Name: 時空のCaを測定する 2 +シグナル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ アラビドプシスにおけるカルシウムシグナルの時空間モニタリング法。遺伝子組み換えカルシウムインジケーターを用いて、非生物ストレス下での細胞レベルと全植物レベルの応答を可視化する技術です。

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技術支援を提供してくださったB.スティーブンソンと、イクオリントランスジェニックラインを提供してくださったマーク・R・ナイト博士に感謝いたします。この研究は、国立衛生研究所の助成金R01 GM059138によって資金提供されました。

FASシステムを用いた1イクオリンベースのCA 2 +イメージング<ol><li>発光イメージングのための苗木を準備します。 0.01％のTriton-100を含有する10％漂白溶液でエクオリンを発現するArabidopsis植物の種子を滅菌する。フル強度MS（ムラシゲ·スクーグ基礎塩混合物）、1％スクロース、1.2％寒天を含む角板（グリッド10×10cmの正方形のペトリ皿）上で無菌種をまく。 2日間（ 図1A）、4℃で層別化した後、成長チャンバー内に垂直に配置し、プレート。 </li><li>フィルム上に苗を移します。プレート上で生育7-10日齢の苗の上に接着フィルム（ 図1B）を配置します。ゆっくりと苗はフィルム（ 図1C）に準拠していることを確実にするために手でフィルムを押してください。苗がフィルムに付着したままになるように静かにフィルムをはがします（ 図1Dおよび1E） </li><li>補因子と苗をインキュベートします。 Aを配置水の中に2μg/ mlののH-CTZ（セレンテラジン）の15ミリリットルを含む正方形のプレート上dhered苗（10×10センチ）。一晩に4時間（ 図1F）を、室温で苗をインキュベートする。 </li><li>発光イメージングのための準備をします。 H-CTZ溶液からフィルムを取り出し、中央を、それを切り倒し、二枚を形成する。二つの異なるプレートで表向きに苗木を有するフィルムの各部分を配置します。 5分間、暗所でプレートにしておきます。 </li><li>発光画像を取得する。闇の中で、発光イメージングシステム（ 図1G）のステージ上に、互いの横に二つのプレートを配置。すぐに同時にプレートに刺激を溶液20mlを加える際に画像を取得する。 </li><li>発光画像を分析します。すべての発光画像に対して同じ表示範囲を選択します。関心領域（ROI）をクロップし、JPEGファイル（ 図2A）のような画像を生成する。別の方法として、SPE形式のファイルとして画像をエクスポートしにインポートImageJの画像解析ソフトウェア。 ROIの平均グレー値を計算するための測定値を設定します。 ROI領域の同じサイズを選択して、棒グラフ（ 図2B）、平均グレーと現在のデータを測定します。 </li></ol> 2生細胞共焦点のCa 2 +イメージング<ol><li>共焦点イメージングのための苗木を準備します。トリトン0.01％を含む10％の漂白剤溶液でCASE12を表現するシロイヌナズナ植物の種子を滅菌する。フル強度MS塩、1％スクロース、および1.2％寒天を含むプレート上で無菌種をまく。 2日間で4℃で層別化した後、成長チャンバー内に垂直に配置し、プレート。 </li><li>セットアップイメージングチェンバース<ol><li>スライドとカバーガラス（商工A）を用いたイメージングチャンバーを組み立てます。スライドの真ん中に水に浸した脱脂綿の作品を配置します。その後、水に浸した脱脂綿の上部にプレートから1つまたは2つの5日齢の苗を移す。カバースリップの各コーナーへの粘土の小片、スティックカバーガラスとスライドとの間のギャップ（室）（ 図3A、左パネル）を作成する苗の上のd位のカバースリップ。 1mlシリンジにポリエチレンチューブ（0.58ミリメートル直径）の一端を接続し、チャンバーに直接隣接するチューブのもう一方の端を置きます。テープ（ 図3A、右パネル）で所定の位置にチューブを保持します。 </li><li>プレキシガラス室（B室）を使用して画像化チャンバを組み立てます。 <ol><li>プレキシガラス室のそれぞれの側のチャネルにコーティングされた管を2ポリエチレン管（0.58ミリメートル径）の周りにシリコーングリースの薄層を広げ、押した（ 図3（b）は、左パネル）。チューブの溝が含まれているチャンバーの表面にシリコーングリースの薄層を広げ、チャンバ開口部（切り出す）の一方の側を密封するグリースにカバースリップを押してください。 </li><li>チャンバー内にプレートから5日齢の苗を移し、トップO上の水に浸した脱脂綿の一部を置く苗F。チャンバーの他方の面にシリコーングリースを広げ、かつシールするために上に別のカバースリップを押してください。 1ミリリットルの注射器にチューブの一方の端を接続します。他の管開放（ 図3B右パネル）の終わりにしておきます。 </li></ol></li><li>チャンバーカバーガラス（商工C）を用いた撮像室を準備します。 70％エタノールでチャンバーカバーガラスを殺菌し、乾燥するまでボンネットの上に残す。それぞれ、2ウェルチャンバーまたは8ウェルチャンバー（ 図3C右パネル）の各ウェルに1％スクロースおよび0.5％phytagelを含む完全な強MS培地の0.6ミリリットルまたは0.2ミリリットルを追加します。種子を殺菌し、透明なゲルの薄層を含むチャンバーカバーガラスに直接種をまく、それらを5日間（ 図3C）のために垂直方向に成長してみましょう。 </li></ol></li><li>共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。寒さや過酸化物などの塩などのストレス刺激を、適用するには、ゆっくりと150のNaCl、約200μlの、アイスコルを注入直前にそれぞれ、画像を取得するか、静かに2または8ウェルチャンバーのウェルに刺激溶液500μlまたは100μlのを追加し、チャンバ（チャンバAまたはB）へのd水または1mMのH 2 O 2溶液。直ちに20X浸水レンズ（開口数0.75）を用いて反転ニコンA1R共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて刺激剤溶液を塗布した後に画像を取り込む。それぞれ550nmで、および512×512ピクセルの解像度で - 488 nmおよび500の励起波長および発光波長を持つ4秒間隔で画像の時系列を収集します。 </li><li>画像解析 ニコンの要素を使用して、ROIが対象とする各セル（又は面積）の周りに描かれた。各ROI内の総強度は、時間測定ダイアログボックス（ImageJの代わりに使用することができる）を用いて経時的に測定した。全強度測定は、データグラフでエクスポート処理した。のCa 2 +スパイク振幅は番目としてピーク強度マイナス休止強度、持続時間として定義した2スパイクの隣接するスパイクピーク間の時間間隔として開始およびスパイクの終了、及び期間の間の電子の時間が-test手段を比較するために使用したトン 。 </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
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<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

私たちは、シロイヌナズナの苗の時空間のCa 2 +応答を記録するためのFASシステムを実証している。このFASのCa 2 +記録方式がここに提示されている非生物的ストレス刺激に加えて、さまざまな刺激によって誘発のCa 2 +動態を測定するために適合させることができる、単純な感度かつロバストな手法を提供する。このシステムを用いて、簡単に植物全体レベルでの組織または刺激特異的な時空間のCa 2 +動態を比較することができます。 FASの高い感度は、高強度のストレスが使用される場合、細胞に物理的な損傷によって引き起こされるアーティファクトを回避するために重要でのCa 2 +応答を検査するための低強度の刺激を使用することができる。異なる生理学的段階で苗が与えられた刺激に応じて異なる感度と特異性を持っているかもしれないが7〜10日齢のシロイヌナズナの苗は、組織または刺激特異的のCa 2 +応答を示した。したがって、ある約100苗がフィルムの一枚の上に付着させることができたFAS測定のスループットを向上させるために7-...

植物細胞は、細胞の行動を調整するシグナリングを介して環境に応答する。環境刺激に応答してイベントをシグナリング初期の細胞は一過性のCa 2 +の増加である。遊離Ca 2 +濃度のパターン、または一過性の上昇の署名は、その振幅、周波数、および期間によって特徴付けられる。個別時空間のCa 2 +署名は異なる細胞活性1を調節する。例えば、熱、寒さ、塩、干ばつ、光、植物ホルモンなどの具体的な刺激は、微調整も膜局在のCa 2 +チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの時空間的アクティビティを、特定のCa 2 +の署名を得た。のCa 2 +輸送体が十分に特徴付けされているが、ほとんどの植物1におけるCa 2 +チャネルの分子アイデンティティおよび機能についてはほとんど知られていない。ストレス刺激するために、変化したのCa 2 +応答を持つ変異体についての遺伝子スクリーニングが効果的APPRかもしれのCa 2 +の署名を構成するコンポーネントを識別するためのoach。最近、いくつかのイクオリンベースのCa 2 +検出システムは、病原体の攻撃および非生物的ストレス2-4に反応してCaのための遺伝子スクリーニング2 +シグナル伝達成分を容易に開発されている。 イクオリンは、まず1990年代初期5植物におけるCa 2 +シグナルを検出した。それ以来、イクオリンは、特定のCa 2セルを監視するためにそのような細胞質5、核6などの異なる細胞区画に、葉緑体7、8、ミトコンドリア9、および間質10液胞膜と同様に、ルート内の異なる細胞型に標的化されています+シグナル11。エクオリンベースのCa 2 +測定は、ストレス刺激する細胞の集団の空間的および時間的のCa 2 +応答を明らかにする。しかし、ほとんどの場合、単一の細胞のCa 2 +応答はunsynchroniある応答組織4にゼット。そのため、イクオリンのCa 2 +記録は、必ずしも個別のセル内のCa 2 +シグナルを報告しません。近年では、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質（FP）は、黄色カメレオンなどのCa 2 +指標（YCS）12をベースとCASEs12 13は、Caを研究するために使用されている2 +高細胞下解像度とシグナリング。 YCSある蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、CFPを含む、カルシウム2 +指標をベースとYFPのCa 2 +の結合タンパク質のカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドM13によって連結された変異体。それは、Ca 2 +に結合するようにカルモジュリン、それによって増加したエネルギー移動（FRET強化）で、その結果、より緊密CFPとYFPをもたらし、コンホメーション変化を受ける。 CFPシグナル強度に対するYFPの比として概算時間をかけてFRETレベルは、細胞内Ca 2 +動態を反映している。いくつかのYCバージョンが植物において使用されている。 YC3.6 tはあった細胞質ゾル14,15、核16、ミトコンドリア17、および原形質膜18、およびYC4.6とD4ERにargetedは、ER 15,19をターゲットとし、D3cpvはペルオキシソーム20を対象とした。 YCSを発現するトランスジェニック植物は、異なる細胞型の異なる細胞区画内のCa 2 +動態の生細胞イメージングを可能にする。ケース（おそらくカルシウム lcium SE nsor）がカルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドM13を保有する単一の円順列蛍光タンパク質（cpFPs）です。のCa 2 +に結合すると、ケースは、蛍光強度の増加をもたらす、コンフォメーション変化を受ける。 CASEの蛍光応答およびCa 2 +濃度との相関は、細胞内Ca 2 +動態を定量的に測定することができる。 CASE12変異体は、12倍のCa 2 + -飽和形で蛍光が増加している。N. benthiminanaプラント過渡的にはexprディエッサーCASE12または安定的にケース12を発現しているシロイヌナズナ植物が防御と非生物的ストレス4,21中のCa 2 +シグナル伝達を研究するために使用された。病原体の攻撃に、または乾燥ストレスに応答する細胞内のCa 2 +の非同期空間的および時間的な振動がCASE12ベースのCa 2 +イメージングで明らかにされている。 ここでは、シロイヌナズナの苗において、組織との刺激特定のCA 2 +動態のエクオリンに基づく発光イメージングのための詳細な手順を提示、およびFASのケース12発光イメージングを表現シロイヌナズナの根の細胞内の細胞質ゾルおよび核のCa 2 +動態の共焦点イメージングのためのストレス誘発性のCaここでは記載していない無傷の植物又は組織における2 +動態を分析するために適合させることができる、またはCa 2 +シグナルを誘導し、変更された応力を有する変異体のための突然変異誘発シロイヌナズナ植物集団をスクリーニングする。生細胞のCa 2 +イメージングセットアップは、Caを分析するために適合させることができる他のCa 2 +指標を使用して、異なるsubcelluarコンパートメント内または異なる細胞型において2 +動態。

<table><tbody><tr><td>10 cm x 10 cm正方形のペトリ皿</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr>接着<tr><td>フィルム</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr>ポリエチレン<tr><td>チューブPerkinElmer</td><td></td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr>シリコーン<tr><td>グリース</td><td>ベックマン335148</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2ウェルチャンバーカバーガラス&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルチャンバーカバーガラス</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Luminescence イメージングシステム</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>ニコン A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>イメージングソフト</td><td>ニコンインスツルメンツ株式会社</td><td>N/A</td><td>ニコンエレメント&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 最新バージョン</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td> <td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>万能漂白剤</td><td>任意のローカル ストア</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>フィッシャー</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS 塩</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td></td><td>ΣA1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>フィタゲル</td><td>ΣP8169-1KG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

時空のcaを測定する 2 +シグナル

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

発生および環境信号は、植物細胞内のCa 2 +の変動を誘発する。刺激固有の空間-時間のCa 2 +のCa 2 +のパターンは、シグナル伝達カスケードを開始し、携帯のCa 2 +結合タンパク質によって感知される。しかし、私たちはまだ、特定のCa 2 +シグナルが生成される刺激方法について少し知っている。のCa 2 +シグナルの特異性は、与えられた刺激に応答してのCa 2 +チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの活性の洗練されたレギュレーションに起因し得る。これらの細胞成分を同定し、その機能を理解するには、組織や細胞レベルの両方でのCa 2 +シグナルの高感度かつ堅牢な記録を可能にするシステムを使用することが重要です。異なる細胞区画を標的とする遺伝的にコードされたのCa 2 +指標は、携帯のCa 2 +シグナルの生細胞の共焦点イメージングのためのプラットフォームを提供してきた。ここでは、命令を記述する2のCa 2 +の検出システムを使用するためのsが：FAS（フィルム接着剤の苗）の発光のCa 2 +イメージングおよびCASE12ベースの生細胞共焦点蛍光カルシウム2 +イメージングベースのエクオリン。 CASE12を用いて生細胞の共焦点イメージングは、高解像度でのサイトゾルおよび核のCa 2 +シグナルの同時検出を提供しながら、FASシステムを用いた発光イメージングは、組織レベルでの空間的および時間的のCa 2 +シグナルの単純な堅牢かつ高感度な検出を提供する。

マンニトール、NaClおよびH 2 O 2は、それぞれ、脱水、塩および酸化ストレス刺激のためのプロキシとして使用した。重金属イオンのCu 2 +は、これら三つのストレス刺激のいずれかと相乗作用しているかどうかを確認するために、私たちは、Cu 2 +の存在下または非存在下でそれぞれの刺激に対するCa 2 +応答を比較した。 図2に示されるように、FASの発光イメージングはArabidoposis苗脱水、塩および酸化ストレスに対して異なって応答したことを明らかにした。 1 mMのH 2 O 2が誘導しながら、私たちはこの研究で調べた刺激の濃度について、75のNaClは、露出（ 図2A中央のパネルおよび図2B）の最初の40秒の間に葉と根で最強のCa 2 +応答を誘導した第一および第二40秒（ 図2A右パネル）の間に葉と根の両方で強いのC...

のCa 2 +シグナル伝達は、植物において、多様な生物学的プロセスを調節する。ここでは、遺伝的にコード化されたのCa 2 +指標エクオリンまたはCASE12を使用して、シロイヌナズナの細胞および組織内の空間的および時間的のCa 2 +シグナルを誘発した非生物的ストレスを監視するためのアプローチを提示します。

時空のCaを測定する 2 +シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

この手順の全体的な目的は、細胞レベルと植物全体レベルの両方でカルシウムシグナルを監視する方法を実証することです。これは、最初にMS寒天プレート上で、またはイメージングチャンバー内で直接苗を成長させることによって達成されます。2番目のステップは、苗を接着フィルムに移すか、イメージングチャンバーに保管することです。次に、カルシウムシグナルを誘導するために苗に適用される刺激。最終的に、ライフスタイルルミネッセンスまたは蛍光イメージングを使用して、さまざまな刺激に対する全苗または細胞質の核カルシウム応答をそれぞれ示します。この技術の主な利点は、例えば、単一の植物が発生するような既存の方法よりも、フィルム接着苗アッセイがシンプルで、感度が高く、堅牢であることです。したがって、この手法は、カルシウムシグナル応答が変化した変異体のハイスループットスクリーニングに適合させることができます。また、フラットベースのカルシウムイメージングと比較して、GFPベースの遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを使用することで、複雑な顕微鏡の設定や計算を回避できます。この方法は、シロイヌナズナのストレス応答中のカルシウムシグナル伝達に関する洞察を提供しますが、他の植物モデルの開発や防御など、他の状況でも使用できます。この方法のデモンストレーションは光沢があります。私たちの研究室の学生この手順を開始するには、0.01%トリトン100を含む10%漂白剤溶液でクウェインを発現するウサギオプシス植物の種子を滅菌し、全強度のMS 1%スクロースと1.2%寒天を含む正方形のプレートに種子を蒔きます。次に、プレートを4°Cの成層後、2日間成長チャンバーに垂直に置きます。その後、苗をフィルムに移します。プレート上に成長している生後7〜10日の苗の上に粘着フィルムを置きます。フィルムを手でそっと押して、苗がフィルムに付着していることを確認します。次に、苗がフィルムに付着したままになるように、フィルムをそっと剥がします。次に、水中のHCTZあたり2マイクログラムの15ミリリットルを含む正方形のプレートにA付着苗を置くことにより、補因子と苗をインキュベートします。苗を室温で4時間から一晩インキュベートします。発光イメージングの準備として、フィルムをHCTZ溶液から取り出し、中央で切り取って2つのピースを形成します。苗を上に向けて2枚のフィルムを2つの異なるプレートに置きます。次に、プレートを暗所に5分間置いて、暗闇で発光画像を取得します。2枚のプレートをルミネセンスイメージングシステムのステージに並べて置きます。20ミリリットルの刺激溶液をプレートに同時に加えるとすぐに画像を取得します。発光画像を解析するには、すべての発光画像に同じ表示範囲を選択し、ROIをトリミングして、画像をjpegファイルとして生成します。または、画像をSPE形式のファイルとしてエクスポートし、画像J画像解析ソフトウェアにインポートします。ROIの平均グレー値を計算するための測定値を設定し、同じサイズのROI領域を選択します。次に、平均グレー値を測定し、データを棒グラフとして表示します。共焦点イメージング用の苗を準備します。症例12を発現するオプシス植物の種子を、0.01%トリトンを含む10%漂白剤溶液で滅菌します。したがって、全強度のMS塩、1%スクロース、1.2%寒天を含むプレート上の滅菌種子。次に、プレートを成長チャンバーに垂直に置き、摂氏4度で2日間成層します。その間に、スライドとカバースリップを備えたイメージングチャンバーを組み立てます。滑り台の上部に水に浸した脱脂綿を置きます。次に、プレートから1つまたは2つの5日前の苗をスライドの中央に移します。次に、カバースリップの各角に粘土の小片を貼り付け、カバースリップを苗の上に置き、カバースリップとスライドの間に隙間を作ります。その後、ポリエチレンチューブの一方の端を1ミリリットルのシリンジに接続し、チューブのもう一方の端をチャンバーのすぐ隣に置きます。チューブをテープで固定して、プレキシガラスチャンバー付きのイメージングチャンバーを組み立てます。シリコングリースの薄い層を2本のポリエチレンチューブの周りに広げ、コーティングされたチューブをプレキシガラスチャンバーの両側のチャネルに押し込みます。次に、チューブの溝を含むチャンバーの表面にシリコングリースの薄い層を広げ、グリースにカバースリップを置いてチャンバー開口部の片側をシールします。次に、プレートから5日前の苗をチャンバーに移し、水に浸した脱脂綿を苗の上に置きます。シリコングリースをチャンバーのもう一方の表面に広げ、上部の別のカバースリップを押してシールします。その後、チューブの一方の端を1ミリリットルのシリンジに接続し、もう一方のチューブの端を開いたままにします。チャンバー付きカバーガラスを備えたイメージングチャンバーを調製するには、まずチャンバー付きカバーガラスを70%エタノールで滅菌し、0.6ミリリットルまたは0.2ミリリットルの全強度MSで乾燥するまでフード内に置いておきます。1%のスクロースおよび0.5%の戦闘機ゲルをそれぞれ2つの井戸の部屋または8つの井戸の部屋の各井戸に含んだ媒体。次に、種子を滅菌し、透明なゲルの薄い層を含むチャンバー付きのカバーガラスに直接播種し、5日間垂直に成長させます。画像取得用。共焦点顕微鏡を使用して、画像を取得する直前に、200マイクロリットルの150ミリモル塩化ナトリウム、氷冷水、または1ミリモルの過酸化水素溶液をチャンバーにゆっくりと注入することにより、ストレス刺激を適用します。刺激溶液を適用した直後に画像をキャプチャします。倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡と20 x 水浸レンズを使用。励起波長4 88ナノメートルと発光波長が500〜550ナノメートルで、AIX解像度が5 12 x five 12の4秒間隔で画像を時系列で収集するか、ニコンの要素を使用して画像解析を行います。ROI は、対象の各セルの周囲に描画されます。各ROI内の合計強度は、時間測定ダイアログボックスを使用して経時的に測定されます。次に、総強度測定値がエクスポートされ、表示されているデータグラフで処理されます。これは、10日苗の空間時間的カルシウム応答の比較です。ここで異なるストレス刺激は、発光の時系列であり、400ミリモルのマンニトールと400ミリモルのオールと1ミリモルの塩化銅、75ミリモルの塩化ナトリウムと75ミリモルの塩化ナトリウム、さらに1ミリモルの塩化銅と1ミリモルの過酸化水素、または1ミリモルの過酸化水素と1ミリモルの過酸化水素と1ミリモルの塩化銅にさらされた苗の画像です。上段と下段のパネルは、それぞれ最初の40秒と後半の40秒間に取得した発光画像です。そして、これは、ここに示された細胞質および核カルシウム振動として示された、示されたストレス刺激に対する苗の平均発光強度の棒グラフです。塩ストレスに応答して、共焦点画像は、ケース12が、ケース12を発現するトランスジェニック植物の根細胞および葉細胞の細胞質および核に発現することを示している。この画像は、葉緑体の赤、自家蛍光、およびケース12の緑の蛍光の画像です。これらの2つのプロットは、根細胞の核であるサイトゾルで塩ストレスが誘発するカルシウム振動を示しています。この手順を試みるときは、よく育った苗木を使用することを忘れないでください。このビデオを見れば、細胞レベルとプラント全体レベルでダイナを監視する方法について十分に理解できるはずです。

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生物学

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回路基板と生体膜のモデル化と軸索の電気信号の測定：学生研究室の演習を

学ぶ アラビドプシスにおけるカルシウムシグナルの時空間モニタリング法。遺伝子組み換えカルシウムインジケーターを用いて、非生物ストレス下での細胞レベルと全植物レベルの応答を可視化する技術です。

時空のCaを測定する^{2 +}シグナル

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