タンパク質機能に2DE - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

次の実験の全体的な目標は、組み合わせたプロテオミクスアプローチを使用して、ヒト疾患の潜在的な予後マーカーおよび/または治療標的を特定することです。これは、患者の末梢血から初代白血病細胞を単離し、予後が良好または不良であることを運び、第2ステップとしてプロテオミクス分析に使用するCD 19およびCD 5表面マーカーの両方を発現させることによって達成されます。白血病細胞ライセートは、2次元電気泳動または2次元電気泳動によって分離され、プロテオミクスマップの比較により、予後が良好な患者と悪い患者の間で異なる発現を示すスポットを同定することができ、その後、質量分析またはMSによって同定することができます。

次に、疾患の自然史における同定されたタンパク質の役割を検証および分析するために、さまざまなアッセイを使用することができます。結果は、2つのde gelsによって検出されたHSの異なるリン酸化状態が、患者の臨床転帰と相関していることを示しています。この技術の意味は、慢性リンパ性白血病の治療にまで及びます。なぜなら、それは予後マーカーとして利用することができる疾患の進行に関与するタンパク質を特定するのに役立つからです。

パメラは研究室の技術者と外部の研究室のポスドクに駆け込みました この手順を開始する前に、ヘパリンナトリウムを含むバキュテナー採血チューブで末梢血を採取してください。血液を15ミリリットルのチューブに移し、全血1ミリリットルあたり50マイクロリットルのヒトB細胞濃縮カクテルを追加します。その後、よく混ぜ合わせ、室温で20分間インキュベートします。

インキュベーション後、サンプルを等量のPBSと2%FBSミックスで希釈し、フライコールに血液を優しく慎重に重ねて、界面を壊さないようにします。サンプルをGの400倍で室温で20分間、休憩なしで遠心分離します。終了したら、界面を慎重に吸引して細胞を回収し、新しいチューブに入れます。

遠心分離と上清の除去後、細胞をPBSで一度洗浄します。レザス。希釈後、チューブを手動で前後にフリックして、残りの上清にペレットを懸濁します。完全なRPMI培地を使用して、トライアンブルー排除法を使用して細胞をカウントします。

次に、ファックスチューブ内の精製細胞懸濁液100マイクロリットルに以下の抗体を添加します。暗所でサンプルを摂氏4度で20分間インキュベートします。サンプルを4ミリリットルのPBSで洗浄した後、フローサイトメトリーで純度を確認します。

慢性リンパ性白血病またはCLL細胞の割合を確認します。Coexは、その表面にCD19とCD5を発現します。プロット内のCD three、CD 14、およびCD 1656の割合をチェックして、調製物にNK tリンパ球および単球が実質的に存在しないことを確認します。この時点ではゼロに近いはずです。CLL細胞ペレットを最終容量380μLの2次元電気泳動バッファーで可溶化します。

1 ミリグラムのタンパク質サンプルを 18 枚の IPG ストリップに適用して、アイソ エレクトロフォーカシングを行います。分析後、ストリップを 2 ミリリットルの平衡緩衝液で平衡化し、室温で 15 分間 2% の新鮮な DTT を添加します。溶液を廃棄した後、2.5%Iotoアセトアミドを添加した2ミリリットルの平衡緩衝液を加えます。

次に、ロッキングプラットフォーム上でサンプルを室温で15分間インキュベートします。その後、ゲルに触れずに紙の上でストリップを乾燥させ、余分な溶液を取り除きます。乾いたら、各ストリップを9〜16%のグラジエントSDSページゲルの上にロードします。

ゲルの上に少量のSDS電気泳動バッファーを添加して、ストリップのローディングを容易にします。次に、ストリップの浮きを防ぐため、0.8%寒天溶液を約5ミリリットル加えてゲルを密封します。電気泳動ユニットを組み立てたら、SDS電気泳動バッファーを充填します。

次に、ゲルあたり60ミリアンペアで4時間、摂氏4度、または冷却システムを使用して分析します。電気泳動ユニットからゲルを取り出した後、適切な染色ボックスに入れます。各溶液を約200ミリリットル調製します。

ゲルが入った染色ボックスに各溶液を慎重に加えます。ロッキングプラットフォーム上ですべてのインキュベーションを行います。染色後、停止溶液を取り出し、ゲルを1%酢酸溶液に取り込むまで放置します。

遊走アッセイでは、以前に精製した細胞を懸濁します。完全なRPMIでは、特定の刺激の有無にかかわらず、600マイクロリットルの完全なRPMIを追加することにより、下部トランズウェルチャンバーを準備します。誘発された移動と自発的な移動をそれぞれ測定するには、上部チャンバーを上に置き、インキュベーター内で摂氏37度でシステムを30分間平衡化させます。

終了したら、上部チャンバーの200マイクロリットルあたり6個の細胞に10個を播種し、インキュベーター内でプレートを摂氏37度で4時間インキュベートします。インキュベーション後、上部チャンバーを取り外し、下部チャンバーに培地を回収します。次に、下部チャンバーを1ミリリットルのPBSで1回洗います。

PBSをチューブに集めた後、上清を除去した後、サンプルを300倍のGで5分間遠心分離します。サンプルを500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。取得から1分後に移行した細胞の数をカウントします。

セルの横ばらつきと、計算に使用する数である1分間に視覚化されるイベントの数を考慮して、2次元ドットプロットのセル数を確認します。CLL患者から単離された初代白血病細胞サンプルを、各患者の臨床的特徴に基づいて2つの主要なサブセットにグループ化し、特定の質量許容範囲内の2つのDEおよびMS質量で分析しました。データベース内のペプチド配列に割り当てられ、その後、特定の確率スコアを通過すると同定されたと見なされるタンパク質に組み立てられました。

この解析により、これらのタンパク質の中から主に細胞骨格活性や代謝過程に関与するタンパク質が同定されました。造血系譜、細胞特異的タンパク質またはhs。疾患の臨床経過と強く関連する差次的リン酸化が差次的に発現されたもの。

特に、1つのスポットを持つ患者は臨床転帰が悪い一方で、2つのスポットを持つ患者の予後は良好です。HS Oneを1つのスポットとして持つCLL細胞は、低リン酸化HSと比較して、遊走、接着、およびアクチン重合の点で細胞骨格活性が損なわれていることがわかりました。1つ、2つのスポットサンプル。したがって、異なる臨床行動を説明します。

このビデオを見れば、プロテオミクスを使用して、予後マーカーや治療標的として使用できる疾患の進行に関与する生物学的候補を特定する方法について十分に理解できるはずです。