Name: 緑膿菌誘発肺傷害モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶ Pseudomonas aeruginosa気管内投与によるマウス肺炎誘発肺傷害モデル。肺炎症、細胞死、肺胞バリア変化の観察と修復メカニズムの解析に応用可能です。

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この作業は、国立衛生研究所の助成金HL105947-01(YL)、HL07829-16(AM)、HL090152(AM)によって支援されました。

動物実験は、イリノイ大学シカゴ校の動物ケア委員会と制度バイオセーフティ委員会によって承認された。 注：マスク、目の保護、ガウンやジャンプスーツ、ダブル手袋：シュードモナスを含むすべての手順は、バイオセーフティレベル2（BSL2）が含まれるが、これらに限定されない慣行、で行われるべきである。認定された安全キャビネットで働いています。漂白剤や消毒剤をベース二酸化塩素との細菌に接触して楽器を扱う。輸送サンプルに対して密封されたボックスを使用します。 1. P.緑膿菌文化と成長<ol><li>ストアP. -80℃で凍結バイアルスクリューキャップの細菌株として緑膿菌 PA103。 </li><li> 70％エタノール湿らせたペーパータオルでボックス内のラックにバイアルを置き、バイオセーフティレベル2（BSL2）の研究室に連れて行く。 </li><li>ストリークヒツジ血液寒天プレート上に細菌やインキュベーターで15時間〜37℃で生育する。 </li&gt; <li> BSL2フードでは、5ミリリットルPBSに細菌ループおよび再懸濁したプレートからの細菌を傷つける。 </li><li>最大3ヶ月間、4℃での在庫を保管してください。しかし、2週間ごとに力価を決定。 </li><li>シリアルに（通常は1：10 4〜1時10分〜7）をPBS中の細菌を希釈し、羊血液寒天プレート上の既知の希釈をプレートアウト。 </li><li> 〜15時間プレートをインキュベートします。コロニーをカウントし、細菌濃度を決定するために、コロニー形成単位（CFU）を計算する。 </li><li>適切な濃度を再懸濁（〜5×10 3 CFU /μl）を1.5ミリリットルの滅菌スクリューキャップのクライオバイアル中で0.5mlのPBSで。クリオバイアルを密封し、スナップのふたボックス内の消毒ラディンペーパータオル上クライオバイアルラックに配置します。 </li><li> BSL2動物施設にあるボックスを輸送。かつてそこに、BSL2キャビネットにボックスを開きます。 </li></ol> 2. P.緑膿菌点眼<ol><li>無菌的に生存手術を行う（滅菌手袋、滅菌楽器、および無菌技術）。滅菌（オートクレーブ処理）手術器具のために働いて表面を提供するために滅菌ドレープを使用してください。各気管点滴注入手順の間にホットビーズ滅菌器を使って楽器を殺菌。 </li><li>麻酔の前にマウスの重量を量る。腹腔内に0.2mlのPBS（腹腔内 ） -ケタミン0.1におけるた（100mg / kg）を、キシラジン（5mg / kg）でマウスを麻酔。つま先のピンチに対する非応答性によって麻酔薬の有効性を判断する。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li> BSL2キャビネットに外科ボードにマウスを拘束。 </li><li>カットダウンのための領域を識別します。この領域を剃ると3回アルコールとポビドンヨード綿棒を交互に使用して皮膚を準備します。 </li><li>この麻酔は、そのような気管にアクセスするための皮膚切開などの小手術のために十分であるように局所麻酔薬（リドカイン）で切開領域を扱う。 </li><li>首の正中線で小切開（約5mm）を行い、鈍Fを使用優しく気管へのアクセスのために筋肉を動かすためorceps。外科的切開により気管を公開します。 </li><li> 27 Gの針を1ミリリットル使い捨て注射器への菌液を描画します。各マウスについて、適切な濃度（10 5 CFUまでの各マウス）での細菌の20〜30μlの管理。 </li><li>気管内に針を挿入します。気管にゆっくりとソリューションを注入する。 </li><li>通常、その解決策を示している動物のあえぎが、肺に達していることを確認してください。 </li><li>無菌条件下で無菌縫合糸（6-0モノフィラメント）で傷口を閉じます。 </li><li>術後疼痛を制御するため術後鎮痛としては0.1mg / kgを皮下注射によりブプレノルフィンを使用してください。 </li><li>切開の閉鎖に初期麻酔導入から所要時間が15分未満であることを確認してください。 </li><li>注入後、適切なバイオハザードシャープコンテナに注射器や針の処分。 </li><li> DISIベースの二酸化塩素と手術器具を扱うnfectant 15分間、すすぎ、殺菌のために実験室に戻り、必要に応じて再利用します。 </li><li>ハウス暖かい環境できれいなケージで単独でのマウス。 </li><li>それは意識を取り戻し、動き出すまで、動物に30分ごとにチェックします。以降の最初の3日間、手術後12時間の間隔で。 </li><li>実験を通して、動物のBSL2施設でマウスを保管してください。密封されたボックスに含まれている唯一の組織が動物BSL2施設を残していることを確認してください。マウスが瀕死行動のいずれかを表現した場合の研究中の任意の時点で（呼吸困難、嗜眠、穏やかな刺激に応答して歩き回るの失敗として定義される）、頸椎脱臼に続くボトル源からCO 2吸入によりマウスを安楽死させる。 </li><li>麻酔下で放血によって実験対象を安楽死させる。 <ol><li>安楽死させたマウスからの肺組織を収集します。 BSL2フード内でこれらの手順を実行します。必要に応じて、RACに配置された密封されたチューブを使用してサンプルを転送さらにプロセスのスナップ蓋ボックス内の消毒ラディンペーパータオル上Kである。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで記述するシュードモナスマウス肺損傷モデルは、急性肺損傷または肺炎を以下起こる炎症、肺損傷、修理、および解像度の全体のプロセスを模倣。それは、臨床的に関連して比較的安全で、取り扱いが容易であるという点でいくつかの他の損傷モデルと比較独自の利点を有している。 手順における重要なステップは、菌液の注入が非常に遅くする必要があるということである。注射が速すぎる場合には、マウスは、チョークにより死亡する可能性がある。成功した注射の後、マウスは通常、粒子が肺に入る細菌を助けるいくつかの深い呼吸するとあえぎを示す。 私たちが使用した株は、PA103 6であった。このモデルの重要な点の一つは、Pの力価緑膿菌は、厳密に制御する必要がある。 Pのバッチ異なるソースからの緑膿菌は、さまざまな炎症の程度や損傷さえ示すことができた同じCFUで使用。従って、細菌のすべての新しいバッチ（ 等炎症、細胞増殖、など）、それらの原因となる効果につ...

肺は、環境病原体に暴露し、炎症および損傷1-3の影響を受けやすいされている。そのような肺炎または成人呼吸窮迫症候群（ARDS）のような病理学的状態の間、白血球により放出され、病原体だけでなく、炎症性因子は肺胞細胞1-3の傷害や死を誘導する。これは、傷害の病理の研究、ならびに修復のメカニズムを容易にするために、急性肺損傷の動物モデルを開発することが重要である。 現在、ほとんどの人は高酸素性ブレオマイシン誘発マウス肺損傷モデル4を使用しています。しかし、高酸素のメカニズムは、傷害が肺炎またはARDS 5中に発生する最も一般的な肺損傷と同じではありませんが原因。ブレオマイシン誘発性急性損傷は、臨床コンテキスト4はまれである。ここでは、Pの気管内注射を用いてマウスの肺損傷モデルを報告緑膿菌 6,7。このモデルは、臨床的に関連であり、pを模倣肺炎8下記起こるrocesses。 免疫無防備状態の個体の日和見、院内病原体、Pとして緑膿菌は通常、肺の気道、尿路、火傷、傷に感染し、また他の血液感染症6が発生します 。細菌は病原性因子毒素Aをリリース、6免疫応答を乗算し、トリガします。 P.のイントラtrachael政権緑膿菌、肺炎を引き起こす細菌にヒトへの暴露の状況を反映しており、病理学は、最近報告されたインフルエンザウイルスH1N1誘発性肺傷害モデル9とは異なる可能性が高い。 P.以来緑膿菌は、より病原性の病原体の一部に比べて取り扱いが比較的安全であり、日和見病原体である。私たちはこの方法はと比較して、肺の遠位肺胞領域へより多くの細菌を導入することが観察されるためここでは、細菌を投与するために気管内注入を使用そのような口を介してカテーテルを使用するなど、いくつかの他の手順。 他の急性肺損傷のモデルと比較して、P.ここで説明緑膿菌モデルは、細菌によって、過剰な炎症によって誘発される肺損傷を研究するのに適している。 P.を使用する他の動物モデルとは異なり緑膿菌は、ここでは、ローカライズされた急性肺損傷を誘導するために、これらの細菌の気管内注入を使用して、敗血症10,11を誘導した。

<table><tbody><tr><td>麻酔薬:ケタミン、キシラジン、リドカイン、ブプレノルフィン</td><td></td><td></td><td>医薬品グレード</td></tr><tr><td>27 G針</td><td>フィッシャー</td><td>1482648</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>フィッシャー</td><td>14823434</td><td>1ml</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>縫合&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー19-037-526</td><td></td></tr><tr><td>アイゲージ、グローブ、ガウン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二酸化塩素ベースの消毒剤</td><td></td><td></td><td>クリドックス</td></tr><tr><td>羊血液寒天プレート&nbsp;</td><td>メデックスサプライ</td><td>HL-1160</td><td></td></tr></tbody></table>

緑膿菌誘発肺傷害モデル

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

ヒト急性肺損傷及び肺炎を研究するためには、この疾患の多様な病理学的特徴を模倣する動物モデルを開発することが重要である。ここでは、細菌、緑膿菌 （ 緑膿菌またはPA）の気管内注射によるマウス肺損傷モデルを開発した。このモデルを用いて、損傷の初期段階での肺の炎症を示すことができた。また、肺胞の上皮バリア漏出が気管支肺胞洗浄（BAL）を分析することによって観察された。肺胞細胞死が負傷肺から調製した組織を用いたTUNELアッセイにより観察した。損傷後の後期では、我々は、修復プロセスに必要な細胞の増殖を観察した。損傷は7日、P開始から解決した緑膿菌注入 。このモデルは、肺炎の間、肺の炎症、損傷および修復の順次コースを模倣。この臨床的に関連する動物モデルは、fは、修復のメカニズムを病理を研究するのに適している急性肺損傷をollowing、また、この疾患の潜在的治療剤を試験するために用いることができる。

72時間後、P - 24から出発緑膿菌インジェクション 、細胞性の増加は、（ 図1A-D）肺切片において観察された。肺は、96時間後に損傷（ 図1E）から回復し始めた。 7日目にPを投稿する緑膿菌 、正常な肺胞の形態は大部分が（ 図1F）を回復した。 24時間後、P。で調製肺切片を用いたトンネル染色緑膿菌は、肺胞細胞（ 図1G-I）における細胞死を示した。この傷害モデルにおける修復過程を研究するために、BrdUをP.ポスト3日目にマウスに注射した緑膿菌 。肺は、5時間後のBrdU注入で分離およびBrdU抗体染色のために処理した。 図1J及びKに示されるように、有意に72時間後にPでBrdUを取り込んだ細胞の数を増加させ過剰増殖を示す緑膿菌の管理。 <...

私たちは、緑膿菌の気管内注射によるマウス肺損傷モデルを開発しました。このモデルは、肺炎時の肺損傷を模倣しており、臨床的に関連しています。

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

この手順の全体的な目標は、シュードモナス好気剤投与により、マウスの肺炎、肺損傷状態を模倣することです。これは、最初に注射に適した濃度でシュードモナスを調製することによって達成されます。第2ステップでは、マウスの気管を慎重に露出させ、次に細菌を気管内注射によって肺に投与します。最後のステップでは、マウスの疾患の進行を注意深く監視します。最終的に、肺の炎症、肺胞関門の細胞死の変化、および肺の修復は、シュードモナス・アエロゲンを注射したマウス肺で研究することができます。この技術の意味は、肺炎によって引き起こされる急性肺損傷の治療にまで及びます。このモデルは、肺炎に続くプロセスを模倣しているように、pアエロゲンのクォートを作成するために、インストールのためのPA 1 0 3は、マイナス80°Cから細菌のクライオバイアルを輸送することから始まり、バイオセーフティレベル2またはBSL 2実験室に70%エタノール濡れたペーパータオルで裏打ちされたボックス内のラックに保管します。次に、BSLの2つのフードストリークの下で、P aerogen PA 1 0 3細菌のコロニーを羊の血液寒天プレートに付着させ、摂氏37度のインキュベーターでコロニーを成長させます。約15時間後、バクテリアループを使用してコロニーを5ミリリットルのPBSに移します。次に、より多くのPBSで細菌を1〜10、4〜10、1〜10の7つの濃度プレートに連続的に希釈し、新鮮な羊の血液寒天プレートに希釈します。次に、さらに約15時間のインキュベーション後、各プレートのコロニー形成単位を計算して、細菌濃度を決定します。次に、Eloquaは、1.5ミリリットルのPBSの0.5ミリリットルに細菌の適切な量、滅菌スクリューキャップクライオバイアル、その後、BSLの2つのキャビネットのスナップ蓋ボックスの消毒剤を積んだペーパータオルにクライオバイアルラックに密封されたバイアルを置き、やさしく拒否軟膏の作業で動物の目を覆います。切開部をすばやく剃り、アルコールとポビドンヨードの綿棒を交互に3回使用して皮膚をきれいにし、つま先で鎮静を確認します。局所麻酔薬で皮膚を治療した後、マウスを手術用ボードにつまんで拘束します。次に、動物の首の正中線に5ミリメートルの小さな切開を行い、鈍い鉗子を使用して筋肉をゆっくりと動かし、気管にアクセスします。気管が露出したら、27ゲージの針を備えた1ミリリットルの使い捨て注射器に、20〜30マイクロリットルのPBS中の細菌の5つのコロニー形成単位に1倍10を1倍まで引き込みます。.次に、針を気管に挿入し、溶液をゆっくりと注入します。動物があえぎ声を上げるようにしますが、これは通常、溶液が肺に到達したことを示しています。次に、6 つのゼロ モノフィラメント滅菌縫合糸で創傷を無菌的に閉じ、術後鎮痛剤を投与します。次に、各動物が注射された後、注射器と針を適切なバイオハザード鋭利物容器に廃棄します。マイヤーズは、暖かい環境の中で清潔なケージの中で一人でどのように過ごしていますか?動物が意識を取り戻し、動き始めるまで、30分ごとに動物を確認します。手術器具を二酸化塩素消毒剤で15分間治療します。その後、必要に応じてツールをすすぎ、ラボに戻し、さらに滅菌します。実験全体を通してBSLの2動物施設にマウスを収容し、麻酔下で放血した後、BSLの2つのフードの下で各動物から肺組織を採取します。最後に、さらなる処理が必要な場合は、消毒剤を積んだペーパータオルをスナップ蓋ボックスに入れたラックに置いた密封チューブ内のサンプルを適切な処理施設に移します。この代表的な実験では、Pエアロゲン注射後24〜72時間で、肺切片で細胞性の増加が観察されます。96時間後には肺は回復し始め、7日後には肺胞の形態はほぼ回復します。P エアロゲン設置の 24 時間後に調製された肺切片のトンネル染色では、修復プロセスを研究するために肺胞細胞内で細胞死が見られます。この傷害では、モデルBRDUをpエアロゲン投与の3日後にマウスに注射することができます。図示されるように、pエアロゲン処理動物は、対照処理動物と比較して肺組織において過剰増殖を示す。損傷後のバリア、透過性、炎症の変化を研究するために、気管支肺胞洗浄または腸液をさまざまな時点で収集できます。例えば、pエアロゲン注射後、腸内のタンパク質濃度は、細菌の設置後48時間で有意に増加し、細胞数の上皮バリアの漏れを示す。このとき、腸も大幅に増加し、Pエアロゲン注射後4〜5日で炎症反応が起こり、腸タンパク質レベルと細胞数の両方が減少し始め、回復を示唆しています。さらに、好中球引力に関与するサイトカインであるマクロファージ炎症性タンパク質2のレベルは、48時間で大幅に増加し、96時間で基礎レベルに戻ります。pエアロゲンを含まない肺溶解物では、腸液中に少数の単球のみが観察されます。対照的に、腸内には多数の好中球が存在し、注射後48時間で分離されます。96時間までに、腸の細胞組成はこの手順に従って制御レベルに戻ります。組織学的、切片化、気管支肺胞洗浄収集などの他の方法を実行して、急性肺損傷後の炎症と修復に関与している細胞または因子などの追加の質問に答えることができますか?

pseudomonas-aeruginosa-induced-lung-injury-model

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