3Aと対話します。文化リットル当たり複雑な1mgのまでの典型的な精製収量。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500"> 修飾されたpcDNA 3.1発現ベクターの図1の模式図。プラスミドをSin3Aのアミノ末端上のアフィニティータグおよびTEV切断部位を含むようにEcoRVおよびEcoRIで消化し ​​た。 HDAC1とSDS3のタグなしバージョンのクローンを作成するには、ベクターは、KpnIとEcoRIで消化した。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500"> 図2のSDS-PAGE精製の ​​第一段階を示す。「結合タンパク質」レーンは、親和性樹脂に結合した複合体を示している。 TEV消化後、Sin3A-HID上に存在するタグが切断されると、ゲルの第二および第三のレーンに示すように、複合体は、樹脂から溶出される。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500"> タンパク質複合体のサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する図3クロマトグラムは、溶液中で二量体を形成するので、純粋な複合体は空隙容量に溶出されることに注意してください。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500"> 図3に示すゲル濾過画分を示す図4のSDS-PAGE。 図2.3×10 6個/ mlで5トリパンブルー染色HEK 293F細胞に形質移入することができる状態に。大規模なクラスタを約25秒間激しくボルテックスによって分割されてもよい細胞は、唯一、単一または分裂細胞として存在すべきである。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 問題 </td><td> 考えられる原因 </td><td> アクション </td></tr><tr><td rowspan="4">低タンパク質収量。 </td><td>トランスフェクションされた細胞の数が少ない。 </td><td>必ず細胞密度が1.0×10 6培養物にトランスフェクション反応混合物を添加する前に約あることを確認してください。 </td></tr><tr><td>細胞は、何度も継代培養された可能性があります。 </td><td>約90パスの後、新鮮な株式細胞を使用して、年齢。 </td></tr><tr><td> DNAの分解又は不純物を多量に有してもよい。 </td><td>使用されているプラ​​スミドDNAが1.8と2.0の間260/280比を有することを確認してください。アガロースゲル上でDNAを実行すると、その品質を評価することをお勧めします。 </td></tr><tr><td>タンパク質（複数可）を発現している安定したか十分に溶解しない。 </td><td>トランスフェクションのスケーリングアップする前に、小スケールでの異なる構築物をテストします。必ずタグは、目的のタンパク質（単数または複数）の構造に干渉しないことを確認します。 </td></tr><tr><td>細胞は曇って見え、珍しい色および/または臭気を持つ。 </td><td>細胞は、細菌や酵母に感染している。 </td><td>グッド無菌技術は常に使用する必要があります。層流フードや感染症の場合には、UV-消毒細胞培養室を燻蒸すると、問題を含むことができます。 </td></tr><tr><td rowspan="2">細胞は、低い生存率を持っている。 </td><td>メディアでの間違ったpH値。 </td><td>培養はCO 2百分の5から8で成長していることを確認してくださいすべての回で。 </td></tr><tr><td>細胞は3.0×10 6細胞/ mlの上に密度まで培養した。 </td><td>細胞は、2.5×10 6細胞/すぐにトランスフェクションの前に、決して3.0×10 6個 / mlを超えるミリリットル以上の密度にまで成長させることがないようにしてください。 </td></tr><tr><td rowspan="2">アフィニティー精製は動作しませんでした</td><td>タンパク質は、（複数の）発現されていない。 </td><td>上記を参照してください。 </td></tr><tr><td>精製条件は、間違っているかもしれない。 </td><td>緩衝条件の調整（ 例えば、高塩、低塩、pHが。） </td></tr></tbody></table> 表1のトラブルシューティング。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> システム </td><td> メリット </td><td> デメリット </td></tr><tr><td> E.コリ </td><td><ul><li>ファスト発現系</li><li>高タンパク質収率</li><li>安価な</li><li>同位体標識されたタンパク質の手頃な価格の製造に適した</li></ul></td><td><ul><li>タンパク質の折りたたみのために必要となる場合があります重要なシャペロンの欠如</li><li>多くの翻訳後修飾の欠如</li><li>タンパク質の機能および/または複雑なアセンブリのために重要である補因子を欠いていてもよい。 </li></ul></td></tr><tr><td> P.パストリス </td><td><ul><li>翻訳後修飾の大部分を実行することができます</li><li>安価な</li></ul></td><td><ul><li>いくつかの翻訳後修飾を欠いている</li><li>タンパク質の機能および/または複雑なアセンブリのために重要である補因子を欠いていてもよい。 </li></ul></td></tr><tr><td> 昆虫細胞中でバキュロウイルス発現 </td><td><ul><li>すべての翻訳後修飾を行うことができます&lt;/李&gt; </li><li>バキュロウイルスは、他のウイルス株よりも少ない細胞毒性である</li></ul></td><td><ul><li>形質導入のためのウイルスの準備時間がかかり</li><li>ウイルスは安定ではなく、長期間保存することができない</li><li>昆虫細胞は、タンパク質の機能および/または複雑なアセンブリのために重要である補因子を欠いていてもよい。 </li></ul></td></tr><tr><td> 哺乳動物系でバイオリアクター </td><td><ul><li>すべての翻訳後修飾を行うことができます</li><li>タンパク質機能及び複雑なアセンブリに必要な全ての補助因子を提供することができ</li><li>非常に高い密度で缶は、培養細胞</li><li>複雑なフォールディング機械を必要とするすべての哺乳動物タンパク質を発現することができる</li><li>非常に高いタンパク質収率</li></ul></td><td><ul><li>バイオリアクターを使用するために専門スタッフが必要です。 </li><li>高価な機器が必要です。 </li><li>最適発現条件sは、時間を消費することができる。 </li></ul></td></tr><tr><td> HEK 293F懸濁細胞 </td><td><ul><li>すべての翻訳後修飾を行うことができます</li><li>タンパク質機能及び複雑なアセンブリに必要な全ての補助因子を提供することができ</li><li>複雑な折りたたみ機構を必要とするすべての哺乳動物タンパク質を発現することができる</li><li>高速かつ直感的なトランスフェクションプロトコール</li><li>バイオリアクターおよび/または他の市販のトランスフェクション試薬に比べて比較的安価。 </li></ul></td><td><ul><li>細菌での発現はできるだけ安く、手頃な価格ではないが、 </li></ul></td></tr></tbody></table> 表2の利点と主な発現システムの欠点。

哺乳類システムによる組換えタンパク質の発現は、構造生物学のためのタンパク質複合体を生成するための魅力的な方法になりつつあります。ここでは、浮遊増殖した哺乳類細胞を使用して構造研究のためのタンパク質複合体を精製する、シンプルでありながら高効率な発現システムを紹介します。

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

次のビデオの全体的な目的は、哺乳類の発現システムを使用してタンパク質またはタンパク質複合体を良好な収量で生成するためのシンプルで手頃な価格の手法を実証することです。これは、HEC 2 93 F細胞を、5%の二酸化炭素に維持された雰囲気の加湿振盪器で懸濁液中で培養することによって達成されます。第2のステップとして、細胞に1つ以上の高コピー数発現プラスミドを一過性にトランスフェクトします。トランスフェクション剤ポリエチレンEINまたはPEIを使用して、細胞を48時間増殖させてから回収しました。次に、アフィニティー樹脂を用いてタンパク質を精製し、続いて目的のタンパク質複合体を精製するためのゲルろ過を行い、構造的および機能的な研究を行います。最終的に、この手頃な価格でシンプルな哺乳類発現システムにより、細菌細胞では発現が困難なタンパク質やタンパク質複合体の発現と精製が可能になります。このアプローチの主な利点は、タンパク質複合体の発現に対するその利便性と汎用性です。これは、特にタンパク質発現ベクターを混合して一致させることができるため、細菌でタンパク質を作るのとほぼ同じくらい簡単です。この方法は、最初はタンパク質圧縮の発現をテストするために小規模で使用できますが、構造的および機能的な研究のために、成功の鍵は、細菌や酵母感染のない健康な状態に細胞を維持することです。培地中の抗生物質はタンパク質の収量を大幅に減少させます。まず、1ミリリットルあたり2,000万個の細胞密度のHEC 2 9 3 F細胞を1ミリリットルの液体窒素から取り出し、摂氏37度の水浴ですばやく解凍します。数回ピペッティングして塊を砕き、内容物全体を34ミリリットルのプレウォーム培地を含む250ミリリットルの円錐形細胞培養フラスコにピペットで移します。48時間後に、37°C、120 RPM、5%二酸化炭素の加湿眼振とうインキュベーターに培養物を置きます。トライアンブルーで細胞生存率を確認します。この段階での正常な細胞生存率は、細胞が1ミリリットルあたり約100万個の細胞数に達すると約70%になります。それらを1ミリリットルあたり35万個の細胞の最終数までマッサージし、60ミリリットルの予温培地を含む250ミリリットルの円錐形細胞培養フラスコに入れ、48時間ごとに、または1ミリリットルあたり約200万個の細胞のアカウントに達したときに細胞をマッサージし続けます。ここに示されているのは、トランスフェクションのために播種する準備ができているストックから、1ミリリットルあたり230万個の細胞でTrian blue stain HEC 2 9 3 F細胞のサンプルであり、細胞は単一細胞または分裂細胞としてのみ存在するべきです。細胞が生い茂りすぎると、この写真に示すように、細胞は大きな塊を形成し、生存率が非常に低くなります。細胞がクラスターを形成している場合、これらは25秒間の激しい渦によって分裂する可能性があります。大規模な培養を開始するには、各1リットルのローラーボトルで300ミリリットルの最終容量に1ミリリットルあたり50万個の細胞を播種します。加湿オービタルシェーカーで、摂氏37度、135 RPM、二酸化炭素5%の加湿オービタルシェーカーで、細胞が1ミリリットルあたり100万個の細胞密度に達するまで24時間インキュベートします。次に、フィルター滅菌したDNAの合計300マイクログラムを30ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSにピペットで移し、3秒間激しくボルテックスします。次に、1.2ミリリットルあたり0.5ミリグラムを追加します。滅菌したPEIをPB SDNA溶液にろ過し、さらに3秒間激しくボルテックスします。混合物を室温で20分間インキュベートしてから、ベビーベッドに続く細胞に混合物を添加します。トランスフェクションは、加湿された眼窩振盪器内で細胞を加湿したインキュベーターで、摂氏37度、135 RPM、および48時間後に5%二酸化炭素でさらに48時間インキュベートします。細胞をGの3000倍で5分間遠心分離することにより、細胞内タンパク質を回収します。セルペレットがすぐに使用できない場合は、マイナス80°Cで保存できます。このプロトコールは、タンパク質の1つがフラグタグを持つ核からのタンパク質複合体の精製に最適化されています。精製resusを開始するには、細胞パレットを約40ミリリットルの予冷溶解液に懸濁し、培養物1リットルあたりの緩衝液、数回のピペッティングアップとピペッティングの組み合わせ、およびガラスホモジナイザーで15秒の3サイクルの超音波処理を行います15秒オフ。次に、108, 000倍のGを摂氏4度で25分間遠心分離し、仰臥位の被覆を保持します。次に、樹脂平衡緩衝液で3回洗浄することにより、培養物1リットル当たり1.2ミリリットルのアンチフラッグ充填アロス樹脂をインキュベートし、1つ以上の50ミリリットル遠心チューブ内の全細胞抽出物をアフィニティー樹脂で表し、摂氏4度で30〜120分間静かに回転させ、その後、摂氏4度で3000倍Gで1分間遠心分離する。すくみを捨てた後、樹脂を15ミリリットルの遠心分離管に移し、合計45ミリリットルの予め冷やした緩衝液で洗浄し、1つは遠心分離機の前に廃棄し、その後、高塩緩衝液を使用して洗浄と遠心分離を繰り返す後、低塩緩衝液とTEV切断緩衝液を使用します。各洗浄がレジンを完全に再懸濁するのに十分であることを確認してくださいが、それ以上ではないことを確認してください。次に、10 μリットルの樹脂サンプルを採取し、結合したタンパク質サンプルを表すために、2 倍のタンパク質ローディングバッファーの 1 容量に希釈して分析します。還元剤は樹脂から抗体を放出するため、使用しないでください。次いで、樹脂を1リットル当たり約40μgのTEVプロテアーゼで予め冷却したTEV切断緩衝液10ミリリットルに再懸濁し、チューブを数回反転させて混合する。TEVプロテアーゼのレベルは、発現タンパク質の量に応じて最適化できます。タンパク質の酸化を防ぐためにチューブの雰囲気を100%窒素ガスに交換してから、翌日4°Cで一晩中穏やかに回転させます。サンプルをGの3000倍で10分間遠心分離し、その後、サピネートを適切な分子量カットオフの超遠心フィルターに移し、500マイクロリットルまで濃縮します。濃縮タンパク質の10マイクロリットルのサンプルを採取し、分析のためにタンパク質ローディングバッファーの2倍の1容量に希釈します。このサンプルは TEV 溶出液サンプルを表しています。次に、樹脂の10マイクロリットルのサンプルを採取し、タンパク質ローディングバッファーの2倍の1容量に希釈します。このサンプルは、ポストTEV樹脂サンプルを表しています。次のステップは、タンパク質をサイズ排除カラムに通すことであり、目的の複合体のサイズに応じて適切なゲルろ過マトリックスを使用する必要があります。この場合、10 x 300 mm S 200 サイズ排除クロマトグラフィーカラム A を使用し、サイズ排除クロマトグラフィーカラムとゲルろ過バッファーを同等にしました。0.22ミクロンのフィルターでタンパク質をろ過し、サンプルをカラムにロードします。カラムから外れたフラクションの収集に進みます。最終工程として、収集したサンプルに対してSDSポリアクリルアミドゲルのエレクトロフェレーシスまたはSDSページを行い、ゲルろ過画分と同様に、ヒストンDS SLA oneまたはHD oneのサプレッサーの不良サイレンシング3またはSDS3およびsyn 3、HDAC相互作用ドメインまたはsyn three、HIDが安定なターニー複合体を形成する。ターニー複合体の親和性精製は、SDSページを通じて観察できます。ここに示されているのは、コットによって生成され、2リットルの細胞を横切る精製された複合体です。結合したタンパク質レーンは、アフィニティー樹脂に結合した複合体を示す。TEV消化後、sin 3 A HIDに存在するタグが切断され、複合体が言及されます。ここに示す樹脂は、10 x 300 mm S 200 サイズの排除クロマトグラフィーカラムを使用して精製されたタンパク質複合体のクロマトグラムです。純粋な錯体は、溶液中で二量体を形成するため、ボイドボリュームの近くで回避されることに注意してください。最後に、SDSページ分析により、ゲルろ過画分中の精製タンパク質が明らかになります。このビデオを見れば、懸濁液で成長したHEC 2および3アプリ細胞の増殖、維持、およびコトランの方法、およびタンパク質の親和性、精製、濃縮の方法について十分に理解できるはずです。複雑な健康な細胞は実験の成功に不可欠であるため、それらが成長し、その条件で維持され、定期的に継代することを確認してください。組織培養に先延ばしにしないでください。構造生物学者は、哺乳類細胞から大量のタンパク質やタンパク質複合体を発現させ、精製するのは簡単です。

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HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

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