Name: タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶin vitroメチル化アッセイでPRMT基質のメチル化状態を評価する方法。エピトープタグ付きPRMTを哺乳類細胞で発現させ、免疫沈降とSDS-PAGE解析によりタンパク質アルギニンメチル化を研究します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、RWへの退役軍人の米国エネルギー省、およびNIHのグラントR01CA138528から優秀賞によってサポートされていました。

発現構築物の調製<ol><li>プロトコルを開始する前に、N末端エピトープタグ（MycのまたはHA）、および細菌細胞から高レベルのタンパク質発現および精製のための基質インフレームグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）とを有する哺乳動物発現ベクターにクローンPRMTs標準的な分子生物学的技術を用いて、溶解物、。 </li></ol> PRMTs 2。精製<ol><li>ヒト気管支上皮細胞（Beas2B）を維持するために、100mmの培養皿を使用してください。継代細胞3日ごとにし、それらがコンフルエンスまで成長させてください。 </li><li>トランスフェクションの前日に、100mm培養皿中の10mlの培地中7.5×10 5の細胞を播種する。スワールは細胞を均一に分散し、5％加湿CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートする。 </li><li>翌日、培地を吸引除去し、血清および抗生物質を含まない培地の5ミリリットルを追加します。旋回やメディアを吸引除去する。このステップを繰り返し1最終的にはより多くの時間、および血清/抗生物質を含まない培地の5ミリリットルを追加し、トランスフェクションに進んでください。 </li><li>無菌1.5ミリリットルのプラスチック遠心管中の無血清培地を750μlにプラスミドDNA6μgの希釈する。 </li><li>別の1.5ミリリットルのプラスチック遠心管では、無血清培地750μlの中にトランスフェクション試薬30μlの希釈する。 </li><li>希釈したDNA（ステップ2.4​​）を含有するチューブに希釈したトランスフェクション試薬溶液（ステップ2.5）を転送します。数回ピペッティングにより穏やかに混合します。 </li><li> 15分間室温でトランスフェクション混合物をインキュベートする。 </li><li> 15分後、細胞の上に静かにトランスフェクション混合物をピペットで、スワールが均一に混合し、5％加湿CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートする。 </li><li> 3時間後、細胞からトランスフェクション混合物を含有する培地を吸引する。血清および抗生物質を補充した新鮮な細胞培養培地を加える。 </li><li> 5％加湿CO 2中、37℃でインキュベートする48時間インキュベーター。 </li><li> 48時間後、溶解緩衝液1ml中に細胞を溶解し（1×リン酸緩衝生理食塩水、1％のNonidet P-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、および1μg/ mlのphenlymethylスルホニルフルオリド）。セルリフターのプラスチック遠心管に溶解物を収集し、氷上で30分間溶解物をインキュベートする。 </li><li>細胞破片からの溶解物をクリアするためにベンチトップ遠心機で10分間15,000×gで溶解物を遠心。 [*これは、高度にメチル化アッセイのための酵素の精製に進む前に、抗HA抗体を用いた溶解物のアリコートの免疫ブロッティングを経由して、HA-PRMT1の発現を確認することをお勧めします。] </li><li> PRMTsの精製のために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の抗HAアフィニティマトリックスの50:50懸濁液の30μlを用いた細胞溶解物3mgのインキュベートし、チューブローテーター中で4℃で一晩回転させる。 </li><li>翌日、収集するために2分間ベンチトップ遠心分離機で14000×gでチューブを回転ビーズ。上清を破棄し、2、14,000×gで遠心分離し、各洗浄で[、20mMトリス（pH8.0）に150mMのNaCl、5mMのEDTA及び1％トリトン-X-100]をビーズはRIPA 1mlのバッファーで3回洗浄分。 3回目の洗浄の後、メチル化緩衝液100μlで一回ビーズを洗浄緩衝液（50mM Tris pH8.5の、20のKCl、10mMのMgCl 2、1mMのβ-メルカプトエタノール、100mMのスクロース）。遠心分離後、上清を除去します。固定化PRMTsを含むビーズは、メチル化アッセイで使用される準備ができている。 [*これは非常にすぐにメチル化アッセイに固定化PRMTsを使用することを推奨します。] </li></ol>基質の精製<ol><li> GST-G3BP1の単一コロニーを接種し、100μg/ mlのアンピシリンを含むルリア - ベルターニ（LB）培地5mlにBL21を形質転換した。 250rpmで振盪しながら37℃で一晩培養を育てる。 </li><li>翌日、新鮮なLB培地と続き、50mlの一晩培養物を移す（これは、約2時間かかります）0.5〜0.7のOD 600まで成長するinue。 </li><li> OD 600が 0.5〜0.7に達したときに、1 mMの最終濃度になるようにイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）を添加し、250rpmで振盪しながら37℃でさらに4時間培養を続ける。 </li><li> 10分間1500×gでの遠心分離によって細胞を採取し、-80℃でGST精製またはストアのペレットを処理する。 </li><li>再懸濁溶解緩衝液5ml（プロテアーゼ阻害剤、リゾチーム100μg/ mlの、及び0.1％のTriton-X-100と1×PBS）における細菌ペレットを、30分間、37℃でライセートをインキュベートする。この時、溶解物は、細菌ゲノムDNAのリリースに濁った、粘性が表示されます。 </li><li>超音波処理（30％の振幅に1秒の10パルスごと）によりゲノムDNAを剪断。 </li><li> 10分間15000×gでの遠心分離によって溶解物をクリアし、15mlチューブに透明な上清を移す。上清をcentrifuを繰り返し明確ではない場合ゲーションプロセスをもう一度。 </li><li>一方、氷冷PBSで2回、GST-セファロースビーズを洗浄し、PBS中のGST-セファロースの50:50懸濁液を作製。クリア細菌細胞溶解液に、GST-セファロース懸濁液200μlを加え、1時間、4℃で回転させます。 </li><li> 1時間後、ビーズを収集するために3分間500×gでチューブを遠心する。ビーズは氷冷PBSで3回洗浄する。 </li><li>最後の洗浄後、溶出緩衝液100μl（50mMトリスpH8.0で、150mMのNaCl、30mMのグルタチオン）中でビーズを再懸濁し、10分間4℃で回転させる。 </li><li> 2分間15000×gでチューブを遠心し、別のプラスチック製遠心管に精製したタンパク質を含む上清を移す。精製タンパク質の濃度を推定するためにウシ血清アルブミン（BSA）の既知量と一緒に精製されたタンパク質を5μlにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析を行う。 </li></ol> 4。メチル化アッセイ注：放射性同位元素の仕事のために、放射性同位体で実験を行う上で機関のプロトコルに準拠して指定された別の領域に、次の手順を実行します。 <ol><li>精製されたGST-基質および1×メチル化バッファー（50mMトリスpH8.5の、20のKCl、10mMのMgCl 2、1mMのβ-メルカプトエタノール、100mMのスクロース）、1μCiの含有するマスターミックス2μgの追加のS-アデノシルL-[メチル- 3 H]メチオニン、水、固定化PRMTs（ステップ2.13）に10μlの最終体積にし、1時間、30℃で反応をインキュベートする。 </li><li> 1時間後、2×SDS試料緩衝液10μlを添加することにより反応を停止。 10分間95℃での試料の変性後、SDS-PAGEゲルでサンプルを分離する。 </li><li>以降、半乾燥電気泳動トランスファーを用いてニトロセルロース膜にSDSゲルから分離されたタンパク質を移す。 </li><li>転写後、を有する膜をカバーutofluor（オートラジオグラフィーイメージインテンシファイア）と、穏やかに室温で2時間揺らし。 2時間後、オートフルオーを捨てる、後で使用するために保持します。 [*放射性物質などのチューブにラベルを付ける] </li><li>迅速空気は、ろ紙上の膜を乾燥ビニール袋に入れて密封し、-20℃でX線フィルムに膜を露出させる。十分な露光時間は5〜30日の間の範囲である。 </li></ol> PRMT発現と基質の等しい負荷の5。確認<ol><li>十分なエクスポージャーを達成した後、ブロッキングバッファーを含むプラスチック箱[トゥイーン20（TBST + 3％脱脂乳）をトリス緩衝生理食塩水]を、膜を転送し、穏やかに1時間揺らし。 </li><li>放射性廃棄物としてブロッキングバッファーを捨てます。 4℃で一晩TBST中：（1,000希釈1）抗HA抗体で膜をインキュベート 穏やかに揺らしながら°C、。 </li><li> TBSTで3回で膜を洗浄し、HRP標識抗マウス二次抗体で膜をインキュベート穏やかに揺らしながら1時間室温でTBST中：（1 5000希釈）。 </li><li> 1時間後、TBST 3倍の膜を洗浄し、HRP基質を有するタンパク質の化学発光検出を行う。 </li><li> HAタグ付きPRMTsを検出した後、室温で5分間Ponseau-S染色液で膜をインキュベートする。すぐにGSTタグ基質を検出するために、水と、膜3回洗う。画像をスキャンします。 </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

本明細書に記載のプロトコルは、日常的に同定PRMT基質のメチル化状態を確立するために使用される。この強力、かつ一貫性のアッセイはまた、それらの基質のためのPRMTsの特異性に決定的な証拠を提供します。このアッセイの成功のための重要なコンポーネントは次のとおりです。哺乳動物細胞におけるPRMTsの1の発現、精製PRMTs 0002活性、基質の3発現および精製、ニトロセルロース膜へのタンパク質の4。完全な西部の転送。 組換えPRMTsを発現させ、細菌から精製はまた、 インビトロでのメチル化反応10,11,13に用いることができる。各PRMTは、異なる精製戦略を、保存条件、及び保管温度を必要とするので、 インビトロでのメチル化反応における組換えPRMTsの使用は理想的ではないかもしれない。また、組換えPRMTsも短命11です。これらの課題を考慮すると、私たちはそのPURを信じる哺乳動物細胞からPRMTsのification は、in vitroメチル化反応を行うことが便利で一貫している。哺乳...

タンパク質のメチル化は、最初に1968年1に記載された。それは、研究者は、この翻訳後修飾2の重要性を認めるようになったことを、1996年にPRMT1の最初のクローニングまでではなかった。興味深いことに、核抽出物のタンパク質中のアルギニン残基の約​​2％は、本変形例の存在量を示す、3メチル化されている。アルギニンは、塩基性側鎖を有するアミノ酸を正に帯電している窒素/ sのアルギニンの側鎖中には、翻訳後にメチル基、アルギニンのメチル化4-6として知られているプロセスの添加によって修飾することができる。アルギニンメチル化は、酵素、すなわちクラスによって触媒される。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）。アルギニンはモノメチル化またはジメチル化し、後者は、工程4-6を触媒PRMTsの種類に応じて、対称または非対称のいずれかであり得ることがことができます。 アルギニンを表示するタンパク質電子グリシンリッチモチーフはPRMT媒介触媒作用のための潜在的標的である。基質のPRMT媒介メチル化は、正常な細胞ホメオスタシス7-9に重要である全てが、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-核酸相互作用、タンパク質機能、遺伝子発現、および/ ​​または細胞内シグナル伝達を調節することが示されている。タンパク質アルギニンメチル化の生物学的役割を理解するために、正確で効率的かつ再現可能なアッセイを同定PRMT基質のメチル化状態を確立するために必要とされる。 それらの基質のメチル化を触媒する精製PRMTsの能力を評価するインビトロメチル化アッセイでは 、アルギニンメチル化10-12を研究するための広く受け入れられアッセイである。このアッセイの全体的な成功は、主に精製されたPRMTsの活性に依存している。 PRMTsを発現させ、細菌、または哺乳動物細胞10,11から精製することができる。 dと、このインビトロメチル化アッセイ、プロトコルセクションでetailed、もともとチニと同僚10によって記載された方法に基づいている。このプロトコルでは、詳細には哺乳動物細胞におけるPRMT1の発現および精製に関与するステップを示す。タンパク質結合タンパク質1（G3BP1）、既知のPRMT基板8を 、活性化はRas-GTPアーゼ上のメチル化を触媒する精製PRMT1の能力は、後述のようなS-アデノシル-L-[メチル- 3 H]メチオニンの存在下で評価した。メチル供与体。このアッセイを用いて、確実に、タンパク質アルギニンメチル化の研究における主要なステップであるメチ小説や既知の基質にPRMTsの能力を定義することができます。

<table><tbody><tr><td>S-アデノシル-L-[メチル3H]メチオニン</td><td>パーキンエルマー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エコシントウルトラ&nbsp;</td><td>ナショナル・ダイアグノスティック</td>ス <td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップ・ディスペンサー</td><td>ナショナル・ダイアグノスティック</td>ス <td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>オートフルオ</td><td>ナショナル・ダイアグノスティック</td>ス <td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 ml シンチレーション・バイアル</td><td>ナショナル・ダイアグノスティック</td>ス <td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-セファロース</td><td>GEライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-グルタチオン還元</td><td>型シグマ</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗HAアフィニティーマトリックス</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗HA抗体</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

タンパク質アルギニンメチル化は、核内で最も豊富な翻訳後修飾の一つである。タンパク質アルギニンメチル化は、識別および/または決定プロテオミクスのアプローチを介して、および/またはメチル-アルギニン特異的抗体を用いたイムノブロッティングすることができる。しかしながら、これらの技術は、時には誤解を招くことがあり、しばしば、偽陽性の結果を与えることができる。最も重要なことは、これらの技術は、PRMTの基質特異性を支持する直接的な証拠を提供することができない。 インビトロメチル化アッセイ、一方、敏感である有用な生化学的ア ​​ッセイであり、同定されたタンパク質が実際にPRMT基質である場合には一貫して明らかにした。典型的なインビトロメチル化アッセイは、精製され、アクティブPRMTs、精製された基板と、放射性同位体標識されたメチル供与体（S-アデノシル-L-[メチル- 3 H]メチオニン）が含まれています。ここでは、触媒的に活性なPRMT1、普遍的に発現PRMTファミリーメンバーを単離するためにステップバイステップのプロトコルを記述します。私に精製PRMT1のメチルトランスフェラーゼ活性は、後でS-アデノシル-L-メチル供与体としての[メチル- 3 H]メチオニンの存在下で、タンパク質1（G3BP1）に結合Rasは、GTPアーゼ活性化タンパク質、既知のPRMT基板上に試験した。このプロトコルは、新たな生理PRMT1基質のメチル化状態を確立するためだけでなく、タンパク質アルギニンメチル化の基本的なメカニズムを理解するためだけでなく、使用することができる。

<html> GST-G3BP1をメチル化するためにHA-PRMT1の能力は、インビトロメチル化アッセイによって決定した。 Beas2B細胞溶解物から精製されたHAタグ付きPRMT1をメチル供与体として、GST-G3BP1、および1 S-アデノシル-L-のμCiの[メチル- 3 H]メチオニンを含むメチル化反応で使用した。 PRMT1を効率的に、GST-G3BP1（ 図1、上のパネル）のメチル化を触媒することができます。空のベクターの溶解物に対して実施プルダウンを使用してメチル化反応は、Beas2B細胞は、陰性対照（ 図1、上パネル、レーン1）を務めトランスフェクトした。 PRMT1の発現は、抗HA抗体を用いて確認さイムノブロッティング（ 図1、中央のパネル）。 Ponseau-S染色は反応（ 図1、下のパネル）の両方におけるGST-G3BP1の等しい負荷を示すために使用された。 <p class="jove_content" fo:keep-togeth...

タンパク質アルギニンメチル化酵素、すなわちクラスによって触媒。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）は、タンパク質内のアルギニンのメチル基の酵素添加の過程である。 インビトロメチル化アッセイは、既知または新規のPRMT基質のメチル化状態を評価するための最も信頼できるツールである。

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

この手順の全体的な目標は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼまたはPRMT基質のメチル化状態を確立することです。これは、最初に哺乳類細胞でエピトープタグ付きPRTを発現することによって達成されます。次に、P RMTを抗赤血球凝集素または抗HAコーティングSRO速度を用いて細胞溶解物から免疫沈降させ、その後、広範囲に洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去します。次に、洗浄したビーズを、バクテリアおよびトリチウムから精製した基質タンパク質とインキュベートし、カタツムリLメチオニンまたはサムと標識します。最後に、反応を停止し、シル硫酸ナトリウム、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはSDSページ分析とそれに続く自動X線撮影により、基質のメチル化状態を決定します。最終的に、p RMTが基質をメチル化する能力は、空のベクターとBRMTトランスフェクション細胞のライセートに対して実施された免疫沈降を用いたメチル化反応を比較することによって決定されます。プロテオミクスアプローチやメチルアルギニン特異的抗体を用いた免疫ブロッティングは、時に誤解を招き、誤った結果をもたらすことがよくあります。最も重要なことは、PRMT基質の特異性を裏付ける直接的な証拠を提供できないことです。このビデオで示すin vitroメチル化アッセイの主な利点は、感度が高く、トランスフェクションの前日にPRMT基質が10ミリリットルの培養培地に750、000人のヒト気管支上皮細胞を播種する前日に同定されたタンパク質を一貫して明らかにすることです。100mm培養皿で、皿を回転させて細胞を均一に分散させ、5%加湿CO2インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。翌日、培地を吸引し、血清と抗生物質を含まない5ミリリットルの培養培地を追加し、培地を渦巻いて吸引します。この手順をもう一度繰り返し、最後に5ミリリットルの血清抗生物質を含まない培地を追加し、トランスフェクションに進みます。トランスフェクションを行うには、まず、6マイクログラムのPRMTプラスミドDNAを750マイクロリットルの無血清培地に希釈し、滅菌済みの1.5ミリリットルのプラスチック遠心チューブで別の1.5ミリリットルのプラスチック遠心チューブに入れます。30マイクロリットルのトランスフェクション試薬を750マイクロリットルの無血清培地に希釈します。次に、希釈したトランスフェクション試薬溶液を、ピペッティングを数回上下させて穏やかに混合した希釈DNAの入ったチューブに移します。トランスフェクション混合物を室温で15分間インキュベートします。次に、トランスフェクション混合物を細胞上に優しくピペットで移し、渦巻いて均一に混合します。摂氏37度で3時間のインキュベーション後、細胞からのトランスフェクション混合物を含む培地を吸引します。次に、血清と抗生物質を添加した新鮮な細胞培養培地を加えます。37°Cで48時間のインキュベーション後、1ミリリットルの溶解バッファー中で溶解細胞を培養しました。セルリフター付きのプラスチック製遠心分離チューブにライセートを回収します。次に、ライセートを氷上で30分間インキュベートします。次に、遠心分離機。ライセートは、ベンチトップ遠心分離機で10分間15, 000GSで溶解します。P mtsの精製のために細胞破片からライセートを除去するには、3ミリグラムの細胞ライセートを、リン酸緩衝生理食塩水中の抗HAアフィニティーマトリックスの50〜50懸濁液30マイクロリットルとインキュベートします。または、PBSはチューブローテーターで摂氏4度で一晩中回転します。翌日、ベンチトップ遠心分離機で14, 000GSでチューブを2分間回転させ、ビーズを収集します。スナットを廃棄した後、ビーズを1ミリリットルのRIPAバッファーで洗浄し、その後、前回と同様に遠心分離します。ビーズをRIPAバッファーで3回洗浄した後、100マイクロリットルのメチル化バッファーでビーズを1回洗浄します。遠心分離後、上清を取り除きます。固定化されたp RMTを含むビーズは、メチル化アッセイで使用する準備ができています。メチル化アッセイは、放射性同位元素用に指定された別の領域で行ってください。放射性同位元素を扱うための機関のプロトコルに準拠して作業します。精製したグルタチオン、sトランスフェラーゼ、またはGST基質をテキストプロトコルに記載されているように調製します。2マイクログラムを、1つのxメチル化バッファーとトリジウム標識カタツムリLメチオニンのマイクロキュリーを含むマスターミックスと組み合わせます。固定化したp RMTに混合物を加え、摂氏30度で1時間インキュベートします。1時間後、2つのXSDSを10マイクロリットル追加して反応を停止します。サンプルを摂氏95度で10分間変性させた後のサンプルバッファー。後で SDS ページごとにサンプルを分けます。分離したタンパク質をSDSゲルからニトロセルロースメンブレンに半乾式電気泳動転写を用いて転写します。転写後、メンブレンを自動X線画像で覆います。インテンシファイアと室温で2時間静かに揺さぶる 2時間後、インテンシファイアを注ぎ、後で使用するために保持します。濾紙でメンブレンを素早く風乾し、ビニール袋に密封し、マイナス20°CのX線フィルムにメンブレンをさらします。十分な曝露時間は5日から30日の範囲です。十分な露光を達成した後、メンブレンをブロッキングバッファーの入ったプラスチックボックスに移し、1時間静かに振とうします。ブロッキングバッファーは放射性廃棄物として廃棄します。次に、メンブレンを抗HA抗体とTトリスでインキュベートし、生理食塩水をTween 20で緩衝し、TBSTと略して4°Cで一晩、翌日穏やかに揺さぶります。メンブレンをTBSTで3回洗浄します。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス二次抗体とTBSTでメンブレンを室温で1時間、穏やかに揺さぶりながらインキュベートします。TBSTでメンブレンを3回洗浄した後、HAタグP RMTsの検出後、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質でタンパク質の化学発光検出を行います。メンブレンをポンチョS染色溶液と5分間インキュベートします。室温で、メンブレンを水ですばやく3回洗浄してから、画像をスキャンします。GSTタグ付き基質を検出するために、HAタグPMT oneがGSTタグG three PP oneをメチル化する能力をin vitroメチル化アッセイによって決定しました。HA TAG prm TはB2B細胞から精製されたものです。ライセートは、GSTG 3、BP One、およびトリチウム標識カタツムリLメチオニンの1つのマイクロカレーを含むメチル化反応に使用されました。メチル供与体として、p MT oneは、空のベクターのライセートに対して行われるプルダウンを使用して、GS TG 3 BP oneメチル化反応のメチル化を効率的に触媒することができました。トランスフェクションされたB2B細胞は、ネガティブコントロールとして機能しました。抗HA抗体を用いた免疫ブロッティングにより、p rmtの発現が確認されました。次に、1つのポンチョ染色を使用して、両方の反応でGSTG 3、BP、1の均等な負荷を実証しました。このビデオを見れば、in vitroメチル化アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、のための合成のtRNA基質の調製を記載し...

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。...

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

これらのプロトコルは、細胞内のタンパク質アルギニンメチルトランスファーゼ(PRMT)ファミリーの個々のメンバーの酵素活性を評価するために使用される方法論を提供する。内因性および外因性バイオマーカー、メチルアルギニン認識抗体、および阻害剤ツール化合物を用いたPRMT活性評価に関する詳細なガイドラインが記載されている。...

タンパク質アルギニンメチルトランスレシーゼ1-9細胞内活性を研究する定量的方法

本プロトコルは、1H-NMR分光法による遊離およびタンパク質結合アルギニンおよびメチルアルギニンの調製および定量的測定を記載している。...

核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索

ランダムドットkinematogramsとコンピュータで生成された無脊椎動物のビデオ再生を採用したオペラント条件づけパラダイムを使用して、トカゲの視覚感度のテスト。...

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

刷り込みは、植物と哺乳類の生殖の現象です。...

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

DNAメチル化解析のためのゴールドスタンダードは、重亜硫酸変換したDNAのゲノム配列決定です。このメソッドは、酸性条件下で脱アミノ化を亜硫酸、5 - メチルシトシン（5 -...

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。それは一方では、磁気ビーズとタグ融合タンパク質（例えば、ナノボディ）との間の相互作用や他のタグ付きタンパク質と第二、標識タンパク質（例えば、ポリオウイルス）との間の親和性に基づく信頼性の高い手法である。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

学ぶin vitroメチル化アッセイでPRMT基質のメチル化状態を評価する方法。エピトープタグ付きPRMTを哺乳類細胞で発現させ、免疫沈降とSDS-PAGE解析によりタンパク質アルギニンメチル化を研究します。

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

さらに動画を探す