途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離
2014年9月23日
若い胚性マウス弁におけるタンパク質発現の解析は、利用可能な組織が限られているために妨げられてきました。この原稿は、ウェスタンブロット解析のために、発生中の胚性マウス弁領域からタンパク質を調製するためのプロトコルを提供します。
この手順の全体的な目標は、胚性心臓弁からタンパク質を分離して抽出することです。これは、まず妊娠したマウスから胚を単離することによって達成されます。2番目のステップでは、心臓を胚から解剖し、最後のステップで心臓弁を採取します。
組織を溶解し、得られたタンパク質サンプルをその後の分析のために調製します。最終的には、ウェスタンBLO分析を使用してタンパク質発現レベルを評価できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、発達中の心臓の小さくてコンパクトな形状のために解剖手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。
発生の望ましい胚の日に、妊娠中の女性の腹部を滅菌するために70%エタノールを使用してください。次に、下腹部の皮膚と筋肉を持ち上げて内臓から離し、下腹部の腔を解剖して開き、子宮角にアクセスできるようにします。次に、鉗子で子宮頸部を保持し、先端まで慎重にコドルをカットします。
次に、子宮角を持ち上げて、角を所定の位置に保持する結合組織を切断し、子宮角とUCTの接合部を切断して除去を完了します。解剖した子宮角を冷たい0.1モルトリスバッファーを含むシャーレに入れ、必要に応じてすすぎます。.次に、子宮の角を切ります。
縦に開いて胚の袋を露出させます。胚を露出させるには、胎盤と胚の接合部で胚嚢を切り開き、臍帯血管を切開して胚を解放します。解剖した胚を冷たい0.1モルトリス緩衝液を含む第2のシャーレに置き、残りの解剖した胚を含む最初のシャーレを次の胚解剖まで氷に戻します。
斬首後、胚を仰向けに置き、胸壁を胸郭の側面に沿って垂直に切断し、リンプの場合はaの近くで、横隔膜の上で水平に切断します。心臓を視覚化するには、胸壁を開きます。次に、鉗子を大きな血管に沿って高く保持し、心臓を持ち上げて下の血管を切断します。
次に、鉗子の上を切って心臓を解放します。肺血管が切断されないままである場合、本明細書に記載の胚期で継続する前に心臓で肺を切除すると、肺動脈はわずかに不透明である。動脈を特定した後、バルブのレベルより上で動脈を切断して取り外します。
次に、ECD心室心筋を避けて肺動脈弁のすぐ下を切断し、関心領域から余分なトリスバッファーを取り除きます。肺動脈のように2マイクロリットルの溶解緩衝液を含むeinorチューブにバルブを配置する前に、大動脈はわずかに不透明に見えます。その識別後、大動脈弁のすぐ下を切断します。
繰り返しになりますが、小柱状心室心筋を避けます。余分なトライ溶液をすべて取り除き、溶解、緩衝液、肺動脈組織を含むアイノアチューブにバルブを移します。すべての組織が収集されたら、すぐにサンプルを摂氏マイナス80度でさらに置きます。
タンパク質抽出に使用し、収集した組織を氷上で解凍し、次いで4°Cで13,100Gで1分間サンプルをペレット化する。得られたサンプルの容量を確認し、溶解バッファーを使用して総容量を最大40マイクロリットルにします。次に、5mmのステンレス製ビーズを加えて、メーカーの指示に従って、50ヘルツで2〜4分間、ライアでサンプルを乱し、均質化します。
均質化後、チューブを短時間回転させ、サンプルを新しいチューブに移し、不溶性の破片を残してさらなる実験分析を行います。この調製技術を用いて、E 13.5胚由来の単一の大動脈弁領域において、リン酸化smad 1 5 8を検出することができます。例えば、単一のバルブ領域からでも単離されたタンパク質は、シグナル強度がプールされるバルブ領域の数に比例して増加する微弱なp smadバンドを検出するのに十分です。
重要なことに、p smadベータアクチン比は、利用可能なタンパク質のレベルが低いため、異なるサンプルサイズ間で明らかに一定であり、同じブロットをストリッピングして総smadを再プローブすることはできません。しかし、全smad oneとβアクチンを示す別のブロットは、同じ発現パターンを示します。これらの弁領域には、この調製技術を右心室、心室心筋マーカー、NPからのサンプルと組み合わせて使用すると、心室心筋の汚染がほぼ完全にありませんが、このマーカーは心室で容易に検出されます。
さらに、心室心筋マーカーであるミオシン軽鎖2Vも心室サンプルでは容易に検出可能ですが、大動脈弁領域ではほとんど検出できず、この解剖後の解剖の正確さを強調しています。QPCRやRN AICなどの他のMESは、さまざまな発生ステップで影響を受ける下流の遺伝子などの追加の質問に答えるために実行できます。
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概要
本記事では、マウスの胚心臓弁からタンパク質を単離および抽出するためのプロトコルを紹介します。本手法は、組織の利用可能量が限られているために困難であったタンパク質発現の解析における課題を解決するものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 心血管研究
背景
- 胚組織におけるタンパク質発現解析は、多くの場合、サンプルサイズによって制限されます。
- 心臓弁におけるタンパク質レベルを把握することは、発生学的研究において極めて重要です。
- ウェスタンブロット解析は、タンパク質発現を評価するための一般的な手法です。
- 胚心臓のような小さな組織の解剖は、技術的に困難な場合があります。
研究目的
- マウス胚心臓弁からのタンパク質抽出に関する詳細なプロトコルを提供すること。
- タンパク質発現レベルを調べるためのウェスタンブロット解析を容易にすること。
- 限られたサンプルからのタンパク質解析における再現性と正確性を向上させること。
使用した方法
- 妊娠マウスからの胚の分離。
- 胚からの心臓の摘出。
- タンパク質抽出のための心臓弁の回収。
- 分析用タンパク質試料調製のための組織溶解。
主な結果
- 胚性心臓弁からのタンパク質抽出の成功。
- ウェスタンブロット解析に適したサンプルの調製。
- 効果的な学習のための解剖技術の実演。
- 発達中の心臓組織におけるタンパク質発現レベルの評価。
結論
- 本プロトコルにより、胚心臓弁におけるタンパク質発現の効果的な研究が可能になります。
- 解剖技術を習得するには、視覚的な補助資料が不可欠です。
- 本手法は、心臓発生および関連分野の研究を前進させることができます。
よくある質問
業界における重要性
限られた胚組織からのタンパク質単離により、初期発生モデルにおけるシグナル伝達経路の活性化を検出することが可能になります。この手法は、マイクロダイセクションによって回収した弁領域のプールサンプルから、リン酸化タンパク質の半定量的なデータを提供し、ターゲットの妥当性確認を支援します。本手法は、サンプルの希少性が心血管ターゲットのメカニズム解明によるリスク低減を妨げているという、前臨床研究における主要なボトルネックを解消するものです。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：pSmad1/5/8などのリン酸化シグナルタンパク質の検出を通じて、心臓弁形成における治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：E13.5マウスの大動脈弁の4つの領域からタンパク質を抽出するための再現可能なワークフローを提供し、各領域から約1 µgのタンパク質を得ることができる。
- 予測的価値：疾患に関連する胚システムにおけるパスウェイ活性化の半定量的な評価を可能にし、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 下流のウェスタンブロット解析に向けて検証済みの生物学的試料を調製し、表現型スクリーニングにおける信頼性の高い化合物評価を可能にする。
- 運用的価値： プロテアーゼ阻害剤を含むTrisベースのバッファーを用いた溶解およびホモジナイズ、および変性のためのSDSサンプルバッファーを用いたプロトコルを標準化する。
- 拡張性： 組織をプールして低タンパク質収量の制限を克服することで、異なる発生時点間でのプラットフォームの再利用を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： サンプルサイズ全般にわたって一貫したpSmad/β-actin比を用いることで、探索段階のタンパク質発現データと前臨床検証を統合します。
- メカニズム的なリスク低減： 弁領域においてMYL2VおよびANPマーカーが消失していることを確認し、心室心筋を除外することで、ターゲットエンゲージメントの曖昧さを低減します。
- 予測の信頼性： 内部コントロールを用いてタンパク質発現パターンを発生段階に関連付けることにより、リスク調整された進展判断を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、疾患に関連する胚システムからメカニズム的なリードアウトを提供することで、標的仮説の検証からリード化合物の同定に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合します。
- 探索生物学：弁組織におけるリン酸化シグナル伝達タンパク質の検出を通じて、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：標準化されたタンパク質抽出により、アッセイ可能なサンプルを提供し、化合物スクリーニングに向けた再現性のあるウェスタンブロット出力を可能にします。
- 分析：タンパク質プールサイズに比例する化学発光信号強度を介して、定量的な従属変数の測定値を生成し、条件間の比較分析を支援します。
- トランスレーショナルリサーチ：全Smadおよびβ-actinの個別のブロットで検出可能なパスウェイ特異的な発現パターンを保持することで、胚研究での発見から前臨床モデルまでの連続性を維持します。
- エンタープライズでの再利用：胚の心血管研究におけるタンパク質単離の拡張可能な能力を確立し、冗長なプロトコル開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：マイクロダイセクションされた組織から低存在量のリン酸化タンパク質の検出を可能にすることで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：規定のライシス量、ビーズを用いたホモジナイズ、およびウェスタンブロットに向けた一貫したサンプル調製により、再現性と標準化を強化する。
- 戦略的価値：心血管系の早期ターゲット評価におけるメカニズムの曖昧さを軽減し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：胚の弁領域からの半定量的なパスウェイ活性化データを提供することで、リスク調整後の優先順位付けを促進する。
実施上の留意点
- 心室心筋の混入なしに弁領域を分離するため、胚心臓構造のマイクロダイセクションに関する専門知識が必要です。
- サンプルの均質化（ステンレスビーズを用いたライザー）およびサンプルの清澄化のための13,100 × gでの遠心分離を行う機器に依存します。
- サンプルの整合性を確保するため、溶解バッファー量（最終容量40 µL）およびプロテアーゼ阻害剤の使用について、チーム間での標準化が必要です。
- E13.5の大動脈弁領域以外の胚組織や発生段階に本プロトコルを適用する場合、適応に関する検討が必要です。
- 収量が低いため分光光度法による全タンパク質の定量ができず、半定量的なウェスタンブロット解析に依存せざるを得ないという実用的な制限があります。
