Name: ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶニワトリ胚から感覚ニューロンを単離培養する方法。背根神経節の解離とラミニン基質上での培養により、神経細胞生物学を制御環境で研究できます。免疫細胞化学でニューロンマーカーを確認します。

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私たちは、この紙の上で洞察に満ちたコメントをアリソンフィルブリック、ベリンダBarbagalloとマイケル·フランシスに感謝したいと思います。この刊行物で報告された研究は、MLLに授与R15 AREA賞1R15NS070172-01A1によってサポートされていました。

1。カバースリップの準備：アシッドウォッシュと焼く<ol><li>解剖（ステップ2）の前に少なくとも2日間、カバーガラスを準備するには、次の手順を開始します。オイル、徹底的にきれいなカバースリップを除去するための酸洗浄ステップを実行します。 </li><li>縦にカバースリップを配置して互いに接触するのを防ぐ磁器ホルダーに用紙をカバースリップ。 2 M塩酸（HCl）を充填したガラス組織学容器にホルダとカバースリップを沈める。磁器ホルダーが使用できない場合あるいは、広がっ〜20カバーガラスを水平方向に100mmのガラス製ペトリ皿の底をカバーし、2 M HCl中でカバースリップを水没する。 </li><li>ドラフト内でロッカー·テーブル上の（酸中に沈めカバースリップで）ガラス容器を置き、室温で少なくとも5時間、穏やかに振動を可能にする。あるいは、酸洗浄は、同じ条件下で一晩カバースリップ。 </li><li>洗浄は、ロードされた磁器ホルダーを転送することにより、蒸留H 2 O（のdH 2 O）を用いてカバースリップのdH 2 Oで満たされた清浄なガラス組織学コンテナに2MのHClからのカバーガラスと代わりに、カバーガラスとガラスペトリ皿から2MのHClをデカントとDH 2 Oで補充</li><li>再びのdH 2 Oをデカントし、新鮮なのdH 2 Oでガラス容器を再充填することによって洗浄する3迅速な洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>ロッカーの上に（カバーガラスとのdH 2 Oで）ガラス容器を返すことによって、より長い洗浄レジメンを開始します。室温で10〜30分間、穏やかに撹拌を可能にします。その後、のdH 2 Oをデカントし、新鮮なのdH 2 Oを追加少なくとも10回の洗浄の合計のため繰り返します。別の方法として、一晩洗浄を続ける。 </li><li> 350℃に予熱した炉に洗浄し、カバースリップを置きます。磁器ホルダーを使用している場合、のdH 2 Oを充填したガラス容器からホルダーを削除して、直接、炉内にカバースリップでホルダーを配置します。ガラスシャーレを使用している場合、のdH 2 Oをデカントし、furnacにカバーガラスをガラス皿に置くメール。 </li><li>焼くは350℃で少なくとも5時間、または一晩カバースリップ。 </li><li>ベーキングが完了した後、細かい鉗子で磁器ホルダーからカバースリップを除去し、無菌の100mmのガラスシャーレに入れます。もともとガラスシャーレに磁器ホルダーに入れていなかったカバースリップのままにしておきます。 </li></ol> 2チック解剖とのDRGの単離<ol><li>肥沃外し、（緩やかに揺り動かしながら37から38.5℃に維持）インキュベーターから白色レグホンひよこの卵を上演した。 注：これまでの研究では、DRGを単離するための胎生7-10を使用している2,8,11-13,16。 </li><li>層流フード内の選択された卵を置きます。滅菌溶液や楽器との層流フード内で無菌条件下で下記のすべての手順を実施する。 37℃の水浴中で前加温すべての溶液。 </li><li>プラスチック100ミリメートルペトリ皿に卵と場所の内容をクラック。別の100ミリメートルのペトリ皿に胚を転送するために、標準的な鉗子を使用してください。 </li><li&gt;をパスツールピペットを使用して、ウェットティッシュを維持するためにペトリ皿に温め、1×PBSを加える。細かい鉗子で首をつまんで胚を首を切る。別のきれいな100ミリメートルペトリ皿に体を転送します。 </li><li>ウェットティッシュを維持するために、パスツールピペットを用いて皿暖かいF12HS10（ハムF12、10mMのHEPES、100単位/ mlのペニシリン、0.1 mg / mlのストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清）を加える。その背側（ 図1A）に胚を配置するために鉗子を使用してください。 </li><li>層流フード内で両眼立体視の解剖顕微鏡上に胚組織を含む100ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿を置きます。心臓、肺および他の器官を露出させるために開発し、真皮をつまんで首に尾からの垂直正中切開を作るために細かい鉗子を使用してください。別の方法として、内臓を露出させ、小さな涙のシリーズを作る。 </li><li> 、a）の首をつかみ、b）は、心臓のすぐ優れた大動脈または他の組織をつかみ、尾の方に引っ張る：静かに滅菌細かい鉗子の2セットを使用する動物を骨抜き。 </li><li>組織へのパスツールピペットを用いて、暖かいF12HS10を適用します。発展途上リブ、脊柱とDRGを（ 図1B-1D）を露出するために、残りの心血管系、呼吸器や消化器官を取り除くために鉗子を使用してください。 </li><li>解剖顕微鏡下で、さらに内臓を除去し、肋骨に劣る腰椎脊柱の両側に沿ってのDRGを収集するために細かい鉗子を使用しています。胚から無傷のDRGを摘採によってDRGにを収集します。ピンチと脊髄に向かってDRGからのアクセスと周辺部、あるいはその逆に向かって、DRGから届く発展途上の神経をつかん根を断つ。 </li><li>温かいF12HS10で満たされた35mm培養皿に、無傷のDRGを置きます。このような微細な鉗子でつまんで35mm皿にそのままのDRGから、DRGをに付着している可能性があり、背側または腹側根のような余分な組織を取り除きます。 </li><li>腰部よりも優れたDRGを取得するには、胸部の腹側半分を削除し、チェルビCAL脊柱。これは、上頸部と上腰部内の別カットにおける脊髄軸に垂直な発展脊柱にカットすることによって行われます。その後、カットは右と脊柱の左側に沿って脊髄軸に平行にする。が公開に脊髄（ 図1E-1F）を公開し、胚から脊柱の腹側半分を持ち上げます。 </li><li> DRGをへの容易なアクセスを許可するには、細かい鉗子で脊髄をつかんで胸部および頸髄を削除します。脊柱から脊髄を持ち上げるために鉗子を使用してください。近似​​として、胸髄は、リブのレベルにあり、頸部がリブよりも優れている。 </li><li>細かい鉗子で無傷の胸部および子宮頸部のDRGを収集し、他のDRGを暖かくF12HS10に配置します。 DRGをに付着する余分な組織を取り除きます。 </li><li>助けるためにF12HS10で新しいガラスパスツールピペットの内部をすすぐピペットの壁に付着するのを防ぐのDRG。無菌15ミリリットルコニカルチューブに小さなペトリ皿からすべてのDRGとF12HS10を転送し、すぐにステップ3に進むことすすいでピペットを使用してください。 注：追加の胚のDRGの数を増やすこと解剖することができる。 DRGを、ステップ3の準備が整うまで、37℃でF12HS10に保管してください。 </li></ol> 3解離、豊か、そして培養DRGニューロン - パート1 <ol><li>無傷のDRGを持つ場所コニカルチューブ遠心機に、静かに2〜3分間（200×gで）をスピン。 DRGをチューブの底に沈んできたことを確認します。いない場合は、再度スピン。 </li><li>ピペットを用いて、静かに邪魔されずにDRGペレットを残し、F12HS10を削除します。のDRGのペレットを追い出し、1倍、カルシウムとマグネシウムを含まない（CMF）2mlのPBSを追加します。再びスピン無傷DRGペレットを残しながら、CMF PBSを削除します。次のステップでトリプシン消化を妨害するF12HS10におけるウシ胎児血清を除去し、合計3回の洗浄のためのこの洗浄ステップを繰り返します。 </li><li> 2ミリリットルCMFのPBSとのDRGを含む15mlチューブに温め2mlのトリプシンを追加します。解離した細胞へのDRGを消化するために10〜15分間37℃の水浴中に置きチューブ。 </li><li>インキュベーションの間、F12H +サプリメントを含む培地を加える（ハムF12、10mMのHEPES、100単位/ mlのペニシリン、0.1 mg / mlのストレプトマイシン、10ng / mlのNT3、10ng / mlのNGF、200mMのL-グルタミン及びN2）と暖かい37℃の水浴中。典型的には、総培地の10mlを、一次感覚ニューロンの4-5 35mm皿で十分である。また、コーティングカバースリップ（ステップ4）のためにラミニン-1の解凍を開始します。 </li><li>静かに粉薬のDRG P1000ピペットでトリプシン溶液中で、視覚的に無傷のDRGがないことを点検します。無傷のDRGは、もはや目で見られるまで粉砕してを続けていない、および/または無傷のDRGが解離されるまで、37℃の水浴中に長いトリプシンインキュベーションを可能にします。損傷からDRGニューロンを保護するために、粉砕して中に気泡を回避し、&lt;30分にトリプシン消化を制限する。 </li><li> Centrifug解離したDRGを含有するペレットを形成するために、3〜5分間200×gでトリプシンの電子管。ペレットが形成されるまで、必要に応じてより長いスピン。 </li><li>慎重にペレットを中断することなく、トリプシンを吸引。ペレット化しF12HS10の2ミリリットルを追加。静かにP1000のピペットチップでのDRGを粉砕する。 </li><li> 100mm培養皿に15ミリリットルコニカルチューブからすべての内容を転送します。 10ミリリットルの合計時に8ミリリットルF12HS10でチューブをすすぎ、培養皿に転送、2ミリリットル。このすすぎ工程は、管の壁に付着して残っている可能性があり、細胞を収集するのに役立ちます。 </li><li> 3時間加湿した37℃のインキュベーター内に（10ミリリットルF12HS10とし、DRG細胞を解離さ）100mmの培養皿を置きます。 NOTE：HEPESは、CO 2の不在下で培地のpHを緩衝するため、CO 2インキュベーター中で必要とされない。インキュベーションの間、グリア細胞は、組織培養プラスチックの表面に結合し、ニューロンが緩くグリア床に付着する傾向がある。 </li></ol> 4。コーティングアシッドウォッシュラミニン-1とし、焼きカバースリップ<ol><li>氷上で凍結したラミニン-1の無菌アリコートを解凍する。 </li><li>無菌条件下では、ラミニン-1の50μlアリコートに無菌×PBS中の1ミリリットルを加える。 </li><li> 280nmでラミニン-1の吸光度の値を取得するために、分光光度計を使用してください。ラミニン-1の濃度を測定するために、以下の式でこの値を使用します。 </li></ol> ABS 280 =（濃度mg / mlで）*（タンパク質の吸光係数） ラミニン-1の吸光係数は0.86である。 <ol start="4"><li>無菌条件下で、1 mg / mlのおよび20 mg / mlの濃度を得るために1X PBSでラミニン-1を希釈する。これら二つのインキュベーション7,8,10後にカバースリップ（それぞれ30 ngの/ cm 2であり、300 ngの/ cm 2の ）と結合したラミニン-1の10倍の差を達成するために、ラミニン-1の濃度を適用使用してください。 </li><li>層流フードでは、一方の酸洗浄及び焼きCを配置する微細なピンセットを使用し1 35mm培養皿の底にoverslip。必要な食器の数を得るために必要に応じて繰り返します。 </li><li>さらに滅菌を確実にするために20〜30分間UV光にカバースリップを施す。このステップの間に皿のふたをオフにしてください。 </li><li>各ガラスカバースリップに準備されたラミニン-1の400を添加する。カバースリップの完全なカバレッジを確保するために、ラミニン-1を広めるためにピペットチップを使用してください。表面張力は、ラミニン-1がカバースリップ上に残り、必要とされる培養皿の底に広げないようにすることができます。 </li><li>皿の上に蓋を置き、ラミニン-1は、室温で2〜3時間インキュベートすることができます（3時間が最適である）。 </li><li>ラミニン-1インキュベーション後、層流フード内で無菌PBSで無菌技術を使用してカバースリップをすすぐ。カバースリップ上で溶液を除去し、PBS400μlのを追加します。 5〜10分待ちます。 3回のすすぎの合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>最後のすすぎの後にカバースリップ上で、PBSのままにしておきます。すすぎ時の表面張力を壊さないでください。また、カバーガラスを乾燥させないでください。レcoverlipに解離したニューロンをめっきする直前まで、上のaveの蓋。 </li></ol> 5。解離、豊か、そして培養DRGニューロン - パート2 <ol><li>インキュベーション後、穏やかに解離したDRG細胞を含有する100mm皿の底をすすぎ、10 mlの滅菌ピペットを使用する。 〜45°の角度で皿を持ち、静かに、約3分の1皿の上に7ミリリットルを追放、その後、ピペット補助によりF12HS10の〜7ミリリットルを引っ張る。優しくニューロンを追い出し、5回繰り返します。 </li><li>皿を回転させ、皿の別の3分の1に、別の6回のすすぎのために、手順をすすぐ繰り返します。皿の3分の1を、残りのために再度手順を繰り返します。このように、優しくニューロンを除去するためにF12HS10と皿の底面全体をすすぎ。 </li><li>同じピペットを用いて、15​​の円錐管に100mmディッシュからF12HS10含有ニューロンを転送します。細胞をペレットに200グラムで5〜10分間遠心。 </li><li>邪魔されずにペレットを残し、F12HS10を削除します。温めF12H +サプリメントの2ミリリットルでペレットを再懸濁する。 </li><li&gt;は細胞密度を決定するために、血球計数器を使用してください。 </li><li>所望のめっき濃度（1μg/ mlのラミニン-1および20μg/ mlラミニン-1 8,16で被覆されたカバースリップのために40,000細胞/ mlのコーティングされたカバースリップ用12万細胞/ ml）を得F12H +サプリメントと同様に、必要な細胞を希釈する。 </li><li>ラミニン被覆カバースリップからPBSを取り出し、すぐにカバーガラス上の細胞の400μlのを置く。慎重に加湿し、37℃の細胞培養インキュベーターに皿に移す。少なくとも1時間インキュベートし、最大3時間まで神経細胞がラミニン-1に準拠することを可能にすることを許可する。 </li><li>無菌条件下では、優しくF12H +サプリメントの1.6ミリリットルでニューロンを含む35mm皿にあふれる。 注：この時点では、カバーガラス上で表面張力が破壊することができる。ニューロンは十分にカバースリップ上ラミニン1に付着した。 </li><li>インキュベーターで一晩インキュベートした細胞を返します。次の日に免疫細胞化学などの実験を行う。 </li></ol> 6。私はmmunocytochemistry <ol><li>免疫細胞化学の前に、37℃の水浴中に温かい固定溶液（4％パラホルムアルデヒド、30％のスクロース2X PBS）。 注：細胞を固定する前に、そのようなネトリン-1はMn 2 +、ソニックヘッジホッグ、セマフォリンおよびエフリン16,29-31などの各種試薬で処理する。 </li><li>ゆっくり培養皿からF12H +サプリメントの2ミリリットルの1ミリリットルを削除します。優しく暖め固定剤溶液1mlを加える。 10〜15分間室温でインキュベートすることを許可する。 </li><li>慎重に固定溶液を除去し、2mlのPBSを追加。 PBS等の適用開始による固定された細胞の可能性脱落を回避すること、皿の縁に向かって解決策を適用します。 5分間室温でインキュベートする。 </li><li> 5回の洗浄の合計PBS洗浄を繰り返します。細胞は免疫細胞のいずれかのステップの間に乾燥させないでください。 </li><li> PBSを除去します。ブロッキング溶液を1ml（0.1％トリトン-X、1X PBS、5％正常ヤギ血清）を適用する。室温で1時間インキュベートする。あるいは、表面分子を染色する、液8ブロッキングトリトン-Xを使用しないでください。 </li><li>製造者の推奨に従って、ブロッキング溶液に一次抗体を希釈します。 NCAM活性化β1インテグリン16に対する抗体500：1を使用してください。ブロッキング溶液を除去し、一次抗体溶液1mlを添加して、室温で1時間インキュベートするか、4℃で一晩。 </li><li>一次抗体溶液を除去し、1×PBS 2 mlを加える。室温で5〜10分間インキュベートする。 4回のPBS洗浄の合計のため繰り返します。必要に応じて洗浄は、拡張することができます。 </li><li>ブロッキング溶液中1,000：二次抗体1に希釈する。 PBSを取り外し、1ミリリットルの二次抗体溶液を追加し、室温で1時間インキュベートする。 注：二次抗体は光に敏感である。これ以降、なるべく暗所にソリューションや細胞を保管してください。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、以前に行ったように、1×PBSで5回すすいでください。 </li><li> Fluoromountの〜60-80μlの適用顕微鏡スライド上にG。細かい鉗子を使用して、静かに顕微鏡スライド上Fluoromount Gに皿と下カバースリップからカバースリップを持ち上げます。空気の泡を避けてください。 </li><li> Storeは暗闇の中で、4℃で水平にスライドする。 12〜24時間後、Fluormount Gが重合するとカバーガラスをしっかり顕微鏡スライドに添付されます。画像セルこの重合工程が完了した後。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

ここでは、単離するための詳細なプロトコールを提示し、培養ニワトリ胚からの感覚ニューロンを解離さ。この手順では、in vitro 7,8,10,16 におけるロバスト成長ニューロンの濃縮集団を生成します。多数の細胞および分子技術がここに記述されている免疫細胞を含む、これらの培養ニューロンに適用することができる。このプロトコルは、最近、定量的感覚成長円錐8,16で免疫標識し、活性化インテグリンの強度を評価した。これらの以前の研究では、ソフトウェアプログラムを正確に成長円錐の遠位端20ミクロンのアウトラインを作成するために使用された。概要はNCAM染色に基づいて行った。神経細胞におけるNCAMの遍在的な発現は、全成長円錐ではなく、成長円錐の限られた部分を識別するためのソフトウェアプログラムを使用可能。この成長円錐の輪郭がそのレジ内の関心領域及びインテグリン染色強度として同定された関心のあるソフトウェアによって評価した。このようにして、目的のタンパク質の強度を容易に培養感覚ニューロン内の特定の領域で測定することができる。 <p class="jove_con...

ニューロンは、感覚、視覚、運動運動、学習、およびメモリを含む、さまざまな機能に不可欠な情報を伝達する複雑な細胞である。他の細胞型からのユニークな、ニューロンは、通信のための不可欠な神経の高速道路を形成するために、軸索と呼ばれる、アーム状のプロセスを拡張します。成長円錐と呼ばれる成長の軸索の先端に位置して開発専門のコンパートメント、中、その適切な宛先に軸索をリードして、細胞外手がかりのコンサートをナビゲート。成長円錐ナビゲーションの根底にある複雑な分子メカニズムは完全には理解されていない。より良いこれらのメカニズムを理解するために、研究者らは、in vitro環境で定義され、簡略化のニューロンを研究するための細胞培養モデルを使用している。神経分化2、細胞骨格のダイナミクス、エンドサイトーシスおよび人身売買、デンドライト：文化1に留学ニューロンは、ニューロンを含む細胞生物学の理解において大きな進歩をもたらしたレギュレーション3,4、軸索再生5、そのような神経障害6などの臨床症状。加えて、培養神経細胞は、成長円錐の運動性のタイムラプス分析などの免疫細胞化学、細胞表面共免疫沈降、ウエスタンブロット、トランスフェクション、RNAiは、ライブイメージングを含む、研究技術の広い範囲に非常に適している。このように、一次ニューロンを培養したニューロンの細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なアプローチである。 細胞培養モデルは、環境条件や変数を詳細に制御した研究者を提供しています。例えば、ニューロンがメッキ（および上に成長）された基質は、容易に操作することができる。ここでは、二つの異なる基質、低ラミニン-1濃度が1およびラミニン-1の飽和濃度で他を生成するための詳細な手順を提供する。驚くべきことに、同じ分子の異なる濃度は、劇的な効果を持つことができ内部のニューロンの状態だけでなく、それらの細胞表面組成に。例えば、インテグリンのcAMPおよび表面レベルの細胞内レベルは、これらの2つの基層7,8上にめっきニューロンが有意に異なっている。追加の研究は、フィブロネクチンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む他の分子は、細胞表面分子の発現および神経運動性7-11に影響を与えることが示されている。また、このようなニューロトロフィンおよびニューロトロピン等の水溶性分子はまた、細胞膜の組成および神経運動性12-16に影響を及ぼし、容易かつ正確に細胞培養モデルで操作することができる。 ここでは、単離するための方法が記載されているし、培養ニワトリ胚から感覚ニューロンを解離さ。この手順は、軸索伸長5,7,8,10,11,16-21含む神経生物学における重要なブレークスルーを製造するために使用されており、神経節細胞22を分離するように設計された手順を改変した。ありこの手法にはいくつかの利点。まず、ひよこ後根神経節（DRG）の開発の多くの機能はよく出産、軸索伸長のための時間枠を含む特徴とし、タンパク質発現は、このように試験管内実験で有益構築するための有益な基礎を提供し、2,23-28プロファイル 。第二に、神経細胞培養は研究者がより直接的に（神経細胞および非神経細胞を含む）は、無傷のDRG外植片および/または解離神経細胞および非神経細胞の両方を含む混合培養を用いて別のアプローチと比較して、神経細胞を研究することを可能に解離。第三に、ここで説明する手順は、簡単で安価で学部生に適している。したがって、この技術は、研究ならびに教育目的のために使用することができる。さらに、このプロトコルのマイナーバリエーションはDRGを以外のソースからのニューロンの速い、高収率の精製を可能にする必要があります。例えば、この手順はneuronally ENRを提供するために修正することができるそのような胚前脳や脊髄などの他の組織からの文化をiched。 免疫細胞化学プロトコールは、これらの解離ニューロン培養のために最適化されており、ここでは詳細に記載されている。神経細胞接着分子（NCAM）及びβ1インテグリンに対する二重免疫細胞化学のための手順が提供される。これらの免疫細胞化学的方法から生成されたデータは、培養ニューロン8,16のいくつかの分子の空間パターニングおよび強度を調べるために使用されてきた。

<table><tbody><tr><td>滅菌小型培養皿(35 mm)</td><td>コーニング</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>滅菌大型培養皿(100 mm)</td><td>ファルコン</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>滅菌大型シャーレ(100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ(100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>ファインサイエンス</td><td>ツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>標準的な鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1100-12</td><td></td></tr>カバー<tr><td>スリップ(22 x 22 mm)</td><td>フィ</td><td>ッシャー12 518 105K</td><td>0.13-0.17 mmの厚さは顕微鏡検査に最適です</td></tr><tr><td>磁器カバースリップホルダー</td><td>トーマス科学</td><td>8542E40</td><td></td></tr>胎児ウ<tr><td>シ血清</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td>ハムのF12メディアHCl VWR VW3204-1<td>の500ミリリットルあたり50ミリリットルのアリコートを使用します</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>2 Mで使用し、</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td>を廃棄する前に2回使用できます <td>ラミニン-1ストック溶液に5 M NaCl溶液を使用します</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>72 & micro;滅菌5 M NaClのlと50 &microへのアリコート;l</td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>セル治療</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td> を <td>1x で使用し、滅菌ミリポアろ過水で希釈</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>を 1x で使用し、滅菌ミリポアろ過水で希釈</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清アルブミン (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>10%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td>でF12HS20使用し<td>、蒸留水で滅菌1M溶液を作成し、F12培地で希釈して10 mM</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトミオシン</td>の最終濃度を得る <td></td> ΣP0781 F12培地NT3ミリポア<td>GF031</td><td>の500 mlで5 mlを使用する</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>滅菌ミリポア水1mlを加え、滅菌条件下で分注し、-20°Cで保存します。C、F12H培地の最終濃度10ng / mlで使用し、-20°Cに保ちます。C非霜取り冷凍庫</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnDシステム</td><td>256-GF</td>滅菌<td>1x PBSを0.1%BSAで1ml追加し、滅菌条件下で分注し、-20°Cで保存します。C、最終濃度10 ng/mlでF12H培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>シグマ</td><td>G7513</td><td>アリコートを無菌条件下で使用し、-20°Cで保存。C、無菌条件下でF12H培地</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ</td><td>T4049</td>アリコートの最終濃度200mMで使用し<td>、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">その他の必要なアイテム: ガラスパスツールピペット、肥沃な白いレッグホーン鶏の卵、チェックエッグインキュベーター(加湿、37°C;C)、細胞インキュベーションチャンバー(加湿、37°C;C)、層流フード、両眼立体視解剖スコープ</td></tr><tr><td colspan="4">免疫細胞化学試薬 Table</td></tr><tr><td>スクロー</td><td></td>ス <td>Sigma S9378</td><td>固定液に使用 (4% パラホルムアルデヒエ、30% スクロース、2x PBS)</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ΣP6148</td><td></td><td>固定液に使用 (4% パラホルムアルデヒエ、30%)スクロース、2x PBS)</td></tr><tr><td>フルオロマウントG</td><td>サザンバイオテック</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primary 抗体 テーブル</strong</td></tr><tr><td>>NCAM</td><td>ミリポア</td><td>AB5032</td><td>ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗体に対する抗体アクティブ化 & ベータ;1 ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4">二次抗体 Table</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

ニューロンは、感覚、運動、移動、学習、およびメモリを含むさまざまな機能のために重要な情報を運ぶ多面細胞である。 生体内で神経細胞を研究することは、それらの複雑さ、彼らの多様かつ動的な環境、そして技術的な限界に挑戦することができます。これらの理由により、in vitroでニューロンを研究することは神経細胞の複雑な謎を解明することが有益で証明することができます。細胞培養モデルの明確に定義された性質は、環境条件および変数を詳細に制御を提供する。ここでは、隔離解離、およびニワトリ胚由来の培養一次ニューロンする方法について説明します。この技術は、迅速で安価であり、ロバスト感覚ニューロンを成長生成する。手順は、一貫して非常に神経細胞について濃縮された培養物を生成し、非常に少数の非神経細胞（5％未満）を有している。一次ニューロンは、したがって詳細な手順二つディスタンを作成するために、未処理のガラスまたは組織培養プラスチックによく接着しないCT、ニューロンのメッキ用の、明確に定義されたラミニン含有基質が記載されている。培養したニューロンは、共免疫沈降、生細胞想像、RNAiを、および免疫細胞化学を含む複数の細胞および分子技術、に非常に適している。これらの培養神経細胞をダブル免疫細胞化学のための手順は、最適化されており、ここに記載されている。

ここで説明するプロトコルは、文化に非常に少ない（ 例えば 、&lt;5％）非神経細胞7,8,10,16と解離胚性感覚ニューロンの濃縮集団を研究者を可能にします。多数のDRGを腰仙部、胸部および頸部から得ることができる。治験責任医師の必要に応じて、これらの異なる解剖学的領域からのDRGを容易に単離することができる。たとえば、 図1は、図1Cおよび1Dおよび図1Eおよび1Fでの胸部のDRGで強調表示腰椎DRGを持つ解剖のさまざまな段階を経てニワトリ胚の画像を示す。 培養細胞を簡単に免疫細胞化学によって標識されている。ここでは、培養した細胞は、β1インテグリンおよびNCAM（ 図2）に対する抗体で免疫染色されている。驚くべきことに、私たちはこれらの後に最長1年間の蛍光染色を視覚化することができましたICC手順、スライドを4℃、暗所で水平に保持した場合。しかし、ICCの汚れの寿命は、...

細胞培養モデルは、環境条件を詳細に制御を提供し、したがって、神経細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なプラットフォームを提供します。私たちは、隔離解離、およびニワトリ胚の培養感覚ニューロンために、迅速な安価で、かつ信頼性の高い方法を記載する。基質の調製および免疫細胞化学の詳細も提供される。

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

この手順の全体的な目標は、ニワトリの胚から解離した一次感覚ニューロンの濃縮集団を培養することです。これは、胚の日から無傷の後根神経節、7〜10個のニワトリの胚を円錐形のチューブに集め、続いてそれらを解離した細胞懸濁液に分解することによって達成されます。解離した第2のステップとして、DRG細胞を培養皿に播種してインキュベーションします。その後、培養皿を穏やかにすすいで、ニューロンを優先的に除去する。最後のステップには、高濃度または低濃度のラミニンで事前にコード化された酸洗浄および焼きカバースリップなど、明確に定義された基層に解離した感覚ニューロンをめっきすることが含まれます。1つの免疫細胞化学を使用して、解離培養胚性ニワトリ感覚ニューロンの細胞体、神経突起、および成長円錐体におけるNCAおよび活性化β one integrinsの存在を示します。この方法は、軸索誘導、成長円錐、細胞骨格ダイナミクス、細胞表面の組成と制御のメカニズムなど、神経生物学のさまざまな側面を解明するための強力なツールです。この技術により、研究者は、グリア細胞をほとんど含まない解離感覚ニューロンを高度に濃縮した培養物を迅速に取得することができます。これは、ニューロンと非ニューロン細胞の両方を含む無傷の後根ガングル培養とは異なります。さらに、このプロトコルのわずかなバリエーションにより、胚性前脳を含む後根神経節以外の供給源からのニューロン培養の高収率が可能になります。層流フードで、段階的な肥沃な白いレッグホーンヒヨコの卵を割って、その内容物を100ミリメートルのペトリ皿に入れます。その後、胚を別の100ミリメートルのシャーレに移します。温めたXPBSをペトリ皿に追加して、ティッシュを濡らし続けます。胚は斬首され、体は別のきれいなペトリ皿に移されます。温めたF 12 HS 10を組織に加える。胚組織を含むペトリ皿を層流フード内の解剖顕微鏡の下に置きます。その後、発育中の真皮をつまむことで尻尾から首にかけて縦方向の正中線切開を行い、心臓や肺などの臓器を露出させます。細い鉗子で、首と大動脈または心臓のすぐ上の他の組織をそっとつかみ、尾に向かって引っ張って動物を内臓を抜き取ります。次に、温かいF 12 HS 10を組織に塗布して調製物をさらに洗浄し、組織を湿らせ、必要に応じて解剖全体でF 12 HS 10の適用を繰り返します。次に、残っている心血管、呼吸器、または消化器官を取り外して、発達中の肋骨の脊柱とDRGを露出させ、肋骨より劣る腰椎柱の両側に沿ってDRGを収集し、胚からDRGを摘み取ります。これは、Dr.Gから脊髄に向かって伸びる根をつまんで切断し、DRGから末梢に向かって、またはその逆に発達中の神経をつかむことによって行われます。その後、無傷のDRGを温かいF 12 HS 10で満たされた35 mm培養皿に入れます。DRGに付着する可能性のある背根や腹側根などの余分な組織をすべて取り除きます。腰部よりも優れたDRGを取得するには、胸椎と頸椎の腹側半分を切除します。これは、上部腰部の脊髄軸に垂直な発達中の脊柱に切り込みを入れ、上部頸部に別の切り込みを入れることによって行われます。次に、脊柱の右側と左側に沿って切り込みを入れます。まとめると、これらの切り傷は脊柱の腹側半分を胚から切り離し、その後、柱を胚から取り外してDRGに簡単にアクセスできるようにします。胸部と頸部の脊髄を細い鉗子で掴んで切除します。次に、前と同じように無傷の胸部および頸部のDRGを採取し、他のDRGと共に温かいF 12 HS 10に入れます。DRGに付着する可能性のある余分な組織を取り除きます。次に、新しいガラスパスターピペットの内部をF 12 HS 10ですすいで、DRGがピペットの壁に付着するのを防ぎます。すすいだピペットを使用して、すべてのDRGとF 12 HS 10を小さなペトリ皿から15ミリリットルの滅菌円錐管に移し、この手順でDRGの数を増やすために追加の胚を解剖することができます。DRGが無傷のコニカルチューブを遠心分離機に入れ、Gの200倍で2〜3分間静かに回転させます。DRGがチューブの底に沈んだことを確認します。次に、F 12 HS 10をそっと取り外し、DRGペレットを邪魔しないままにします。次に、1つのX-C-M-F-P-B-Sを2ミリリットル追加して、DRGのペレットを取り除きます。もう一度回転させ、DRGを保持したままC-M-F-P-B-Sを取り外します。この洗浄手順を合計3回繰り返します。洗浄が完了し、CMM-F-P-B-Sが除去されたら、2ミリリットルの温めたトリプシンを15ミリリットルのチューブに追加し、DRGを静かに取り除きます。次に、チューブを摂氏37度の水浴に10〜15分間入れて、DRGを解離細胞に消化します。トリプシン溶液でDRGを穏やかにテートし、無傷のDRGが存在しないことを目視検査します。無傷のDRGが目で見えなくなるまで、または無傷のDRGが解離するまで摂氏37度のウォーターバスでインキュベーションを長くします。次に、解離したDRGとトリプシンをGの200倍で3〜5分間遠心分離して、ペレットを形成します。必要に応じて、ペレットが形成されるまで長く回転させます。次に、ペレットを乱さずにトリプシンを慎重に吸引します。ペレットに2ミリリットルのF 12 hs 10を加え、DRGを穏やかに試します。その後、コニカルチューブからすべての内容物を100ミリメートル培養皿に移します。チューブを8ミリリットルのF 12 HS 10ですすぎ、一度に2ミリリットルずつ合計10ミリリットルの培養皿に移します。その後、培養皿を加湿した摂氏37度のインキュベーターに3時間置きます。次に、400マイクロリットルの準備されたラミニンを、酸で洗浄して焼き付けたガラスカバースリップごとに1つずつ追加し、ピペットチップで広げて完全にカバーします。表面張力により、ラミニン1がカバースリップに残り、培養皿の底に広がることはありません。皿に蓋をして、Laminoneを室温で2〜3時間インキュベートします。その後、ラミニンコーティングされたカバースリップを滅菌PBSで層流フードで3回すすぎます。最後のすすぎ後、PBSをカバースリップに残しておきます。すすぎステップ中に表面張力を失わないでください。インキュベーション後、10ミリリットルの滅菌ピペットを使用して、解離したDRG細胞を含む皿の底を穏やかにすすいでください。皿を45度の角度で持ちます。F 12 HS 10の約7ミリリットルを引き出します。次に、それを皿の3分の1にそっと排出して、ニューロンを取り除きます。これをさらに5回繰り返します。次に、皿を約120度回転させ、すすぎ手順をさらに6回繰り返します。次に、皿の残りの3分の1について手順を再度繰り返します。今度は、同じピペットを使用して、ニューロンを含むF 12 HS 10を皿から円錐管に移します。200 Gで5〜10分間遠心分離してペレットにします。その後、細胞はF 12 HS 10を除去し、ペレットは乱されないままになる。次に、2ミリリットルの温めたF 12 Hとサプリメントでペレットを再懸濁します。その後、ヘモサイトメーターで細胞密度を決定し、必要に応じてF 12 H plusサプリメントで細胞を希釈して、目的のプレーティング濃度を取得します。次に、ラミニンコーティングされたカバーからPBSを取り外し、すぐに滑ります。それらの上に400マイクロリットルの細胞を置きます。皿を摂氏37度の細胞培養インキュベーターに慎重に移し、無菌条件下で2〜3時間インキュベートします。ニューロンが入った35mmの皿に、1.6ミリリットルのF 12 Hとサプリメントをそっと浸します。その後、細胞をインキュベーターに戻し、一晩インキュベートします。この図は、NCAおよび活性化β one integrinsに対して免疫標識された培養された解離した初代感覚ニューロンを示しています。胚のひよこニューロンは、高濃度のラミニン1ニューロン細胞体で堅牢に成長します。神経突起と成長コーンはNCAに対して免疫陽性であり、ベータワンインテグリンを活性化します。2つの染色のマージされた画像は、ほとんどの細胞がNカムと活性化ベータワンインテグリンの両方に対して陽性であることを示しています。胚性のニワトリ感覚ニューロンについて予想されるように、この技術によって採取された細胞のうち、非ニューロンは5%未満です。この画像には、NCA M陰性とβ 1インテグリン陽性のグリア様形態を持つ細胞があります。非神経細胞と一致します。培養された感覚ニューロンの倍率が高いほど、細胞体から伸びる神経突起がはっきりと示され、この挿入図は神経突起の先端にある成長円錐の倍率が高いことを示しています。この手順を試みている間、それは慎重にそして完全に無傷の後根神経節を解離し、定義された基層上のニューロンと適切な密度をプレートすることを覚えておくことが重要です、酸洗浄され、ラミネートの既知の濃度でコード化された覆われたスリップのような培養手順に従ってください。タイムラプス顕微鏡法などのライブイメージング法を実施して、定義された基層上で、および培養培地に適用された分子に応答して、成長コーン、運動系統、POALダイナミクス、およびその他の成長コーンの挙動を評価することができます。このビデオを見た後、ニワトリの胚性後根神経節から一次解離ニューロンに非常に濃縮された、堅牢に成長する培養物を生成する方法についてしっかりと理解しているはずです。

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