人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

この手順の全体的な目標は、サイトブラシを使用して子宮頸管内掻爬から子宮頸部単核細胞を分離することです。単離されたこれらの細胞は、フローサイトメトリーなどの複数のアッセイに使用でき、女性の生殖管の免疫細胞の表現型と機能を決定できます。サイトブラシと子宮頸部洗浄サンプルの収集は、婦人科医または訓練を受けた医師が行わなければならない非侵襲的な手順です。

子宮頸部膣洗浄は最初に行われ、子宮頸管内を 2 ミルの PBS で洗浄し、洗浄後に後円蓋から採取します。頸部スクレーパーの凹面端を子宮頸部に当てて回転させ、頸部の開口部または頸部の口をサンプリングします。次に、サイトブラシを子宮頸管内OSに挿入し、360度回転させます。

穏やかな圧力を使用すると、サンプルの血液汚染がないようにするのに役立ちます。スクレーパー内のサイトブラシは、5ミルのPBSを含むチューブに集められます。氷上で輸送された後、サンプルは急速にボルテックスされ、細胞を細胞ブラシから解離します。

サンプルを培地で洗浄したら、100ミクロンのナイロンフィルターでろ過します。これにより、サンプルからリンパ球、単球、および上皮細胞を収集できます。これで、細胞を表面タンパク質に対する抗体で染色する準備が整いました。細胞が固定されたら、フローサイトメーターで実行できます。

得られたデータを分析して、子宮頸部に存在するCD 4およびCD 8 T細胞集団の両方の表現型を評価する方法を示します。こんにちは、私はDr.Keithの研究室の博士課程の学生です。私たちの研究は、免疫活性化とHIV感受性、および疾患の進行との関連に焦点を当てています。

HIV感染の大部分は現在、異性間の性交を通じて発生しているため、女性の生殖器へのHIV感染に対する防御の相関関係を決定することにも関心があります。残念ながら、生殖管からのサンプルの収集は非常に困難であり、研究参加者にとってはかなり侵襲的である可能性があります。CMCまたは子宮頸部単核細胞を収集するためのサイトブラシの使用は、生検などの他のプロトコルと比較して、より迅速で簡単な方法です。

このビデオでは、フローサイトメトリーやその他のダウンストリームアプリケーションで使用するためのCMCの単離と調製の方法をご紹介します。収集後、サイトブラシとスクレーパーは5ミルの冷たいPBSで輸送されます。サンプルを氷上で輸送することは重要であり、サンプル収集後2時間以内に処理する必要があります。

この時点で微量の血液で汚染されたサンプルは、細胞をサイトブラシから解離させるために、さらなる分析から除外する必要があります。細胞がまだ細胞ブラシとスクレーパーに残っているため、チューブを45秒間高でボルテックスします。これらは手動で削除する必要があります。

新しい手袋を着用し、サイトブラシを使用してスクレーパーから残っている材料をこすり落とします。漂白剤溶液に捨てた後、親指と人差し指を使用して、ファルコンチューブを上下に絞って、残りのすべての細胞をサイトブラシから取り除きます。サイトブラシを廃棄した後、別のサンプルを準備する前に手袋を交換し、トランスファーピペットを使用してチューブの側面をPBSで洗浄し、すべてのサンプルが収集されるようにします。

100ミクロンのナイロンをフィットさせます。新しいFalconチューブでろ過し、ピペットを使用してPBS溶液の全量をろ過します。FBSが不足している5ミルのRPMIメディアを元のチューブに追加します。

ピペットを使用してチューブの側面をよく洗い、付着した粘液や破片を取り除きます。次に、フィルターを介してメディアを転送します。漂白剤に廃棄する前に、ろ過されたメディアの一部を使用してフィルターの底を洗います。

単離された細胞をペレット化します。ペレットが外れるのを防ぐために、1500 r pmでサンプルを10分間遠心分離します。細胞をフローサイトメトリーに使用する場合は、遠心分離機のブレーキをオフにすることを忘れないでください。

非特異的抗体の結合を防ぐために必要なブロッキング溶液を調製します。遠心分離ステップでは、サンプルあたり100マイクロリットルのブロッキング溶液を使用してください。ブロッキング溶液には、93.2マイクロリットルのファックス、ウォッシュ、またはPBSに加えて、2%FBS、5マイクロリットルのFBS、および1.8マイクロリットルのマウスIgGが含まれています。

スピン後、生細胞を持つほとんどのサンプルには、目に見えるペレットが現れます。場合によっては、ペレットはかなり大きくなります。他のサンプルでは、ほとんど見えない場合があります。

ペレットのサイズは、必ずしも細胞収量と関連しているわけではありません。上清を慎重に傾けるために、細胞を乱さないようにし、穏やかに攪拌してペレットを再懸濁します。細胞を5ミルのPBSで洗浄し、1500で10分間遠心分離を繰り返します。

RRP Mをブレークオフして、もう一度上清をデカントし、前と同じようにペレットを再懸濁します。この時点で、細胞は凍結保存するか、染色前に表面染色する準備ができています蛍光抗体を使用すると、以前の遠心分離中に調製したブロッキング溶液と細胞をインキュベートすることにより、非特異的結合をブロックすることが有益です。細胞ペレットを再懸濁した後、100マイクロリットルのブロッキング溶液をサンプルに加え、十分に混合します。

残りのプロトコールステップは、96ウェルプレートまたはファックスチューブのいずれかで実行できます。CMCペレットのサイズによって異なります。ブロッキング溶液と細胞混合物をファックス管に移します。

サンプルを摂氏4度で10分間インキュベートします。10分間のインキュベーション中に、生細胞と死細胞の識別に使用する生存率色素を調製します。データ解析中は、メーカーの指示に従って生存率色素を調製し、必要に応じて予備滴定します。

染料混合物は、使用する準備ができるまで、必ず光を避けてください。10分間のインキュベーション後、細胞を500マイクロリットルのファックスで洗浄し、2%FBSで洗浄またはPBSを洗浄し、次いで1600RPMで10分間遠心分離する。紡糸後、ファックス管から上清をデカントします。

攪拌により細胞を再懸濁します。次に、以前に調製した生存率色素の適切な量を追加します。細胞を摂氏4度で30分間インキュベートし、サンプルが光から覆われたままになるように、ティンフォイルで包みます。

このインキュベーション中に、細胞の標識に使用する蛍光抗体のマスターミックスを調製できます。CMCで使用する前に、末梢血コントロールサンプルで抗体を事前に滴定し、検証してください。滴定した抗体を混合し、サンプルあたり100マイクロリットルの最終容量にします。

ファックスで、洗浄し、これらのステップ中にすべての抗体を光から保護します。30分間のインキュベーション後、もう一度、サンプルを500マイクロリットルのファックスで洗浄し、洗浄、遠心分離、デカントし、前と同じように細胞を再懸濁します。次に、前のインキュベーション中に調製した100マイクロリットルの抗体カクテルで細胞をインキュベートします。

もう一度、サンプルを摂氏4度で30分間インキュベートし、サンプルが光から保護されていることを確認します。インキュベーション中のCMCは、最終的に500マイクロリットルのPBSで洗浄する準備が整いました。サンプルを1600RPMで10分間遠心分離します。

ペレットをデカンテーションして懸濁した後、細胞を最終容量750マイクロリットルに1%パラアルデヒド溶液で希釈します。それらを固定するには、フローサイトメーターの目詰まりを防ぐために、この大量の細胞を再懸濁することが重要です。この量でも、サンプルチューブはかなり曇って見えることがあります。

細胞がフローサイトメーターで取得されるまで、細胞を摂氏4度の暗所に保ちます。サイトブラシサンプルに加えて、子宮頸部と膣から2ミルのPBS洗浄液を定期的に収集します。このサンプルを1400 RPMで7分間遠心分離し、洗浄液から細胞の破片を除去します。

その後、残りの上清を割り振って摂氏マイナス80度で凍結し、将来の可溶性タンパク質濃度の分析に役立てることができます。このデータは、フローサイトメトリーによって得られた細胞表現型データと組み合わせて特に有用であり得る。CMC サンプルを実行する前に。

スペクトルのオーバーラップを調整するために、ビーズまたはシングルステインセルを使用して、ランコンペンセーションチューブのゲーティングを支援するPBMCコントロールを準備すると便利です。CMCチューブ全体を取得して、PBMCサンプルと比較したすべてのイベントを収集します。CMCは、FSCエリアと高さプロットでより多くのダブレットを示し、pbmcほど特徴的なリンパ球集団を示さない可能性があります。

サンプルを取得したら、FlowJoなどのプログラムで分析するためにファイルをエクスポートします。ここでは、CMC由来のCD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の典型的なゲーティング戦略の主要な構成要素を示します。サンプルのシングレットでGに対するFSC面積対高さプロットを使用します。

この一致した比較では、p BMCと比較して、CMCサンプルのダブレット数の増加がはっきりとわかります。次に、蛍光マーカーまたはFSCの時間に対するプロットは、品質管理のステップとして機能します。流量の変更によってデータにアーティファクトが発生した場合は、このステップで削除できます。

上部には、高品質のサンプルを示す一貫した蛍光経時プロファイルが表示されます。以下に、複数の中断と流量のサンプルを示しますが、これらは今後の分析から除外できます。CMCサンプル中のリンパ球集団の同定は困難な場合があります。

A-P-B-M-Cコントロールを使用すると、歩行配置に役立ちます。ご覧のとおり、一部のサンプルは大きく明確な集団を示し、他のサンプルはリンパ球集団を欠いています。全体として、これらのサンプルは除外する必要があります。

リンパ球の集団に焦点を当てますが。また、系統マーカーの発現を欠く細胞をゲーティングすることにより、単球にgを投与することも可能である。樹状細胞とCD16やCD11などの単球マーカーの組み合わせを発現する細胞を同定することが可能です.生存率マーカーまたは色素を含めることは、新鮮な細胞でもCMC分析に重要です。

ご覧のとおり、CMCリンパ球の大部分は生存可能ですが、一部のサンプルには、分析から除外しなければならない死細胞が高頻度に含まれています。死細胞は、リンパ球の歩行内で抗体および交絡データ解析を非特異的に取り込む可能性があります。CD 3染色は堅牢でなければなりません。

CDの3つの陽性T細胞の割合は、PBMCサンプルよりも低く、変動が大きいため、CMCサンプル全体を取得し、収集されるイベントの数を最大化することが重要です。CD 4陽性T細胞集団とCD8陽性T細胞集団は、TBMCサンプルと同様に同定できます。一部のCMCサンプルでは。

CD 4 対 CD 8 の比率は、末梢血で観察されるよりも低く、一部の個人は大きな二重陰性 T 細胞集団を示します。CD4陽性T細胞集団およびCD8陽性T細胞集団を同定した後、多数の表現型マーカーの発現を定量化することが可能である。CD 1 61の発現はCMCで検出できますが、血液中に明らかなCD 1 61の明るい集団は生殖管には存在しません。

同様に、CD 69やH-L-A-D-Rなどの活性化マーカー、CCR fiveやPD oneなどのマーカーの発現も、CMCサンプル間で確実に測定し、定量することができます。サイトブラシサンプルを使用することで、特に感染症の状況において、粘膜免疫細胞の表現型と機能の両方を特徴付けることができます。これにより、粘膜免疫学や生殖免疫学の制御メカニズムについてより深い洞察が得られるだけでなく、粘膜ワクチンの有効性に関する新たな指標の開発の基礎も得られます。