アン体外モデル

この手順の全体的な目標は、毒素サイクリンの存在下でのミクログリアのGLO細胞へのユニークな形質転換を実証することです。これは、最初にカバースリップを細胞外マトリックスタンパク質でコーティングすることによって達成されます。第2ステップでは、グリア細胞をカバースリップに播種し、次にサイクリンビーズとラテックスビーズを培養物に投与します。

最終ステップでは、細胞を免疫化学によって染色します。最終的に、ミクログリア細胞の核形成および食作用能力に対するサイクリンの影響は、免疫蛍光顕微鏡法によって評価できます。ミクログリア細胞株の使用のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、初代グリア培養の使用が、GLOボイド細胞白質ジストロフィーまたはGLDの個人の脳内のI星状細胞とミクログリアとの間の仮説上の相互作用を模倣することです。

細胞外マトリックスまたはECMコーティングされたカバースリップを調製するには、まず円形のカバースリップを滅菌塩酸とともに滅菌シャーレに浸します。30分後、カバースリップを滅菌水で3回洗い、95%エタノールに少なくとも20分間浸します。カバースリップを自然乾燥させた後、150〜250マイクロリットルの希釈ECMタンパク質コーティング材料の液滴をパラフォームのシートに追加し、液滴を分散させて、配置後にカバースリップが重ならないようにします。

次に、鉗子を使用して各液滴にカバースリップを静かに置き、4〜6時間後にサッシを閉じた状態でパラフォームを細胞培養フード内に置き、ECMコーティングされたカバースリップを上にして24ウェルプレートの個々のウェルに配置します。次に、滅菌PB S3で各ウェルを洗浄し、カバースリップを摂氏4度で保管します。カバーにプレーティングするためのグリア細胞を準備するには、グリア細胞培養物から培地を吸引し、10ミリリットルの滅菌PBSで単層を3回穏やかに洗浄します。

5〜10分後に8〜10ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を切り離します。摂氏37度で、フラスコに20ミリリットルの完全な培地を加えて反応を止めます。次に、細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、細胞を10分間スピンダウンします。

300 G、室温でP 1000を使用し、2ミリリットルの新鮮で完全な培地に口蓋を穏やかに再懸濁します。カウント後、細胞を1ミリリットルあたり10〜5個目の細胞の約1倍に希釈します。次に、ECMコーティングされたカバースリップのそれぞれに500マイクロリットルのセルをプレートします。

各ウェルに新鮮な完全培地を追加し、プレートを摂氏37度で3〜5日間インキュベートします。細胞が目的の合流点に達したら、調製したばかりのサイクリンを各ウェルに加え、培養プレートを静かに渦巻いて混合します。1週間のサイクリン処理の後、培地を収集し、室温でウェルあたり500マイクロリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒドに細胞を固定します。

次に、各ウェルをPBSで3回洗浄し、プレートを摂氏4度で保管します。免疫細胞化学によってGLO細胞を可視化するには、まずPBSをブロッキングバッファーに交換し、細胞を室温でインキュベートします。1時間後、ミクログリアマーカーIO Oneに対する一次抗血清中の細胞を室温で少なくとも1時間インキュベートし、その後、各ウェルをPBSで5分間3回洗浄します。

適切な蛍光標識二次抗体で細胞をインキュベートした後、DAPIで細胞を対比染色し、核を同定します。次に、示したように細胞を洗浄した後、封入剤を使用して各カバースリップを個々の顕微鏡スライドにマウントし、蛍光顕微鏡でスライドを観察して視覚的および定量的分析を行います。サイクリン処理後、固定前にサイクリン処理したミクログリアの食作用活性を評価するには、メーカーおよび指示に従って、FITC標識ラテックスビーズを各G OID細胞培養物に添加してください。

48時間後、示したように細胞をPFAに固定し、図のように細胞を免疫化学用に処理します。最後に、蛍光顕微鏡免疫化学によって蛍光標識ビーズと共局在するIBO1陽性ミクログリアの数を評価します。IO ONEと核カウンター染色剤を併用してミクログリアを染色すると、大きな丸みを帯びた多核細胞を同定できます。

多くの場合、核のサイズの大幅な拡大は、この画像で観察されるように、これらの細胞の多核状態を反映しており、サイクリン処理は、単核ミクログリアおよび多核GLO細胞のPHA酸性活性の増加によって測定可能なミクログリアの一般化された活性化も呼び起こすことに注意してください。この代表的な画像で観察されるように、IBO 1陽性ミクログリアのPHA Acidly活性プロファイルは、オリゴデンドロサイト前駆細胞との共培養中に容易に同定できます。サイクリン治療に応答したこれらの多核細胞の形成はGLDの神経病理学の決定的な特徴であり、この病理に対するこれらの細胞の寄与はこれまでこのように調査されていなかったため、この技術の意味はGLDの治療にまで及びます。