Name: トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶアポトーシス逆転現象アナスタシスの検出法。ライブセル顕微鏡とバイオセンサーを用いて哺乳類細胞の形態変化と分子イベントを追跡し、細胞死と生存のメカニズム解明に貢献します。

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当社は、単語 &quot;アナスタシス」アポトーシスの逆転を記述するための示唆のために牧師先生ラルフBohlmannと牧師先生ジェームスVoelzに感謝、安定してシトクロム c -GFPを表現するHeLa細胞についてダグラス·R·グリーン; H446細胞用のチャールズM.ルーディンとエリックE.ガードナー。ビデオでの漫画の図面をアシストするためにヘザーラム。この原稿の貴重な議論のためのイーホイヨ。この作品はサー·エドワード·ユード記念フェローシップ（HLT）、博士ウォルターSzeto記念奨学（HLT）、フルブライト助成金007から2009（HLT）、ライフサイエンス研究財団フェローシップ（HLT）によってサポートされていました、NIHはNS037402（JMH）付与とNS083373（JMH）、および香港大学補助金委員会のAoE / B-07/99（MCF）。ホーラム唐は、生命科学研究財団のShurlとケイクルチ財団フェローである。

著者らは開示するものは何もない。

アナスタシスは、細胞死経路を活性化した細胞がその後死んでプロセスを逆にして生き残る現象を指す。ここでは、ライブセルイメージングが実際に同一の個々の細胞は後期アポトーシス細胞死のプロセスを逆にし、次いで生存及び再生し続けることができることを確認するために使用され得ることを実証した。我々のプロトコルは、アポトーシスを誘導し、細胞の大部分は、検証のために、いくつかのバイオマーカーを用いてモニターアポトーシスの反転を受けることができるように、いくつかの最適化された細胞型特異的な処理条件を記述する。技術的な問題については、ガラスボトムディッシュを理由高倍率で高品質のコンフォーカルまたはエピ、蛍光顕微鏡用のロング作動距離を可能にの細胞と顕微鏡対物間の高透明な薄いガラス、の、イメージング12,13、培養の細胞に用いられた、ミトコンドリア断片化を含む古典アポトーシスの観察を容易に、 シトクロム c、及び核凝縮及び断片化のリリース。ガラスはまた、アポトーシスの間、膜小疱形成、細胞の細胞収縮、アポトーシス小体の形成のモニタリングのための高品質のDIC顕微鏡観察を可能にするために、光の極性を歪曲しない。 DICは、細胞...

アポトーシス（「死に立ち&quot;のギリシャ語）は、一般的に細胞自殺1-7で終わる一方向のプロセスであると仮定される。すでにアポトーシス経路8,9を開始した細胞を含むそれ以外の動物全体で死んでしまう余分な細胞の生存率のプロ死遺伝子結果の遺伝子破壊。同様に、遺伝子操作は、人工的に表示される信号を「私を食べる」、またはそれは、それらの細胞外マトリックスへの接着性を失い、健康、哺乳動物細胞は、細胞全体の食作用またはentosis、それぞれ10,11による死を免れることができます。しかし、その他の遺伝子操作することなく、正常な健康な哺乳動物細胞および細胞株は、アポトーシス12-15の初期段階から回復することができることを示している。細胞はその典型的な重要なチェックポイントに合格した後に個々の細胞を追跡するためのツールを使用して、我々はさらに、アポトーシス12,13の後期段階からの回復を実証しているLY 2-6「ノーリターンのポイント」をマークします。後期アポトーシスのこれらのチェックポイントは、ミトコンドリアのシトクロムc の放出、カスパーゼの活性化、核の断片化、およびアポトーシス体の形成が含まれる。我々は、細胞死2-6の瀬戸際でアポトーシスのこの逆転を記述するために、「生活に上昇」を意味し、ギリシャ語の複合語「アナスタシス」を採用した。 全体瀕死回復プロセスは、ライブセルイメージングによって観察されていない限り、それはアポトーシス事象を経験したことのない細胞からアナスタシスを受けた細胞を区別するために挑戦している。仕事の数十年は、アポトーシスによる細胞自殺の形態学的特徴は進化的に保存され、生化学的および分子事象16〜19によって駆動されることを明らかにした。これらのイベントは、損傷またはdを排除することにより、単細胞と多細胞生物の発達とhomoeostaticプロセスを調節するために細胞の自己破壊を促進するangerous細胞16-19。アポトーシス細胞は、容易に標準化された形態学的に、アポトーシス1,5,6,16,20の生化学的および分子症状によって区別することができるが、現在アナスタシス12,13に固有の既知のマーカーは存在しない。重要なことは、アナスタシスを受けた細胞は、正常な健康な細胞、およびだけアポトーシスを逆転開始細胞として表示され、アポトーシス死細胞12,13のように見える。このように、新しいツールが与えられた生存細胞は、以前にアクティブなアポトーシス過程を経験したことを確実に締結することが必要である。 それが迅速かつ大規模な破壊プロセスであるため、アポトーシスは、一般的に不可逆的なカスケードとして想定されます。ミトコンドリアは、細胞質ゾル21,22へのシトクロム cなどのアポトーシス誘発要因をリリースした後、いくつかの細胞は、アポトーシスを開始することが日に数分かかることがありますが、カスパーゼは、5分23,24内で活性化細胞質が続くことができるとその後すぐに10分25〜27、及び細胞死内の核凝縮25-27。活性化カスパーゼはそのようなエンドヌクレアーゼ阻害剤DFF45 / ICAD 29,30などの細胞解体2,28、の目的のために重要な構造と機能部品を切断し、不活性化することによりアポトーシスを調整する。カスパーゼはまた、 シトクロム c 31,32のミトコンドリアの放出を促進するために、ミトコンドリアに移行し、BCL-2ファミリーメンバーBID、などのプロアポトーシス因子を活性化する。カスパーゼ活性はまた、貪食33を介してマクロファージまたは隣接セルによる死細胞の貪食を促進するための「私を食べる」信号としてホスファチジルセリンの細胞表面露出をもたらす。さらに、アポトーシス事象は、細胞の生体エネルギーと代謝34,35,36を破壊し 、ミトコンドリアが機能不全にレンダリング。したがって、このような破壊からの回復は、直感的には考えにくい。 オリジナルとは逆に期待管理ポイント、細胞がさえ後期アポトーシス細胞死の過程を逆にすることができます。連続的に培養物中の死細胞の運命をモニターすることにより、我々は、初代細胞および細胞株12,13の範囲内の後期アポトーシスの可逆性を観察した。死刺激の除去は、このようなミトコンドリアの断片化、クロマチン凝縮、DNA損傷、原形質膜小疱形成、ホスファチジルセリンの細胞表面露出、ミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼ活性化、核の断片化、細胞収縮のようなアポトーシスの明白な特徴からの回復を可能にしたとアポトーシス体の形成。これらの観​​察は、アナスタシスの機能、結果、およびメカニズムに関する未回答の質問を上げる。これらの質問に対処するために、前提条件は、確実にアナスタシスを受けた細胞を同定することである。ここでは、以前に後期アポトーシスおよび第反転した細胞を検出するためのライブ顕微鏡法およびカスパーゼバイオセンサーを記載ENが生き残った。

<table><tbody><tr><td>LSM780共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養皿</td><td>MatTek株式会社</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>透明 CultFoi</td><td>カールツァイス</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 独立した媒体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>蛍光標識アネキシンV</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

アナスタシス（「生活に上昇する」ためのギリシャ語）は、死細胞の回復を指します。これらの細胞が回復する前に、それらはミトコンドリアの断片化、細胞質ゾルへのミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼの活性化、クロマチン凝縮、DNA損傷、核の断片化、原形質膜小疱形成、細胞収縮、細胞表面の曝露を含む、アポトーシスの重要なチェックポイントを通過したホスファチジルセリン、およびアポトーシス体の形成。アポトーシス刺激、それによって瀕死細胞がアポトーシスと潜在的に他の死のメカニズムを逆にすることができ、死の前に削除されたときアナスタシスが発生する可能性があります。したがって、アナスタシスも不適切に損傷した細胞を維持することができ、生理的治癒過程を含むようである。アナスタシスの機能とメカニズムは明らかに健康な細胞を回収した後、過去のイベントを検出するための限られたツールによって部分的に妨げられて、まだ不明である。 anastaを検出するための戦略SISはアナスタシスを変調するために生理学的メカニズムの研究、疾患の病状でアンデッドの細胞の危険性、および潜在的な治療が可能になります。ここでは、生細胞顕微鏡および哺乳動物細胞でアナスタシスを特定し、追跡するための哺乳類のカスパーゼバイオセンサーを使用して効果的な戦略について説明します。

アポトーシスの反転を研究するために、組織培養細胞は、最初にアポトーシスを誘発する死刺激にさらされている。細胞がアポトーシスの特徴を表示するとき、新鮮な培養培地は、次いで、刺激を洗い流し、その後回復した （ 図1A）を可能にするために死細胞を培養するために適用される。ここでは、アドレス指定されている重要な問題は、個々の死にかけ培養細胞がアポトーシスに向かって進行し、まだアナスタシスを受けることができるどの程度までである。この問題は、決定的に以下に記載する方法を用いて細胞の運命を追跡するためのバイオマーカーと連続モニタリングによって応答することができる。 まず、トラッキングのために必要とされるタイムラプス生細胞の顕微鏡検査を使用し、中、およびアポトーシス刺激12,13への曝露後、前の個々の細胞の応答を記録することによって、組織培養細胞におけるアポトーシスの反転を検出するための我々の戦略を説明する。それらに接続された基板上に広げ、健康な接着細胞（図1Bi）12,13、および糸状...

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

この手順の全体的な目標は、生細胞顕微鏡法によってアポトーシス細胞死プロセスと培養細胞の逆転を検出し、追跡することです。健康な細胞は基質上に広がり、核の周りに管状の糸状ミトコンドリアを含んでいます。しかし、細胞がアポトーシスによって自殺すると、死にかけている細胞はアポトーシスの逆転を検出して追跡するためのユニークな形態学的特徴を示します。細胞をガラス底の細胞培養皿に播種します。次のステップは、ミトコンドリアと核を標識するための生細胞染色を行うことです。これにより、健康な細胞とアポトーシス細胞の形態学的特徴を検出することができます。生細胞顕微鏡検査により、標識された健康な細胞を死の刺激にさらしてアポトーシスを誘導します。アポトーシスが検出されると、死にかけている細胞を洗浄し、次いで新鮮な細胞培養培地とインキュベートして細胞の回復を可能にし、生細胞イメージングを使用して、アポトーシスの逆転およびその結果(細胞の修復および生存など)をそれぞれ細胞の形態学的回復および移動によって示されるように、それぞれ追跡する。アポトーシスは、私たちの体内の望ましくない細胞や危険な細胞を排除するために不可欠な役割を果たすプログラム細胞死の一種です。これらの細胞合成プロセスは、一度開始すると細胞が確実に死滅するため、一般的に不可逆的であると想定されていますが、実際には、死にかけている細胞が細胞死プロセスを逆に開始し、その後生存して誘導できることを発見しました。それらには、細胞C、放出、ケースベースの活性化、核断片化、アポトーシス体形成など、ローリターンのポイントとなることを余儀なくされた重要なステップがあります。ギリシャの専門家に相談した後、私たちは「ステイシス」という言葉を採用しますが、これは生命に上昇することを意味します。アポトーシスやその他の細胞死プロセスを逆転させる現象を説明すると、アポトーシスを逆転させる細胞が正常な重い細胞のように見えるため、アンテシスを検出することは困難です。しかし、連続生細胞顕微鏡法により、細胞の大部分でアナスタシスが発生することを検出できます。このテクニックを習得することは、アンテシスの再現を研究することを可能にするため、重要です。私たちは、その蟻が組織の損傷を癒すかもしれないが、損傷細胞が生き残って癌を形成することを可能にするかもしれないと提案しました。したがって、麻酔を制御するメカニズムを特定することは、細胞死と生存を媒介することにより、癌、心不全、変性などの注射可能な疾患で治療するための新しいアプローチを提供する可能性がありますアナスタシスを検出し追跡する。アポトーシスイベント後、タイムラプス生細胞顕微鏡検査を実施して、一過性細胞死誘導後にどの細胞がアポトーシスを逆転させることができるかを追跡します。まず、ガラス底が薄い35mmの細胞培養皿に1ミ

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Biology

生物学

我々は、マウス胚とLysoTrackerと呼ばれる非常に水溶性染料を使用して差別化胚性幹（ES）細胞培養でプログラムされた細胞死（PCD）の領域を可視化するための単純なプロトコルを提示。...

胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。...

遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。...

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー...

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

ここでは、隣接する死細胞または死にかけている細胞との物理的相互作用によって生存細胞に誘発される細胞内シグナル伝達イベントを決定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、死細胞の食作用取り込みまたは可溶性メディエーターの放出とは対照的に、死細胞の受容体媒介認識によって誘発されるシグナル伝達イベントに焦点を当てています。...

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

住セルイメージ投射は、固定細胞イメージングだけで達成可能ではない単一セルまたは全体人口の豊富な情報を提供します。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング...

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

ここでは、蛍光活性化細胞ソーティングによってアポトーシス乳癌細胞を分離し、さらにフローサイトメトリーによるアポトーシス反転後乳癌幹細胞のような細胞非幹乳ガン細胞の転移を検出するためのプロトコルを提案する.

アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出

提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。...

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

細胞死の評価のための正確な方法が記載されている。プロトコルは、細胞株および動物モデルの広い範囲からの一次細胞は40％、偽陽性のイベントを表示する従来のアネキシンV...

細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンV /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ

学ぶアポトーシス逆転現象アナスタシスの検出法。ライブセル顕微鏡とバイオセンサーを用いて哺乳類細胞の形態変化と分子イベントを追跡し、細胞死と生存のメカニズム解明に貢献します。

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

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