Name: 「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学ぶ軸索内貨物輸送における分子モーター蛋白質の構成と移動方向性の相関解析。マウス海馬ニューロンを用いたカーゴマッピング法で、蛍光顕微鏡とMATLABソフトウェアによりサブピクセル精度の共局在解析を実現する。

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私たちは、貨物マッピング分析を定量化するソフトウェアの適応と開発を支援してくださったGe Yang氏、Gaudenz Danuser氏、Khuloud Jaqaman氏、Daniel Whisler氏に感謝します。また、マイクロ流体デバイスの作成に協力してくれたEmily Niederst氏に感謝します。この研究は、L.S.B.G.へのNIH-NIA助成金AG032180とハワードヒューズ医学研究所によって部分的に支援されました。L.S.はNIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806によって部分的に支援され、S.E.E.はDamon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship、NIH Neuroplasticity Training Grant Grant AG000216によって支援され、The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Awardからの助成金により、G.E.CはNIH/NCATS 1 TL1賞TR001114とAchievement Rewards for College Scientists財団によって支援されました。

<ol><li>Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+superfamily+proteins+and+the+mechanism+of+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport.</a> Science. 279, 519-526 (1998).</li>
<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li>
<li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport along microtubules.</a> Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).</li>
<li>Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+of+organelles%3A+unity+and+struggle+of+opposing+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors.</a> Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).</li>
<li>Gross, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hither+and+yon%3A+a+review+of+bi-directional+microtubule-based+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport.</a> Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).</li>
<li>Gross, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+regulation+of+molecular+motors+in+Xenopus+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores.</a> J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).</li>
<li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+opposite-polarity+microtubule+motors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination of opposite-polarity microtubule motors.</a> J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).</li>
<li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo%3A+a+tug-of-war+or+coordinated+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li>
<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug-of-war+between+dissimilar+teams+of+microtubule+motors+regulates+transport+and+fission+of+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).</li>
<li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+control%3A+regulation+of+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).</li>
<li>Hendricks, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Coordination+via+a+Tug-of-War+Mechanism+Drives+Bidirectional+Vesicle+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport.</a> Current Biol. 20, 697-702 (2010).</li>
<li>Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+kinesin+and+dynein+assemblies+drive+the+axonal+transport+of+mammalian+prion+protein+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles.</a> Cell. 144, 551-565 (2011).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-plasma+Bonding+of+PDMS+for+Inexpensive+Fabrication+of+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+Microfluidic+Device+for+the+Compartmentalization+of+Neuron+Soma+and+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons.</a> J Vis. Exp. 7 (261), (2007).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+localization+II%3A+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li>
<li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution%3A+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+DS+%22Introduction+to+the+Practice+of+Statistics%22">Introduction to the Practice of Statistics</a>. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで紹介するプロトコルは、ライブニューロンにおける相対的なタイプと関連したモータータンパク質の量と個々の蛍光微小管ベースの移動貨物粒子の運動の方向性との相関を可能にします。以前は、軸索水疱貨物の総運動組成物は、生化学的に精製された小胞およびオルガネラ9,15の不均一な集団で検定した。しかし、細胞内での貨物のシングルタイプの特徴づけるモーター組成が原因均質ベシクル集団を精製することが困難である挑戦されています。モータストール力の測定は、ショウジョウバエ胚においてアクティブモーター数の推定値を提供しながら、また、それは動きの方向を安定して貨物またはへ/積荷12から活性モータの迅速な会合/解離に束縛されるモータと相関するかどうかは不明であった。そのため「貨物マッピング」プロトコルはdescriここのベッドは、さらに種類や個別のライブニューロンで貨物を移動するために関連したモータの相対数との相関関係を調査するために開発されました。 首尾よく「貨物マッピング」からデータを取得...

細胞内輸送は、種々の細胞ドメイン1へのタンパク質、膜、細胞小器官、およびシグナル伝達分子を送達するための全ての細胞型において非常に重要です。ニューロンは、批判的にさまざまな軸索マイクロドメインへの長距離配信のために不可欠な貨物の細胞内輸送に依存して長く、偏予測と高度に特殊化した細胞である。二つの大きな分子モータータンパク質のファミリ - - この輸送はキネシンとダイニンによって媒介される貨物に結合すると、それぞれ、順行と逆行方向に偏光した微小管に沿って追跡する。逆行移動は主にダイニンによって媒介されるが、順行方向の移動は、キネシンモーターの大きい、機能的に多様なファミリーによって促進される。その結果、軸索貨物の順行性輸送は、キネシンスーパーファミリー1-5の様々な家族によって媒介される可能性があります。一部の貨物は、どちらの方向にも持続的にメートルを移動しますがOST貨物は双方向に移動し、その最終的な目的地1,5-13に向かう途中で頻繁に逆転。さらに、示されている、貨物同時に指向性会合に対向する貨物の移動が規制反対の極性モータ5-7によって調整されるかという疑問を上げるモーター。一緒に、軸索貨物の輸送はモーターと順番に様々なアダプタおよび規制上の結合パートナー14に依存している彼らの特異的な生化学的な活動、の組成によって調節されている協調プロセスです。 忠実に特定の貨物軸索輸送のメカニズムを説明するために、その輸送の基礎となる規則を発見するためには、ライブの輸送中に、個々の貨物に関連付けられたモータータンパク質とその調節結合パートナーの組成を決定するために最も重要である。他の方法は、例えば生化学的アプローチのために、平均のmotの推定値を提供するまたは精製された異種のベシクル集団上の組成が、これらの推定値は、単一の移動小胞に関連するモータの種類や金額を明らかにしない。また、in vitroで 、予め組み立てられた微小管に沿った小胞輸送の再構成は、単一の小胞のレベル15で、モータの一種の量を測定可能にした。しかし、これらの実験は、直接これらの小胞の輸送特性のモータの量を相関し、細胞調節因子の非存在下での輸送を測定しなかった。 内因的に測定する（IF）データはモータータンパク質を発現した免疫蛍光からの個別の移動小胞の運動組成物（タイプとモーターの相対的な量）を決定し、ニューロンにおける正確に同じ小胞のライブトランスポートにこれらのパラメータを関連付けるここに提示されているプロトコル16。この方法は、IF存続荷物移動データの正確なマッピングを必要とする。これはgrowinことによって達成される確立されたプロトコルの17-19を以下のマイクロ流体デバイスにおけるG海馬マウスのニューロン。これらのデバイスは、固定とライブ光学顕微鏡モダリティにおける軸索および単一可動貨物の識別と相関関係 （「マッピング」）（ 図1）を可能にします。培養されたニューロンは、その輸送kymographsにプロットされている詳細な移動情報を取得するために、高い空間分解能及び時間分解能で画像化された蛍光標識された貨物のタンパク質をトランスフェクトする。画像化の過程で、神経細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、その後、内因性のモータータンパク質に対する抗体で染色した。固定された貨物とモータの画像は動きが16軌道ライブ貨物にそれらを「地図」（共局在）するライブ移動kymographsに重畳されている。モータータンパク質との会合を持つ貨物のライブの動きを相関させるために、共局在は、「Moを呼ばれるカスタムメイドのMATLABソフトウェアパッケージを用いて分析されているTOR共局在」16,20。蛍光標識された貨物とモーターが部分的に重複することができ、回折限界点状の特徴を生成する。涙点の重複の位置を解決するために、ソフトウェアが最初に自動的にそれらの正確なXYサブピクセル位置座標を決定するために、個々の蛍光涙点を表し、それぞれの点広がり関数をガウス関数に適合し、強度が21-23振幅。モータや貨物の位置である続いて共局在16,20を決定するために、互いに比較した。したがって、この方法は、より正確に、他の方法24に比べて、蛍光涙点間の共局在を割り当てる。 この方法の強みは、ライブの移動軌跡（例えば、それらは定着時に移動された方向）のrecされているために、固定された細胞内の個々の貨物とモータの共局在化を評価する能力であるorded。この方法では、キネシンおよびダイニンは、（のPrP Cの -cellular）双方向に移動させ、あるいは軸索16で静止したままでneuronally富化貨物を正常なプリオンタンパク質を運ぶ小胞に同時に関連付けることが見出された。この分析は、貨物に関連しながら、順行（キネシン）と逆行（ダイニン）モータがどちらの方向に小胞を移動するか、静止したままにするために彼らの活動を調整するPrP Cから小胞の動きの調節をワーキングモデルの定式化を可能にした。この方法の別の強さは、目的の任意の他のタンパク質（単数または複数）と、実質的に任意の細胞型の中で移動する多数の蛍光標識された貨物の共局在化/会合を特徴付けるためのその潜在広い適用である。多くの個々の蛍光を移動する粒子が所望のページを介して分析することができる標識したがって、生/固定された相関関係は、潜在的に、一過性のタンパク質 - カーゴ相互作用の検出を可能にすることができ時間のeriod。幅広い適用性と、このメソッドが対処できる質問の種類を考えると、このプロトコルは、ニューロンまたは他の細胞型のもの勉強人身売買および輸送を含む細胞生物学者の幅広い視聴者を対象としています。

<table><tbody><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>シグマ</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM(ダルベッコ's Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Pyruvate Sodium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum Free Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I Supplement (100x)</td><td>LifeHBSS</td><td>35050061</td><td></td>技術</tr><tr><td>(1x) (Hank's Balanced Salt Solution)</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS(ダルベッコ)リン酸緩衝生理食塩水、マグネシウム、カルシウム不使用 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Water for Cell Culture&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>USBコーポレーション</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-システインHCl</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA(ウシ血清アルブミン)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNAse IグレードII</td><td>ロシュ応用科学</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ&nbsp;</td><td></td>11668027</tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液16%EMグレードの</td><td>フィッシャー科学</td><td>50980487</td><td>注意:吸入、皮膚との接触、飲み込んだ場合、有害です。目、呼吸器系、皮膚に刺激を与えます。公式の規則に従って廃棄してください。</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>017-000-0121BSA</td><td></td></tr><tr><td>脂肪酸およびIgGフリー</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>001-000-162</td><td></td></tr>アセ<tr><td>トン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 色あせ防止試薬</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 1 1/2. 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Axis microfluidic device, 450 & micro;m</td><td>ミリポア</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolsnapHQカメラ&nbsp;</td><td>ローパーサイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック <tr><td>60 mm細胞培養ディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>150 mm細胞培養ディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>抗体:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗キネシン軽鎖、V-17</td><td>サンタクルス&nbsp;</td><td>sc-13362</td><td>KLC1-/-ニューロンを用いて特異性を確認(文献16)、推奨希釈率1:100。</td></tr><tr><td>対ダイニンヘビーチェーン1、R-325</td><td>サンタクルーズ&nbsp;</td><td>sc-9115</td><td>shRNAを用いたDYN1HC1に対する特異性の検証(文献16)、推奨希釈率1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&nbsp;推奨希釈率1:200。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ロバ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&nbsp;推奨希釈率1:200。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 抗体 IgG 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11057</td><td>&nbsp;推奨希釈率1:200。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&nbsp;推奨希釈率1:200。</td></tr><tr><td colspan="4">プラグインとマクロ</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp;http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp;</a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Plugin</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

分子モーターは、ニューロン内の小胞の貨物を輸送するために彼らの活動を調整するメカニズムを理解することは、単一の小胞レベルでのモータ/貨物協会の定量分析を必要とします。このプロトコルの目的は、組成物及び貨物に関連付けられているモータの相対量は、ライブ貨物の移動（「マップ」）の位置と方向を相関させるために、定量的蛍光顕微鏡を使用することである。 「カーゴマッピングは「ライブのライブ運動の記録中に化学固定に続いてマイクロ流体デバイス上で培養した軸索に移動、蛍光標識された貨物のイメージング、およびモータに対する抗体を用いた、まったく同じ軸索の領域のその後の免疫蛍光（IF）染色で構成されています。貨物およびそれらに関連するモータ間の共局在は、サブピクセル位置を割り当てることによって評価される回折李にガウス関数をフィッティングすることにより、モータ及び荷役チャンネル座標個々の蛍光点光源を表すmited点広がり関数。固定された貨物とモータの画像は、その後、彼らの追跡軌跡にそれらを「マップ」するために、荷動きのプロットに重畳される。データは、生細胞内の小胞貨物の輸送の両方を記録するために、これらのまったく同じ小胞に関連したモータを決定する場合は、このプロトコルの強さは、ライブの組み合わせですと。この技術は、これらの方法は、単一の移動貨物上の組成物を明らかにしないように、精製された不均質バルクベシクル集団の平均運動の組成を決定するために、生化学的方法を使用して、前の課題を克服する。さらに、このプロトコルは、それらのタンパク質組成を有する個々の細胞内構造の動きを相関させるために他の細胞型で他の輸送及び/又はトラフィッキング経路の分析に適合させることができる。このプロトコルの制限事項は、培養の低いトランスフェクション効率に起因する比較的低いスループットである一次ニューロンおよび高分解能イメージングのために使用可能な制限された視野。将来のアプリケーションには、蛍光標識された貨物を発現するニューロンの数を増加させる方法を含むことができる。

図1は、海馬神経細胞を成長させるために使用されるマイクロ流体デバイスの概要を示している（ 図1A、B）。ニューロンは、チャネルの長さは、軸索コンパートメントまでずっと交配からの樹状突起を防ぎつつマイクロチャネルの大きさは、軸索コンパートメントに細胞体（細胞体）の拡散を防止するリザーバ1にプレーティングする。培養液中で〜2-3日後に、ニューロンは軸索コンパートメント（ 図1B、C）にマイクロチャネル全体でその軸索を拡張し始める。黄色蛍光タンパク質（YFP-のPrP C）で標識された正常なプリオンタンパク質を発現するトランスフェクトされた軸索は、蛍光顕微鏡（ 図1C）によって同定することができる。プラスミドトランスフェクションを使用して、蛍光標識されたタンパク質の発現は、変化したタ​​ンパク質のコンフォメーションへの実験的なアーティファクトを導入可能性が過剰発現などの適切な細胞内局在と機能のためにチェックする必要があります。したがって、colocalizatイオン実験は、生化学的共沈...

小胞や細胞小器官などの貨物の細胞内輸送は、分極した微小管を追跡する分子モータータンパク質によって行われます。このプロトコルは、ニューロン内を移動する個々の貨物粒子の輸送の方向性と、関連するモータータンパク質の相対的な量とタイプとの相関関係を説明しています。

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

カーゴマッピングの全体的な目標は、小胞カーゴに会合して移動する分子モータータンパク質の相対的な量とタイプを決定し、このモーターの組成をライブカーゴの動きの方向性と相関させることです。これは、まずマイクロ流体デバイスでマウス海馬初代ニューロンを成長させ、軸索が比較的まっすぐに成長するようにし、一過性にトランスフェクトされたニューロンの軸索における蛍光標識カーゴタンパク質の細胞内生の動きを記録することによって達成されます。第2のステップは、ライブカーゴイメージングの過程でニューロンを固定し、続いてキネシンやダインズなどの分子モータータンパク質に対する抗体で軸索を染色し、続いて免疫蛍光顕微鏡イメージングを行うことです。次に、固定された貨物とモーターの画像は、免疫蛍光染色によって決定された染色された関連モーターと生きた貨物の動きを相関させるために、クラフトとも呼ばれる時間の経過に伴う貨物の動きのプロットに位置合わせされます。最後のステップは、モーター共局在と呼ばれるカスタム開発されたMATLABソフトウェアパッケージを使用して、カーゴとモータータンパク質のサブピクセル位置を決定することです。このソフトウェアは、各貨物とモーターの位置の正確なXY座標、および貨物とモーターに関連する蛍光強度の相対量を提供します。最終的に、サブピクセル解像度レベルでの実車および固定貨物およびモーターの蛍光顕微鏡法の相関関係は、移動の方向性がわかっている特定の貨物に関連するモーターのタイプに関する情報を提供します。したがって、この方法は、エクソン輸送のメカニズムについての洞察を提供します。これは、マイクロト卵管ダイナミクス中のタンパク質とマイクロチューブへの結合やエンドサイトーシス中のタンパク質の動員など、生命顕微鏡と免疫蛍光染色を関連付ける他の研究にも適用できます。この方法を視覚的にデモンストレーションすることで、特殊なセットアップが必要なため習得が難しい可能性のあるイメージング固定および解析ステップを実行するのに役立ちます。この手順のためのマウス海馬初代ニューロンは、プロトコルテキストに記載されているように調製され、神経基底卵の成長に再懸濁されます。マイクロ流体デバイスのニューロンをプレートするための媒体。マイクロ流体リザーバー1と1プライムから培地を取り出します。20マイクロリットルの細胞をマイクロ流体リザーバー1に適用し、それらが流れるのを待ちます。デバイスを摂氏37度のインキュベーターに5%CO2で20分間置きます。顕微鏡で観察して、細胞が覆われたガラスに付着していることを確認します。すべてのリザーバーを補充するための成長培地であるニューロ基礎を追加します。9日目までに細胞を含むデバイスをインキュベーターに戻します。培養では、ニューロンはマイクロチャネルを介して軸索を伸ばし、蛍光タンパク質の発現のためのトランスフェクションの準備ができています。トランスフェクションしたマウス海馬初代ニューロンのライブイメージングは、摂氏37度のインキュベーターとCO2制御チャンバーを備えた倒立型エピ蛍光光学顕微鏡で行います。この手順を開始するには、100 x oil 対物レンズを選択します。対物レンズにオイルを塗布し、マイクロ流体デバイスで成長した海馬ニューロンの入ったカバースリップを顕微鏡ステージに取り付けます。ニューロンの死を避けるために、サンプルを顕微鏡で1時間以内に保つように迅速に作業してください。マイクロ流体チャンバーのチャネルを通って伸びるトランスフェクション細胞の軸索を見つけます。トランスフェクションされた軸索が見つかったチャネルの数を記録します。ハンドタリーカウンターを使用してチャンネル数をカウントし、ライブの動きを最適に記録し、その後の共局在分析を行います。チャネルを介して比較的平坦に成長する軸索を選択して、ほとんどの小胞のイメージングを焦点を合わせて実行できます。chmグラフト上の移動軌跡を持つ固定画像のその後の整列を容易にするため。イメージング中は、マイクロチャネルの右端を視野に合わせます。ライブイメージング中に細胞をうまく固定するためには、固定液を追加する1人と焦点を調整するもう1人の2人で行うのが最適です。また、すべての試薬を準備し、手の届くところに置いておくことも重要です。1ミリリットルのプラスチック製トランスファーピペットを使用。リザーバー2と2から媒体の大部分を取り出します Prime Startは、分析対象の貨物の輸送ダイナミクスに固有のタイムラプス仕様でライブ貨物の動きをイメージングします。十分なライブ動作データが収集されたら、1人の人にリザーバー2と2プライムを予温固定剤で満たしてもらいます。マイクロ流体デバイスに触れると、ライブイメージングの焦点が乱れるため、触れないでください。固定剤を追加している間、相手にピントを調整してもらいます。同様に、リザーバー1つと1つのプライムを固定固定で満たすと、動きの即時停止が観察されると成功します。続いて、固定ニューロンを内因性モータータンパク質に対する抗体で染色し、プロトコルテキストに記載されているように画像化します。貨物マッピングを開始するには、画像分析ソフトウェアを使用して貨物の動きのクロモグラフを生成します。Rich Dorf Insightsが開発したImage Jプラグインは、市販のグラフィックソフトウェアを使用してクラフトを生成するために推奨され、貨物の免疫蛍光画像を貨物の動きのCHMグラフに手動で位置合わせし、貨物の点をchmグラフの軌道の位置に重ね合わせ、各貨物点がCHMグラフ上の特定の軌道に対応するようにしました。最適な位置合わせ結果を得るには、マッピングされた貨物に対して最も焦点が合っているZスライスを使用します。Z スタック内の各画像に対して、複数の Z スライスを使用できます。確立されたアルゴリズムを使用して、各蛍光点の XY 座標と強度振幅を決定し、2D ガウス分布を 3 つのチャネルのそれぞれの点源を表す点像分布関数に適合させます。XY 座標を取得するために、Yakima DONA 氏らが開発したガウス近似アルゴリズムを、移動軌跡または静止軌道にマッピングされた個々の貨物の時間ごとに組み込んだ、Motor Colocalization と呼ばれるカスタムビルドの MATLAB ソフトウェア パッケージが開発されました。Kogグラフで、モーター共局在プログラムの結果からXY座標と強度振幅を選択します。いくつかのZack画像を使用して、異なる焦点面にあるより多くの貨物をマッピングします。マッピングされた貨物の個々のXY座標を、対応するZスライスの各モーターチャネルで取得されたXY座標と比較します。貨物の半径300ナノメートル以内にあるXYモーター座標を決定し、選択し、同じ焦点面内で信号を送った貨物とモーターを選択します。モーター共局在ソフトウェアパッケージを使用して、半径300ナノメートル以内にある時間軸を決定します。カーゴマッピングを使用して、黄色の蛍光タンパク質またはY-F-P-P-R-P-Cでタグ付けされた正常なプリオンタンパク質を運ぶ小胞の輸送を、軸索中のキネシンおよびダインモーターの相対量と関連付けました。このグラフはF-P-P-R-P-C小胞の動きを示しており、点線はライブイメージング中の固定時間を示しています。固定されたY-F-P-P-R-P-C小胞の蛍光画像、およびキネシン軽鎖oneとdineの対応する免疫蛍光画像がクロモグラフに整列されます。この拡大図は、2D Gian関数が割り当てられた3つのチャンネルのそれぞれの免疫蛍光シグナルを示しています。このグラフは、野生型ニューロンとキネシン重鎖を欠くニューロンにおけるY-F-P-P-P-R-P-C小胞、キネシン軽鎖1、および食事の間の共局在の定量化を表しています。Y-F-P-P-R-P-C小胞に関連するキネシン軽鎖oneとdineの相対量は、ガウス振幅から取得され、相対的な運動量と運動の方向性との間の可能な相関関係を精査するためにプロットされます。野生型ニューロンからのこの例は、動いているか静止しているY-F-P-P-R-P-C小胞が、移動しているか静止しているか、KINESIN軽鎖1本または食事、または両方と会合することを示しています。この技術を習得すると、3日以内に実行できます。約10日間のマイクロフィリックデバイスや一次神経細胞のEMイメージング前作製に加え、3日以内に免疫蛍光染色のライブイメージングやデータ解析ができるようになります。このビデオを見れば、マイクロ流体デバイスで成長した蛍光標識されたカーゴとニューロンのライブ運動を記録する方法について十分に理解できるはずです。イメージング中にC細胞を固定する方法、サブピクセル解像度としての共局在を解析する方法、カーゴと分子モータータンパク質の共局在とカーゴの動きとを相関させる方法。

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神経科学

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Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

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学ぶ軸索内貨物輸送における分子モーター蛋白質の構成と移動方向性の相関解析。マウス海馬ニューロンを用いたカーゴマッピング法で、蛍光顕微鏡とMATLABソフトウェアによりサブピクセル精度の共局在解析を実現する。

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

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