の世代エンテロバクターエスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

次の実験の全体的な目標は、グルコースを添加した最小限の塩培地で増殖する野生型細菌株のTROを作製することです。これは、トランスポゾーンを野生型の宿主株に変換して、インサートにランダムに転位した細菌のカンナマイシン耐性集団を得ることによって達成されます。次に、形質転換体はレプリカプレーティングによってスクリーニングされ、高濃度の培地では成長するが、グルコースが補充された培地である最小限の塩では成長しないTROが特定されます。

次にゲノム解析を行うと、変異体由来のDNAがライゲーションされ、大腸菌に形質転換され、中断された遺伝子のセグメントが両端に挟まれたトランスポゾンを含むプラスミドを得る。DNAシーケンシングおよび基本的な局所アライメント検索ツール解析に基づいて、中断された遺伝子の推定的同一性を示す結果が得られます。この手法で用いられるトランスポゾンは、複製起点、カナマイシン耐性遺伝子、モザイク末端を持っています。

タンパク質の転置結合に。トランスポゾンタンパク質遺伝子を欠いているため、このトランスポゾン遺伝子をトランスポゾンDNAフラグメントに追加し、トランスポDNAとタンパク質との間の複合体を宿主にエレクトロポレーションする必要があります。エレクトロポレーションの主な利点は、形質導入や結合の必要性がなくなることです。

転位遺伝子が存在しないと、通常、安定したインサートが生成され、複製起点とCIN耐性遺伝子の存在により、変異した遺伝子の同定が容易になり、組換えプラスミドとして回収されます。この方法は、アミノ酸、核酸、ビタミンの生合成に必要な遺伝子の同定など、微生物生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、エンテロバクター種YSUの金属耐性遺伝子を探していたときで、エンテロバクター種の一晩培養を使用してコンピテントセルをエレクトロポレーションするために開発していた微生物生理学研究室に組み込むことにしました。

YSUは、新鮮なLB培地で1〜20希釈を調製し、摂氏30度および120RPMで0.4〜0.6のOD600にインキュベートします。細胞が適切な密度に達したら、氷上で5分間冷却し、摂氏4度と7,000Gで5分間遠心分離します。上澄みを捨て、Resusと同量の氷冷水を使用します。

細胞を摂氏4度と7,000Gで5分間遠心分離機に懸濁します。洗浄を繰り返した後、上清を捨て、氷冷水で細胞ペレットの容量に等しい容量で細胞を懸濁します。次に、0.5マイクロリットルのトランスポゾーンを40マイクロリットルの細胞に加えます。

次に、細胞トランスポゾーン混合物を氷冷エレクトロポレーション獣医に入れ、混合物をQ Vetの底に軽くたたいて、細胞を25マイクロph、200オーム、および2.5キロボルトで衝撃します。ピペッティングで上下に混合した960マイクロリットルのフィルター滅菌SOC培地をすぐに追加してから、細胞を滅菌済みの1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。細胞を摂氏30度、120RPMで45〜60分間インキュベー

次に、LB缶寒天プレートに100マイクロリットルの細胞を広げてから、プレートを摂氏30度で一晩インキュベートしてグリッドトランスフォーマントにします。空の100 x 15ミリメートルのシャーレの蓋にグリッドをテープで貼り付けます。LB缶寒天プレートの底に線を引き、小さなテープを使用してグリッドの蓋に固定し、グリッドがオーガーを通して見えるようにします滅菌つまようじを使用します。

単一のトランスフォーマントを選択してグリッド内の正方形の中央にスポットし、隣接する正方形に別のトランスフォーマントを配置して、プレートがいっぱいになるまで続けます。その後、摂氏30度で一晩インキュベートします。これは、グリッド化された各プレートのマスタープレートです。

1から3までの番号が付けられた3つの新しいオーガープレートを積み重ねます。LB缶のナンバー1、Mナイン缶のナンバー2。そしてLBの3番は、プレートを逆さまにして摂氏37度で一晩乾燥させてから使用することができます。

前に示したように各プレートの上部に線を引いた後、70%エタノールを使用してレプリカメッキツールを拭き取り、その上に滅菌ベルチン正方形を置いてから、ベルチン正方形をクランプします。次に、マスタープレート上の線をクランプに引いた線に合わせ、ベルトの正方形の上にプレートを置きます。穏やかな圧力を加えて、プレートからベルティンの正方形にバクテリアを移します。

次に、プレート番号1に引かれた線をクランプの線に合わせ、ベルティンの正方形の上に置きます。穏やかな圧力を加えて、バクテリアをベルティンの正方形からプレートに移します。プレート番号1を取り外します。

ベルベットのティーンスクエアを水のビーカーに捨て、レプリカメッキツールにきれいな滅菌ベルベットの正方形を置きます。前と同じように、プレート番号1のラインをクランプのラインに合わせ、新しいベルベットの正方形の上に置きます。穏やかな圧力を加えて、バクテリアをプレート番号1からベルベットの正方形に移します。

プレート番号1を取り外し、プレート番号2に引かれた線をクランプに線を合わせ、ベルベットの正方形の上に置きます。穏やかな圧力を加えて、ベルベットのティーンスクエアからプレート2にバクテリアを移し、プレート3のプロセスを繰り返した後にプレート2を取り除き、プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。両方のLB缶プレートで成長するが、Mナインプレートで成長しないコロニーはトローブと見なされます。

プレート番号1からTROを選択し、新しいLB缶プレートに縞模様を付けます。一晩インキュベートした後、ストリークプレートから3つのコロニーを選択し、翌日それらを新しいLB缶プレートにストリークアウトします。新しく縞模様のプレートからLB缶のグリッドプレートにコロニーを見つけ、このプレートを使用して、先ほど示したようにレプリカメッキを繰り返します。

遺伝子レスキューを実施します。単離された変異コロニーを使用して、3ミリリットルのポンドを成長させます。摂氏30度で一晩培養できます。

次に、市販のゲノムDNA精製キットを使用して、0.025単位のBFUC1制限エンドヌクレアーゼで培養した1ミリリットルから、氷上での20マイクロリットルの反応でゲノムDNA1マイクロリットルあたり1マイクログラムの14マイクロリットルにDNAを精製します。次に、反応を摂氏37度で25分間インキュベートしてから、摂氏80度に20分間移します。酵素を不活性化するには、0.8%AROSゲル上で部分的に消化されたDNAの3マイクロリットルを分析します。

次に、500マイクロリットルの反応で15マイクロリットルの部分消化されたゲノムDNAに800ユニットのT four DNAリガーゼを加え、翌日に摂氏4度で反応を一晩インキュベートします。50マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムpH5.5と1ミリリットルの95%エタノールを添加してライゲーションDNAを沈殿させ、摂氏マイナス20度で20分間インキュベートします。DNAを摂氏4度と13,500Gで10分間マイクロフュージします。

スーパーナット会場、7つの70%エタノールを注ぎ出してペレットを洗浄します。遠心真空濃縮器で乾燥させ、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を使用します。DNAを再懸濁するには 再懸濁したDNAの4マイクロリットルを使用して、エレクトロポレーションeコリ株、ECD 100 DPIRまたはECD 100 DPIR 1 16を5ミリリットルのLBに接種し、1つのコロニーで培

摂氏37度、120RPMで一晩成長させます。全培養物からDNAを精製した翌日、Joe oneを使用してプラスミドの14マイクロリットルを消化します。10 μリットルの未消化プラスミドと消化プラスミドを 0.8% アガロゲルで分析します。

プラスミドの配列決定後、配列5プライムGA、G-A-C-A-G 3プライム、これは転位の最後の7塩基対であり、中断された遺伝子の配列が続きます。blastを使用して、中断された遺伝子の可能な機能を決定します。エレクトロポレーションが成功すると、数千の形質転換体が得られ、それぞれがこの図のインサートに少なくとも1つの転置を持っています。

黒い四角は、LB缶プレートに成長した2つのコロニーを示していますが、Mナインミニマルミディアムプレートには成長していません。これらのTROには、アミノ酸、核酸、またはビタミンの合成に関与する遺伝子の中断が含まれていた可能性があり、これらはすべてlbには見られますが、Mnine、最小培地には見られません。他の86のコロニーでは、M nineでの成長に必要な遺伝子が中断されていませんでした。

ここで見られるように、単離されたTROから部分的に消化されたゲノムDNAは、サイズが10キロベース以上から0.5キロベース未満まで実行されます。レスキューされたプラスミドは、2キロベースのトランスポゾンと隣接する宿主DNAで構成されています。この図は、troから単離されたプラスミドのブラスト結果を示しています。

中断された配列は、Lチロシン、Lフェニルアラニン、およびLトリプトファンの生合成に関与するアテムターゼのエンテロバクタークロイ遺伝子に類似しており、これは複数の一晩中の成長ステップによる。この手法は、適切に実行すれば10日または11日で完了できます。レプリカプラである間、プレートを汚さないように覚えておくことが重要であり、乾いたプレートを使用し、プレートをベルトの正方形に置いた後はプレートを動かさないことでそれを防ぐことができます。

この手順に続いて、クローニングや相補実験などの他の方法を実行して、同定された遺伝子の機能を確認できます。このビデオを見れば、トランスポゾン突然変異導入を使用してTROを生成する方法と、変異した遺伝子を暫定的に特定する方法について十分に理解できるはずです。