Name: キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶ キナーゼ阻害剤耐性変異のスクリーニングと検証法。ランダム変異ライブラリーを作成し、in vitroスクリーニングで耐性クローンを選別、シーケンスで変異を同定、サイト特異的変異導入で検証する。がん治療薬開発に有用なプロトコルです。

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この研究は、NCI (1RO1CA155091)、NHLBI (1R21HL114074)、および白血病研究財団からのM.A.への助成金によって支援されました。著者は、編集してくれたサラ・ローラボー博士に感謝しています。

注：このプロトコルのすべての手順は、動物の倫理的な治療とケア研究所健康のガイドラインに従って行われ、承認されたIACUC動物使用プロトコルに従って行った。 1.細胞株メンテナンス<ol><li> RPMI-1640培地中で培養BAF3細胞を、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン（100単位/ mlおよび100μg/ ml）およびWEHI細胞の使用済み培養培地を補充した。 10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中でHEK293T細胞を増殖させる（100単位/ mlおよび100μg/ ml）。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で細胞を維持する。 </li></ol> 2.プラスミドの構築<ol><li>マウスJAK2およびLRによるのpMSCV-puroを-GWにおけるその発癌アイソフォームJAK2-V617F標準の組換えクローニング手順を使用してクロナーゼのクローンを作成。 </li><li>ルシフェラーゼ発現ベクター（のpMSCV-リュック·チェリー-GW）の構築のために-VIで使用VOイメージング、プライマーを用いてPCRによりpLVX-はTet-ONベクターからのルシフェラーゼを増幅（LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCGとLUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC）が使用されているのpENTR-リュックを、生成するためのpENTR-SD-TOPO中にクローニングし、その後LRクロナーゼを使用して再結合を介したクローニングにより、レトロウイルスベクター、のpMSCV-チェリー-GW中のルシフェラーゼ遺伝子を転送する。 </li></ol>ランダム変異ライブラリの調製、突然変異をスクリーニングし、識別 3.1）ランダム突然変異誘発<ol><li> JAK2野生型および商業組換えクローニング技術を使用してのpMSCV-puroを-GWレトロウイルスベクターにV617F変異のクローンの全長。 </li><li>変換するためにJAK2-V617FプラスミドDNAの1μgのを使用し、XL-1レッド、E.従って、それらは、複製中にランダム突然変異を導入する可能DNA修復機構における欠陥がある大腸菌細胞 、。より具体的には、50ミックス - 100ngのDNAを10（DNA 100 ng以上の形質転換効率を低下させる）0あらかじめ冷却ポリプロピレンチューブ中のコンピテントセルのμL、静かに5分毎に渦巻く、30分間氷上でインキュベートした。良いライブラリカバレッジの場合は、コンピテントセルの四から六の管を使用しています。 注：DNAの100以上のngは、変換効率が低下する</li><li> 45秒間のヒートショックを42℃の水浴中でチューブを浸漬し、2分間氷上でインキュベートする。次いで、SOC培地1ml（2.0％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.05％のNaCl、10mMのMgCl 2を、10mMの硫酸マグネシウム、および0.4％D-グルコース）を追加。 90分間の225から250 rpmで振とうしながら、37℃でチューブをインキュベートします。 </li><li> 100μg/ mlのアンピシリンを含む4 10センチメートルLB寒天プレート上に各チューブからプレートの細胞。 37℃で24時間 - 16プレートをインキュベートします。 </li><li>目に見えるコロニーに続いて、無菌のプレートスクレーパーでプレートをこすることによってそれらを収集。各プレートからのプール細胞および市販のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドDNAを単離する。 注：通常のコロニーが小さく、なるように18〜24時間を取る目に見えるこれらは成長の遅い細菌の菌株であるため。この段階では、そのようなSau3A1またはTaq1または配列決定などの頻繁なカッターで制限消化によりライブラリ内の変異の不均一性を評価する。 </li></ol>レトロウイルス上清および形質導入の3.2）生産<ol><li>トランスフェクションの1日、プレートを10％FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM 100 10cm皿上に4×10 6個のHEK 293T細胞の前。 </li><li>次の日、培地を交換し、変異誘発のpMSCV-JAK2-V617Fライブラリで細胞をトランスフェクト。各10cmプレートの場合は、無血清DMEM培地を用いて、400μlの総体積にトランスフェ40μlのDNAを10μg（プラスミドライブラリー5μgのレトロウイルスパッケージングプラスミド5μgの、pCLEco）を混ぜる。室温で20分間、DNAおよび脂質ミックスをインキュベートする。 20分後HEK293T細胞の上に賢明なDNA-脂質複雑なドロップを追加します。 </li><li> 6時間後、トランスフェクション培地ワットを変更するi番目の新鮮な培地には、ウイルス産生のために、37℃で48時間プレートをインキュベートし。インキュベーションの48時間後に、0.45μmのアクロディスクフィルターを通して濾過し、ウイルス上清を集め。 </li></ol> インビトロでの耐性クローンの3.3）の選択<ol><li>薬剤耐性JAK2-V617F変異体の場合は、0.5〜1×10 6のウイルス力価を持つウイルス上清100mlで億BaF3細胞に形質導入する。より具体的には、10％血清を含むRPMI培地を用いて300ミリリットルの全体積のウイルス上清を100ml、及びpolybereneの24μg/ mlの（ploybereneの最終濃度を8μg/ mlである）と10 8細胞を混合する。複数で6ウェルプレート（4-5 1mlあたりをよく）これらのセルミキサを配布します。 </li><li> 25℃で90分間1250×gでプレートを遠心。遠心分離後、24時間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>次の日、一緒に細胞をプールし、Ruxolitinibと媒体が柔らかい寒天を含むと混合し、Si中のメッキxのウェルプレート。各薬物濃度について、50mlチューブ中Ruxolitinib適当量の形質導入されたBAF3細胞（10〜20万個の細胞）を10mlを混合する。 20％血清を含むRPMIを用いて40mlまでボリュームを構成する。 mixcarefullyとプレート6ウェルプレートで、細胞に1.2％寒天の10ミリリットルを追加します。 </li><li> 2週間、37℃でプレートをインキュベートする。 3-4日ごとに個別に24ウェルプレートで0.2ミリリットルのピペットチップを使用して、耐性コロニーとサブカルチャー、それらを選択します。 </li><li>室温で5分間、450×gで遠心分離することによって耐性BAF3細胞を採取する。商業ゲノムDNA単離キットを用いてゲノムDNAを単離する。 PCRはプライマー（mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAGとmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG）を使用して、100ngのゲノムDNAから完全長JAK2 cDNAを増幅し、長期テンプレートは、高忠実度PCRシステムを展開します。 </li><li>アガロースゲル電気泳動でPCR産物を分離する。 JAK2コーディングフレームを表すDNAバンドの3.4キロバイトを切除し、DNAを単離商業ゲル抽出キットを用いて。シーケンス8内部プライマー（P1 - P8）を使用して、cDNAの全長市販のソフトウェアを使用して、コード配列にまたがる、分析シーケンスを。 </li></ol>耐性変異のインビトロ検証4. 多くの細胞クローンは、耐性表現型の各突然変異の寄与を試験するテンプレートとしてのpMSCV-JAK2V-617Fのプラスミドを用いて部位特異的突然変異誘発によって選択された変異体を作製するために、二つ以上の突然変異を有する。 <ol><li>商業誘発キットおよび点突然変異を作成するために設計されたオリゴヌクレオチドを​​使用してのpMSCV-JAK2-V617Fプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行います。配列決定によって変異体クローンのアイデンティティを確認してください。 </li><li>レトロウイルスBAF3細胞を形質導入する変異体プラスミドを用いて作らを1μg/ mlのピ​​ューロマイシンを用いた選択を行った。 </li><li>プレート10 4 BAF3-JAK2-V617F細胞（10％FCSを含むRPMIの50μl）を96ウェルプレートの各ウェルに。独立した37℃で60時間プレートを（0、1、3、5、10、及び20μMの最終濃度）とインキュベートlyがプレート全体でウェルにruxolitinib含有培地50μlを添加する。 </li><li>よく2-4時間、37℃でのインキュベーションに続いてそれぞれにWST-1試薬を10μl添加することにより、細胞の生存率を評価する。プレートリーダーを用いてA450でのレコード吸光度。三連とプロット内のすべてのアッセイを行うINCB018424濃度に対して吸光度を平均した。非線形カーブフィッティングアルゴリズムを使用して、最高のフィットS字曲線を実行します。携帯IC50として50％の細胞生存率の結果として薬物濃度をスコア。 </li><li>次に、ruxolitinibの濃度を増加させ、37℃で4-6時間インキュベートし、10％血清を含むRPMI培地中で6ウェルプレート中のJAK2変異体を発現するプレート600万BAF3細胞。 </li><li> 4℃で5分間450×gでの遠心分離によって細胞を収集します。 PBSで細胞を一度洗浄し、そして20mMのトリス-Cl（pH7.5）中で溶解、50のNaCl、1％NP-40、0.1％SDS、5mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのフッ化ナトリウム、2mMのナトリウムバナジウム、および5％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤を補充した。 5×ゲルローディング緩衝液（350mMのトリス-HCl [pH6.8の]、続いて1分間の細胞懸濁液を超音波処理し、500mMのDTT、15％SDS、10mMのベンザミジン、5mMのEDTA、5mMのEGTA、5mMのナトリウムバナジン、5〜10分間70℃でプロテアーゼカクテル、50％グリセロール、および0.001％ブロモフェノールブルー）および変性。 </li><li>変性条件下で、8％SDSポリアクリルアミドゲル上のタンパク質を解決する。マウスモノクローナル抗phopsho STAT5を用いたイムノ実行します。ブロットをストリップし、ウサギポリクローナル抗SATA5抗体で再プローブした。供給業者の推奨に従って、ECL試薬を用いてバンドを可視化。 </li></ol> 生体内の検証5. <ol><li>のpMSCVリュック·シェールから作られたレトロウイルスで形質導入（ルシフェラーゼと桜を表現するBaF3細胞を形質導入JAK2-V617Fと耐性変異体を発現するウイルスとRY GW）。 JAK2とその抵抗変異体の発現のためのピューロマイシン選択後に生存している細胞を選択します。 </li><li>尾静脈注射により 6 Balb / CマウスにPBSを200μlのJAK2-V617Fとその耐性変異を運ぶ200万活発に成長BAF3リュック/桜の細胞を注入する。 </li><li>細胞移植の3日後、二週間1日2回Ruxolitinibた（100mg / kg）をマウスに注射する。 </li><li>イメージング·システムとルシフェラーゼベースの生物発光イメージングを行います。 。 <ol><li>簡潔には、滅菌脱イオン水25ml、小さな体積およびストア内のアリコートには300mgを溶解することによりルシフェリン溶液を調製。 注：-80℃で保存ルシフェリンと使用まで光から保護する。 </li><li>各マウスで125 mg / kgをを達成するためにIPによって各マウスに250μlのを注入。一緒に密封されたボックス内の吸入イソフルラン（1.5％-2.0％）を使用して、同じ群のマウスを麻酔。目の上の獣医軟膏を適用します乾燥を防ぐために、電子の目。 注：スリープ状態にしたマウスにかかる時間（10〜15分）ルシフェリン活動がピークに達することができました。変動を避けるために、グループ間の一貫性のある時間をおいてください。 </li></ol></li><li>イメージング室ステージにすぐにマウスを移し、イメージング手順の間1.5から2パーセントのイソフルランで麻酔を維持。シーケンシャル0.1、0.5、1、5、30、60、300秒の露光で画像マウス。画像を撮影し、画像取得及び分析ソフトウェアを用いて生物発光強度を定量する。イメージングは​​、そのケージに戻ってマウスを返すの後。 </li><li> 、in vivoでのキメラ現象の収穫総bonemarrow細胞について。頸椎脱臼で追跡5分間CO 2でマウスを安楽死させる。骨髄を収集するために4ミリリットルの冷PBSで骨やクラッシュを収穫する。蛍光顕微鏡下でのパーセント桜陽性細胞を分析し、FACSを用いて定量化する。各サンプルから2万イベントを収集。 </li></ol>

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利益相反は宣言されていません。

臨床的再発と標的遺伝子中の薬剤耐性突然変異の出現：CMLの治療におけるイマチニブの臨床的成功は、小分子阻害剤による頬紅キナーゼを標的とする可能性が、標的療法のも明らかに限定するものではないだけを示した。耐性変異の同定は、より良い臨床管理及び次世代阻害剤の開発に役立つ。このプロトコルは、標的遺伝子に薬剤耐性変異を同定するための方法論を説明しています。この方法は、Eに内蔵され、ランダムに突然変異を誘発プラスミドライブラリーを使用しています大腸菌は 、変異体タンパク質を発現する。ライブラリはその後BAF3細胞（癌遺伝子による形質転換を受けやすい）で導入され、化学療法剤の存在下での細胞クローンの選択を行った。耐性クローンからの標的遺伝子の配列決定は、耐性を付与する突然変異を識別します。最後に、同定された変異は、のためにそれらを検証するために部位特異的突然変異誘発により再作成されます薬剤耐性。 我々はそれぞれ、Ruxolitinibおよびイマチニブに対する耐性を付与するJAK2およびBCR / ABL変異のスペクトルを定義し、この戦略を使用して。私たちは、...

プロテインキナーゼは、一見したところ、すべての細胞の機能を調節する細胞内シグナル伝達経路の重要な調節酵素である。キナーゼを介したシグナル伝達を適切に制御するには、主に、UPSによるキナーゼ、ホスファターゼ及びその分解の適切なレギュレーション（ユビキチンプロテアソーム系）に依存している恒常性と開発、非常に重要です。脱調節キナーゼは、多くの癌のセンターステージにあり、ヒト疾患1のホストに関与。ヒトゲノムは、〜400ヒト疾患2に、直接的または間接的にリンクされている500以上のタンパク質キナーゼをコードする。これらの観察は、小分子阻害剤3-5によるキナーゼの治療標的化のための概念を支 ​​持した。 慢性骨髄性白血病（CML）の治療におけるこのようなイマチニブのようなABLキナーゼ阻害剤、の実証は、このアプローチ6,7のための概念の証拠を提供した。この観察だけでなく、アリに革命をもたらしI-キナーゼ療法だけでな​​く、骨髄増殖性新生物（MPN）で真性多血症（PV）と患者からJAK2における発癌性変異の発見につながる治療標的化のための他の腫瘍性疾患、遺伝的病変を識別するためのアイデアを施行。この発見は、小分子キナーゼ阻害剤とJAK2を標的とすることによりMPNsの治療に大きな関心を生成した。今、JAK2阻害剤のほとんどダースは、臨床試験中であり、そのうちの一つは、骨髄線維症の治療のために最近承​​認された。癌における小分子阻害剤による発癌性キナーゼの特異的ターゲティングは有望な結果をもたらすが、それはまた、治療に対する耐性を発現苦しむ。実際には、これまでのところ、そのようなイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびダサチニブのようなキナーゼ阻害剤で治療した患者は、大部分の薬物は、8-10をターゲットとするために、キナーゼドメインにおける変異を取得することにより、耐性変異を開発した。遺伝子突然変異の結果として抵抗がo制限を強調fは発癌性キナーゼに対する単剤療法を目標とし、これまで以上に成功した癌化学療法の開発の次の挑戦を表します。薬剤耐性の機構および機能的結果を選択し、薬剤開発のための無料の化合物の設計のための根拠を提供するべきである。 in vitroでの画面を使用して同定された変異は、患者に見られるものとの高度の相関を示している。したがって、臨床的再発を引き起こす可能性がある耐性パターンを識別するのに臨床的または前臨床開発を支援における所与の薬物標的のペアのための薬剤耐性を付与する変異をin vitroスクリーニング。これらの変異型を同定するだけでなく、薬物反応および再発について患者をモニタリングするのに役立つだけでなく、より強固な次世代阻害剤の設計のために必須である。たとえば、次の世代BCR / ABL阻害剤、ニロチニブとPonatinibの開発は、理由も大きいメックに可能作られたhanistic理解は、突然変異誘発、構造的、および機能的研究から得られた。 以前、我々はそのようなイマチニブ11,12、PD166326 12、及びAP24163 13と阻害剤に対する耐性を付与する変異のスペクトルを明らかにするために、BCR / ABLのランダム突然変異誘発を用いて私たちのスクリーニングの結果を報告している。結果は、臨床的な抵抗および疾患再発を付与する変異を同定し、だけでなく、薬剤耐性及びキナーゼ機能11,14を支配する原則のメカニズムの理解を提供するだけでなく。ここでは、このスクリーニング戦略のより広範な適用を可能にするために、薬物標的対としてRuxolitinibおよびJAK2を使用して、追加の方法論の詳細を提供する。

<table><tbody><tr><td>細胞・組織培養&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3細胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>ロス・レバイン</td><td></td><td></td>からの贈り物</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C。GW</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F / L983F。GW</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F / P58A。GW</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>自社製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Atlanta biological</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Gibco (ライフテクノロジーズ)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>硫酸プロタミン</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml 水溶液</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (コーニング)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (ルキソリチニブ)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 ミクロン ディスク フィルター</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 ミクロン ナイロン セル ストレーナー</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>細菌培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 赤E. coli細胞</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml原液&nbsp;</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>素晴らしいスープ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>キット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 血液&組織キット</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>ロングテンプレート PCR システム</td><td>ロシュ</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>ウィザードSvゲルおよびPCRクリーンアップシステム</td><td>プロメガ</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>ピュアイールドプラスミドミニ調製システム</td><td>プロメガ</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>pDONR 221 &OmniMAX 2 コンピテントセル</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>ゲートウェイ&nbsp;LRクロナーゼ酵素ミックス&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 および 60317</td><td></td></tr><tr><td>イソフローラン (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO シリーズ 8000 WJ CO2 インキュベーター</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター遠心分離機 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 自動セルカウンター</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>これは必要ではなく、細胞計数に標準的な血球計算装置を使用することができます</td></tr></tbody></table>

キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

慢性骨髄性白血病（CML）におけるドライバ癌遺伝子としてBCR / ABLの発見は、実際には、効果的にCML患者の治療によって癌におけるキナーゼを標的とする可能性を示し、イマチニブの開発をもたらした。この観察は、EGFR、B-RAF、KIT及びPDGFRs、のような様々な他の悪性腫瘍に関与する発癌性キナーゼを標的とする薬剤の開発に革命をもたらした。しかしながら、抗キナーゼ療法の一つの主要な欠点​​は、薬物に対する親和性を減少または消失しているターゲットをレンダリングする薬剤耐性突然変異の出現である。耐性変異体で採用のメカニズムを理解することは、次世代の阻害剤の開発に役立つだけでなく、パーソナライズされた薬を使用する臨床管理に弾みを与えていないだけ。我々は、次の世代BCR / ABL阻害剤の開発に役立っているBCR / ABLの抵抗付与突然変異のスペクトルを識別するためのレトロウイルスベクターベースのスクリーニング戦略を報告した。 Ruxoliの使い方薬剤標的ペアとしてtinibとJAK2は、ここでは、JAK2キナーゼのランダム変異のライブラリーを発現するマウスBAF3細胞を利用vitroスクリーニング方法で説明します。

遺伝子変異の出現は、目標と抗キナーゼ療法のための大きな課題を提起する。突然変異研究は、選択次世代薬物開発の設計に尽力している機構的及び機能的洞察を提供することに加えて、より良い臨床管理を可能にし、将来的にパーソナライズされた治療のために、より有用であろう。この実験では、JAK2-V617Fキナーゼでruxolitinib耐性変異（ 図1）のスクリーニングを示した。私たちは、のpMSCV-チェリー-GWへの完全長マウスJAK2-V617FcDNAを導入することによってのpMSCV-JAK2-V617F-cherry.gatewayベクターを構築。これは、配列の偏りに関連する限界に起因するPCRである方法の最も一般的な選択、の間、ランダム突然変異を、開発するために、細菌宿主（ 大腸菌のXL-1赤株）を使用することを推奨し、大きな遺伝子断片を増幅することが困難であるている。ランダム突然変異誘発DNAライブラリーは、レトロウイルス産生のために、HEK293T細胞にトランスフェクトした。これらの変異体VIR用途は、1または5 RuxolitinibのμMのいずれかでIL-3の非存在下で軟寒天中で...

キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

この手順の全体的な目標は、薬剤耐性変異を特定し、検証することです。これは、最初に標的がん遺伝子のランダムな突然変異ライブラリを作成することによって達成されます。第2のステップは、耐性クローンの出現についてin vitroスクリーニングを行うことです。手順の3番目のステップは、耐性クローンの配列を決定して、耐性変異を特定することです。最後のステップは、部位特異的突然変異誘発を使用して突然変異を再現し、続いてin vitroおよびin vivoアッセイを行うことで、耐性変異を検証することです。最終的には、特定の薬剤標的ペアに対して臨床的に関連する薬剤耐性変異を同定することができます。ENUやPCRベースの方法などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、バイアスがなく、PCRベースのMETAGENE ssisとは異なり、がん遺伝子のサイズや遺伝子のGC含量に制限されないことです。一般的に、この手法に不慣れな人は、分子生物学や細胞生物学の知識が不足しているため、苦労するでしょう。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。新生とスクリーニングのステップを学ぶのは難しいです。それは、多くの人がウイルス産生、細胞培養、半細胞培地の経験が不足しているためです。この手順は、プラスミドを持つ XL 1 赤 e 大腸菌細胞の形質転換から始まります JAK 2 V 617 f JAK 2 XL 1 赤 e 大腸菌細胞の発癌性アイソフォームは DNA 修復メカニズムに欠陥があるため、複製中にランダムな突然変異を組み込むことができます。50〜100ナノグラムのプラスミドDNAと100マイクロリットルのコンピテントセルを、あらかじめ冷却したポリプロピレンチューブで混合します。100ナノグラムを超えるDNAは、形質転換効率を低下させるため、使用しないでください。氷上で30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに渦巻くことで、ライブラリのカバレッジを確保します。コンピテントセルのチューブを4〜6本使用します。ポリプロピレンチューブを摂氏42度の水浴に浸して45秒間の熱ショックを与えた後、氷上で2分間インキュベートします。次に、各チューブに1ミリリットルのSOC培地を追加します。チューブを摂氏37度でインキュベートし、225〜250 RPMで90分間振とうします。100 μg/ミリリットルのアンピシリンを含む4枚の10 cmLBオーガープレート上のプレートセル。プレートを摂氏37度で16〜24時間インキュベートします。コロニーが見えたら、滅菌プレートスクレーパーでプレートをこすり落としてコロニーを収集します。各プレートから細胞をプールします。続いて、プラスミドDNAを市販のプラスミド抽出キットを用いて単離し、ライブラリー内の変異の不均一性を、トランスフェクションプレートの1日前に、10〜6番目のHEK 2 93 T細胞を10〜6番目のHEK 2 93 T細胞の100ミリメートル皿にシーケンシングすることにより評価します10%FCS、ペニシリン、ストレプトマイシン、および2ミリモルのL-グルタミンを含むDM EMの100ミリメートル皿に。翌日、100mm皿ごとにトランスフェクション試薬を調製します。無血清DM E EM培地を使用して、5マイクログラムのプラスミドライブラリー、5マイクログラムのレトロウイルスパッケージングプラスミド、および40マイクロリットルのFU遺伝子を合計400マイクロリットルに混合します。DNAと脂質の混合物を室温で20分間インキュベートします。次に、HEK 2 93 T細胞の培地を新しい培地と交換し、DNA脂質複合体を細胞の上に滴下します。摂氏37度で6時間インキュベートします。6時間後、トランスフェクション培地を新しい培地と交換し、プレートをウイルス産生ごとに摂氏37度で48時間インキュベートします。インキュベーションの48時間後、0.45μmのアクロディスクフィルターでろ過したウイルス上清を回収し、薬剤耐性JAKの2つのV 607 F変異体をスクリーニングし、レトロウイルス上清でBAF 3細胞を形質導入するための手順を開始します。10%の血清とポリブレインを含むRPMI培地を使用して、1億個のBAF 3細胞と100ミリリットルのウイルス上清を総量300ミリリットルに混合します。この細胞とウイルスのスーパーナト混合物を、各ウェルを4〜5ミリリットルで満たす複数の6ウェルプレートに分配します。プレートを1, 250GSで摂氏37度で90分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを摂氏37度で翌日24時間インキュベートし、形質導入した細胞を薬物濃度ごとにプールします。50ミリリットルのチューブで10ミリリットルの細胞をルキソリチニブと混合します。この例でテストしたルキソリチニブの濃度は、1、5、2、0.5、および 10 マイクロモルです。20%の血清を含むRPMIを使用して、容量を40ミリリットルに構成します。1.2%オーガー10ミリリットルを細胞に加え、6つのウェルプレートで慎重に混合します。ウェルあたり4ミリリットルを分注します。プレートを摂氏37度で2週間インキュベートします。耐性コロニーが見えたら、0.2ミリリットルのピペットチップを使用してコロニーを選び、個別に継代培養します。24ウェルプレートで3〜4日間、耐性BAF 3細胞を450GSで室温で5分間遠心分離することにより回収します。市販のゲノムを用いてゲノムDNAを単離した後、DNA抽出キット、PCRによりゲノムDNAから全長JAK2つのCDNAを増幅する。次に、PCR産物をAgar Roseのゲル電気泳動と3.4 KILOBASE DNAバンドによって分離します。JAKを代表する2つのコーティングフレームは、市販のゲル抽出キットを使用して分離されます。最後に、コーディング配列にまたがる8つの内部プライマーを使用して全長CDNAの配列を決定し、市販のソフトウェアを使用して配列を分析して薬剤耐性変異を検証します。In vitroで選択された変異体は、JAK 2 V 617 F配列の部位特異的突然変異誘発によって生成され、BAF 3細胞に再導入されます。プレートを横切るウェルに異なる濃度のルキソリチニブを含有する培地の50マイクロリットルを別々に加え、プレート10をBAFの4番目のJAKの4つ目に、2つのV 617 F細胞を96ウェルプレートの各ウェルにインキュベートし、プレートを摂氏37度で60時間インキュベートします細胞生存率を評価するには、各ウェルに10マイクロリットルのWST試薬を1つ加え、摂氏37度で2〜4時間インキュベートします。プレートリーダーを使用して450で吸光度を記録します。すべてのアッセイをトリプリケートで実施し、ルキソリチニブ濃度に対する平均吸光度をプロットします。非線形曲線近似アルゴリズム スコアを使用して、最適なシグモイド曲線を実行します。細胞IC50として50%の細胞生存率をもたらす薬物濃度は、続いて耐性変異のin vivo検証を行い、添付のテキストプロトコルに記載されているように行われる。ランダム突然変異誘発によって生成された耐性細胞クローンは複数の変異を有する可能性があるため、これらの変異はin vitroおよびin vivoアッセイの両方で単離して検証する必要があります。in vitroアッセイでは、JAK 2 V 607 F配列の部位特異的突然変異誘発により、選択された変異体をBAF 3つの細胞に再導入し、その後、異なる用量のルキソリチニブでの細胞増殖能を測定してIC 50値を評価しました。さらに、ホスホチロシンまたはリン酸化STAT 5の免疫ブロッティングを、ルキソリチニブの増量とインキュベートしたBF 3細胞のタンパク質溶解物に対して行い、オフターゲットを介した耐性を除外しました。したがって、強化されたIC 50値と高ルキソリチニブ濃度での持続的な自己リン酸化を示す変異体は、in vivo耐性を検証するための薬剤耐性変異体であることが確認されています。JAK、2、V、6、17 F変異体、およびルシフェラーゼチェリーを発現するように操作されたBF細胞をマウスに注射し、その後、ルキソリチニブを2週間注射しました。2週間後。マウスは、ルシフェラーゼ触媒生物発光、骨髄中のBAF 3キメラ現象、および末梢血流について、チェリー陽性細胞の蛍光を測定することにより評価しました。その結果、JAK 2 V 607 Fを発現するマウスはルキソリチニブを投与する一方、耐性変異体は治療期間中の生物発光の漸進的な増加を示すことが示されています。一度習得すると、ランダム新生は適切に行われれば4〜5日で実行できます。このビデオを見れば、任意の薬物標的ペアに対するin vitroスクリーニング用のランダム化プラスミドDNAライブラリの開発方法について十分に理解できるはずです。レトロウイルスを扱うことは非常に危険であることを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に予防措置を講じる必要があります。

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ロイシンリッチリピートキナーゼ2は、大規模なマルチドメインのキナーゼ、パーキンソン病の最も一般的な遺伝的原因であるの変異です。このタンパク質のキナーゼ活性の分析は、このタンパク質の生物学と機能障害を理解する上で重要なツールであることが証明されている。本論文では、...

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

前または臨床的発症次 -   - 標的治療に対する薬剤耐性は広範囲に及び抵抗のメカニズムを同定することが必要である代替臨床管理戦略を導くために重要です。ここでは、これらのメカニズムの発見を促進するためにシークエンシングを用いたin vitro での薬剤耐性株のカップルの導出にプロトコルを提示します。...

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

タンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外の環境における情報を解釈し、それに対してどのように反応するかの中心的な特徴です。ここでは、哺乳類細胞から精製したキナーゼを使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを迅速に同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコルを紹介します。...

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。...

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

ここでは、様々 な細胞モデルにおけるシグナル伝達経路の変化を識別するために抗体のアレイのためのプロトコルを提案する.薬/低酸素/超紫外光・放射、または過剰発現/ダウンレギュレーション/ノックアウトによって発生、これらの変更は様々...

抗体のアレイによるシグナル伝達経路の尋問でチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性の評価

ここでは、in vitro および in vivo 遺伝子とヒト化マウスモデルを使用して白血病の薬剤標的として C-fos と Dusp1...

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

本稿は、化学剤のスクリーン ライブラリに阻害剤と T 細胞受容体のシグナル伝達に影響を与えるそれらのターゲットを識別するためフロー ベース フローサイトメトリー分析を使用します。ここで説明する方法は、ハイスループットス...

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

本稿では、インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および相補的なスプリットルシフェラーゼアッセイを含む、RAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けるための実用的かつ実行可能な方法のセットを提示した。...

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイの生成のための詳細なプロトコルが提示される。...

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

学ぶ キナーゼ阻害剤耐性変異のスクリーニングと検証法。ランダム変異ライブラリーを作成し、in vitroスクリーニングで耐性クローンを選別、シーケンスで変異を同定、サイト特異的変異導入で検証する。がん治療薬開発に有用なプロトコルです。

キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

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