「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

カーゴマッピングの全体的な目標は、小胞カーゴに会合して移動する分子モータータンパク質の相対的な量とタイプを決定し、このモーターの組成をライブカーゴの動きの方向性と相関させることです。これは、まずマイクロ流体デバイスでマウス海馬初代ニューロンを成長させ、軸索が比較的まっすぐに成長するようにし、一過性にトランスフェクトされたニューロンの軸索における蛍光標識カーゴタンパク質の細胞内生の動きを記録することによって達成されます。第2のステップは、ライブカーゴイメージングの過程でニューロンを固定し、続いてキネシンやダインズなどの分子モータータンパク質に対する抗体で軸索を染色し、続いて免疫蛍光顕微鏡イメージングを行うことです。

次に、固定された貨物とモーターの画像は、免疫蛍光染色によって決定された染色された関連モーターと生きた貨物の動きを相関させるために、クラフトとも呼ばれる時間の経過に伴う貨物の動きのプロットに位置合わせされます。最後のステップは、モーター共局在と呼ばれるカスタム開発されたMATLABソフトウェアパッケージを使用して、カーゴとモータータンパク質のサブピクセル位置を決定することです。このソフトウェアは、各貨物とモーターの位置の正確なXY座標、および貨物とモーターに関連する蛍光強度の相対量を提供します。

最終的に、サブピクセル解像度レベルでの実車および固定貨物およびモーターの蛍光顕微鏡法の相関関係は、移動の方向性がわかっている特定の貨物に関連するモーターのタイプに関する情報を提供します。したがって、この方法は、エクソン輸送のメカニズムについての洞察を提供します。これは、マイクロト卵管ダイナミクス中のタンパク質とマイクロチューブへの結合やエンドサイトーシス中のタンパク質の動員など、生命顕微鏡と免疫蛍光染色を関連付ける他の研究にも適用できます。

この方法を視覚的にデモンストレーションすることで、特殊なセットアップが必要なため習得が難しい可能性のあるイメージング固定および解析ステップを実行するのに役立ちます。この手順のためのマウス海馬初代ニューロンは、プロトコルテキストに記載されているように調製され、神経基底卵の成長に再懸濁されます。マイクロ流体デバイスのニューロンをプレートするための媒体。

マイクロ流体リザーバー1と1プライムから培地を取り出します。20マイクロリットルの細胞をマイクロ流体リザーバー1に適用し、それらが流れるのを待ちます。デバイスを摂氏37度のインキュベーターに5%CO2で20分間置きます。

顕微鏡で観察して、細胞が覆われたガラスに付着していることを確認します。すべてのリザーバーを補充するための成長培地であるニューロ基礎を追加します。9日目までに細胞を含むデバイスをインキュベーターに戻します。

培養では、ニューロンはマイクロチャネルを介して軸索を伸ばし、蛍光タンパク質の発現のためのトランスフェクションの準備ができています。トランスフェクションしたマウス海馬初代ニューロンのライブイメージングは、摂氏37度のインキュベーターとCO2制御チャンバーを備えた倒立型エピ蛍光光学顕微鏡で行います。この手順を開始するには、100 x oil 対物レンズを選択します。

対物レンズにオイルを塗布し、マイクロ流体デバイスで成長した海馬ニューロンの入ったカバースリップを顕微鏡ステージに取り付けます。ニューロンの死を避けるために、サンプルを顕微鏡で1時間以内に保つように迅速に作業してください。マイクロ流体チャンバーのチャネルを通って伸びるトランスフェクション細胞の軸索を見つけます。

トランスフェクションされた軸索が見つかったチャネルの数を記録します。ハンドタリーカウンターを使用してチャンネル数をカウントし、ライブの動きを最適に記録し、その後の共局在分析を行います。チャネルを介して比較的平坦に成長する軸索を選択して、ほとんどの小胞のイメージングを焦点を合わせて実行できます。

chmグラフト上の移動軌跡を持つ固定画像のその後の整列を容易にするため。イメージング中は、マイクロチャネルの右端を視野に合わせます。ライブイメージング中に細胞をうまく固定するためには、固定液を追加する1人と焦点を調整するもう1人の2人で行うのが最適です。

また、すべての試薬を準備し、手の届くところに置いておくことも重要です。1ミリリットルのプラスチック製トランスファーピペットを使用。リザーバー2と2から媒体の大部分を取り出します Prime Startは、分析対象の貨物の輸送ダイナミクスに固有のタイムラプス仕様でライブ貨物の動きをイメージングします。

十分なライブ動作データが収集されたら、1人の人にリザーバー2と2プライムを予温固定剤で満たしてもらいます。マイクロ流体デバイスに触れると、ライブイメージングの焦点が乱れるため、触れないでください。固定剤を追加している間、相手にピントを調整してもらいます。

同様に、リザーバー1つと1つのプライムを固定固定で満たすと、動きの即時停止が観察されると成功します。続いて、固定ニューロンを内因性モータータンパク質に対する抗体で染色し、プロトコルテキストに記載されているように画像化します。貨物マッピングを開始するには、画像分析ソフトウェアを使用して貨物の動きのクロモグラフを生成します。

Rich Dorf Insightsが開発したImage Jプラグインは、市販のグラフィックソフトウェアを使用してクラフトを生成するために推奨され、貨物の免疫蛍光画像を貨物の動きのCHMグラフに手動で位置合わせし、貨物の点をchmグラフの軌道の位置に重ね合わせ、各貨物点がCHMグラフ上の特定の軌道に対応するようにしました。最適な位置合わせ結果を得るには、マッピングされた貨物に対して最も焦点が合っているZスライスを使用します。Z スタック内の各画像に対して、複数の Z スライスを使用できます。

確立されたアルゴリズムを使用して、各蛍光点の XY 座標と強度振幅を決定し、2D ガウス分布を 3 つのチャネルのそれぞれの点源を表す点像分布関数に適合させます。XY 座標を取得するために、Yakima DONA 氏らが開発したガウス近似アルゴリズムを、移動軌跡または静止軌道にマッピングされた個々の貨物の時間ごとに組み込んだ、Motor Colocalization と呼ばれるカスタムビルドの MATLAB ソフトウェア パッケージが開発されました。Kogグラフで、モーター共局在プログラムの結果からXY座標と強度振幅を選択します。

いくつかのZack画像を使用して、異なる焦点面にあるより多くの貨物をマッピングします。マッピングされた貨物の個々のXY座標を、対応するZスライスの各モーターチャネルで取得されたXY座標と比較します。貨物の半径300ナノメートル以内にあるXYモーター座標を決定し、選択し、同じ焦点面内で信号を送った貨物とモーターを選択します。

モーター共局在ソフトウェアパッケージを使用して、半径300ナノメートル以内にある時間軸を決定します。カーゴマッピングを使用して、黄色の蛍光タンパク質またはY-F-P-P-R-P-Cでタグ付けされた正常なプリオンタンパク質を運ぶ小胞の輸送を、軸索中のキネシンおよびダインモーターの相対量と関連付けました。このグラフはF-P-P-R-P-C小胞の動きを示しており、点線はライブイメージング中の固定時間を示しています。

固定されたY-F-P-P-R-P-C小胞の蛍光画像、およびキネシン軽鎖oneとdineの対応する免疫蛍光画像がクロモグラフに整列されます。この拡大図は、2D Gian関数が割り当てられた3つのチャンネルのそれぞれの免疫蛍光シグナルを示しています。このグラフは、野生型ニューロンとキネシン重鎖を欠くニューロンにおけるY-F-P-P-P-R-P-C小胞、キネシン軽鎖1、および食事の間の共局在の定量化を表しています。

Y-F-P-P-R-P-C小胞に関連するキネシン軽鎖oneとdineの相対量は、ガウス振幅から取得され、相対的な運動量と運動の方向性との間の可能な相関関係を精査するためにプロットされます。野生型ニューロンからのこの例は、動いているか静止しているY-F-P-P-R-P-C小胞が、移動しているか静止しているか、KINESIN軽鎖1本または食事、または両方と会合することを示しています。この技術を習得すると、3日以内に実行できます。約10日間のマイクロフィリックデバイスや一次神経細胞のEMイメージング前作製に加え、3日以内に免疫蛍光染色のライブイメージングやデータ解析ができるようになります。

このビデオを見れば、マイクロ流体デバイスで成長した蛍光標識されたカーゴとニューロンのライブ運動を記録する方法について十分に理解できるはずです。イメージング中にC細胞を固定する方法、サブピクセル解像度としての共局在を解析する方法、カーゴと分子モータータンパク質の共局在とカーゴの動きとを相関させる方法。