キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

この手順の全体的な目標は、薬剤耐性変異を特定し、検証することです。これは、最初に標的がん遺伝子のランダムな突然変異ライブラリを作成することによって達成されます。第2のステップは、耐性クローンの出現についてin vitroスクリーニングを行うことです。

手順の3番目のステップは、耐性クローンの配列を決定して、耐性変異を特定することです。最後のステップは、部位特異的突然変異誘発を使用して突然変異を再現し、続いてin vitroおよびin vivoアッセイを行うことで、耐性変異を検証することです。最終的には、特定の薬剤標的ペアに対して臨床的に関連する薬剤耐性変異を同定することができます。

ENUやPCRベースの方法などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、バイアスがなく、PCRベースのMETAGENE ssisとは異なり、がん遺伝子のサイズや遺伝子のGC含量に制限されないことです。一般的に、この手法に不慣れな人は、分子生物学や細胞生物学の知識が不足しているため、苦労するでしょう。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

新生とスクリーニングのステップを学ぶのは難しいです。それは、多くの人がウイルス産生、細胞培養、半細胞培地の経験が不足しているためです。この手順は、プラスミドを持つ XL 1 赤 e 大腸菌細胞の形質転換から始まります JAK 2 V 617 f JAK 2 XL 1 赤 e 大腸菌細胞の発癌性アイソフォームは DNA 修復メカニズムに欠陥があるため、複製中にランダムな突然変異を組み込むことができます。

50〜100ナノグラムのプラスミドDNAと100マイクロリットルのコンピテントセルを、あらかじめ冷却したポリプロピレンチューブで混合します。100ナノグラムを超えるDNAは、形質転換効率を低下させるため、使用しないでください。氷上で30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに渦巻くことで、ライブラリのカバレッジを確保します。

コンピテントセルのチューブを4〜6本使用します。ポリプロピレンチューブを摂氏42度の水浴に浸して45秒間の熱ショックを与えた後、氷上で2分間インキュベートします。次に、各チューブに1ミリリットルのSOC培地を追加します。

チューブを摂氏37度でインキュベートし、225〜250 RPMで90分間振とうします。100 μg/ミリリットルのアンピシリンを含む4枚の10 cmLBオーガープレート上のプレートセル。プレートを摂氏37度で16〜24時間インキュベー

コロニーが見えたら、滅菌プレートスクレーパーでプレートをこすり落としてコロニーを収集します。各プレートから細胞をプールします。続いて、プラスミドDNAを市販のプラスミド抽出キットを用いて単離し、ライブラリー内の変異の不均一性を、トランスフェクションプレートの1日前に、10〜6番目のHEK 2 93 T細胞を10〜6番目のHEK 2 93 T細胞の100ミリメートル皿にシーケンシングすることにより評価します10%FCS、ペニシリン、ストレプトマイシン、および2ミリモルのL-グルタミンを含むDM EMの100ミリメートル皿に

翌日、100mm皿ごとにトランスフェクション試薬を調製します。無血清DM E EM培地を使用して、5マイクログラムのプラスミドライブラリー、5マイクログラムのレトロウイルスパッケージングプラスミド、および40マイクロリットルのFU遺伝子を合計400マイクロリットルに混合します。DNAと脂質の混合物を室温で20分間インキュベー

次に、HEK 2 93 T細胞の培地を新しい培地と交換し、DNA脂質複合体を細胞の上に滴下します。摂氏37度で6時間インキュベートします。6時間後、トランスフェクション培地を新しい培地と交換し、プレートをウイルス産生ごとに摂氏37度で48時間インキュベートします。

インキュベーションの48時間後、0.45μmのアクロディスクフィルターでろ過したウイルス上清を回収し、薬剤耐性JAKの2つのV 607 F変異体をスクリーニングし、レトロウイルス上清でBAF 3細胞を形質導入するための手順を開始します。10%の血清とポリブレインを含むRPMI培地を使用して、1億個のBAF 3細胞と100ミリリットルのウイルス上清を総量300ミリリットルに混合します。この細胞とウイルスのスーパーナト混合物を、各ウェルを4〜5ミリリットルで満たす複数の6ウェルプレートに分配します。

プレートを1, 250GSで摂氏37度で90分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを摂氏37度で翌日24時間インキュベートし、形質導入した細胞を薬物濃度ごとにプールします。50ミリリットルのチューブで10ミリリットルの細胞をルキソリチニブと混合します。

この例でテストしたルキソリチニブの濃度は、1、5、2、0.5、および 10 マイクロモルです。20%の血清を含むRPMIを使用して、容量を40ミリリットルに構成します。1.2%オーガー10ミリリットルを細胞に加え、6つのウェルプレートで慎重に混合します。

ウェルあたり4ミリリットルを分注します。プレートを摂氏37度で2週間インキュベートします。耐性コロニーが見えたら、0.2ミリリットルのピペットチップを使用してコロニーを選び、個別に継代培養します。

24ウェルプレートで3〜4日間、耐性BAF 3細胞を450GSで室温で5分間遠心分離することにより回収します。市販のゲノムを用いてゲノムDNAを単離した後、DNA抽出キット、PCRによりゲノムDNAから全長JAK2つのCDNAを増幅する。次に、PCR産物をAgar Roseのゲル電気泳動と3.4 KILOBASE DNAバンドによって分離します。

JAKを代表する2つのコーティングフレームは、市販のゲル抽出キットを使用して分離されます。最後に、コーディング配列にまたがる8つの内部プライマーを使用して全長CDNAの配列を決定し、市販のソフトウェアを使用して配列を分析して薬剤耐性変異を検証します。In vitroで選択された変異体は、JAK 2 V 617 F配列の部位特異的突然変異誘発によって生成され、BAF 3細胞に再導入されます。

プレートを横切るウェルに異なる濃度のルキソリチニブを含有する培地の50マイクロリットルを別々に加え、プレート10をBAFの4番目のJAKの4つ目に、2つのV 617 F細胞を96ウェルプレートの各ウェルにインキュベートし、プレートを摂氏37度で60時間インキュベートします細胞生存率を評価するには、各ウェルに10マイクロリットルのWST試薬を1つ加え、摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。プレートリーダーを使用して450で吸光度を記録します。すべてのアッセイをトリプリケートで実施し、ルキソリチニブ濃度に対する平均吸光度をプロットします。

非線形曲線近似アルゴリズム スコアを使用して、最適なシグモイド曲線を実行します。細胞IC50として50%の細胞生存率をもたらす薬物濃度は、続いて耐性変異のin vivo検証を行い、添付のテキストプロトコルに記載されているように行われる。ランダム突然変異誘発によって生成された耐性細胞クローンは複数の変異を有する可能性があるため、これらの変異はin vitroおよびin vivoアッセイの両方で単離して検証する必要があります。

in vitroアッセイでは、JAK 2 V 607 F配列の部位特異的突然変異誘発により、選択された変異体をBAF 3つの細胞に再導入し、その後、異なる用量のルキソリチニブでの細胞増殖能を測定してIC 50値を評価しました。さらに、ホスホチロシンまたはリン酸化STAT 5の免疫ブロッティングを、ルキソリチニブの増量とインキュベートしたBF 3細胞のタンパク質溶解物に対して行い、オフターゲットを介した耐性を除外しました。したがって、強化されたIC 50値と高ルキソリチニブ濃度での持続的な自己リン酸化を示す変異体は、in vivo耐性を検証するための薬剤耐性変異体であることが確認されています。

JAK、2、V、6、17 F変異体、およびルシフェラーゼチェリーを発現するように操作されたBF細胞をマウスに注射し、その後、ルキソリチニブを2週間注射しました。2週間後。マウスは、ルシフェラーゼ触媒生物発光、骨髄中のBAF 3キメラ現象、および末梢血流について、チェリー陽性細胞の蛍光を測定することにより評価しました。

その結果、JAK 2 V 607 Fを発現するマウスはルキソリチニブを投与する一方、耐性変異体は治療期間中の生物発光の漸進的な増加を示すことが示されています。一度習得すると、ランダム新生は適切に行われれば4〜5日で実行できます。このビデオを見れば、任意の薬物標的ペアに対するin vitroスクリーニング用のランダム化プラスミドDNAライブラリの開発方法について十分に理解できるはずです。

レトロウイルスを扱うことは非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に予防措置を講じる必要があります。