MALDI-TOF質量分析およびカスタムデータベースを使用すると、ユニークな洞窟環境（カーチェナー洞窟、AZ、USA）を常在菌を特徴づけるために
2015年1月2日
この作業は、MALDI-TOF MSを使用して細菌を迅速に同定するための手順を詳述しています。同定手順には、スペクトル取得、データベース構築、およびフォローアップ分析が含まれます。類似係数ベースの方法とバイオマーカーベースの方法の2つの同定方法が提示されます。
この手順の全体的な目標は、MALDIを使用したライブラリベースの細菌同定から質量分析への詳細な手順を開発、適用、および実証することです。これは、まずマロフ質量分析計を使用して細菌の質量スペクトルを取得することによって達成されます。この研究では、腐食性環境から単離された15種類の細菌の質量スペクトルを収集し、分析した細菌のピーク形状、特徴的なパターン、またはフィンガープリントを収集します。
その後、これらのマススペクトルをソフトウェアにインポートし、モデルデータベースを構築します。次に、モデルデータベース内の参照マススペクトルを、クラスター分析、ピークマッチング、および統計分析を使用して処理および分析します。最後に、これら 15 種類の細菌から無作為に選択されたブラインドコード細菌の質量スペクトルを再度収集し、同定結果を得るためにモデルデータベースの参照スペクトルと比較すると、類似性係数または潜在的なバイオマーカーとピーククラスに基づいて細菌を正しく同定できることが示されています。
この手順は、生細胞を含まない1マイクロリットルのタンパク質抽出物をステンレス鋼のマルディターゲットプレートに沈着させ、乾燥させることから始めます。次に、乾燥したタンパク質抽出物に1マイクロリットルのマトリックス溶液を重ねて乾燥させます。次に、乾燥後に1マイクロリットルのCBR標準をターゲットプレートに堆積させ、CBRに1マイクロリットルのマトリックス溶液を重ねて乾燥させます。
最後に、2マイクロリットルのマトリックス溶液をネガティブコントロールとしてターゲットプレートに堆積させます。窒素レーザーを搭載し、ブルカーのフレックス制御ソフトウェアを使用して操作するマルチ-質量分析計を使用します。500回のレーザーショットを100ショット刻みで蓄積することにより、各マススペクトルをポジリニアモードで収集します。
イオン源の1つの電圧を20に、キロボルトをイオン源に、2つの電圧を18.15キロボルトに、レンズの電圧を9.05キロボルトに設定します。これらのパラメータは機器固有であり、最適化が必要な場合があります。質量を電荷範囲に設定して、電荷あたり2〜20キロダルトンの自動スペクトル評価を行います。
次に、最小解像度のしきい値を 100 に設定します。OIDピーク検出アルゴリズムを選択します。信号対雑音比のしきい値を 2 に設定し、最小強度のしきい値を 100 に設定します。
最後に、データベース設計のためにピーク累積を 500 に設定します。新しいデータベースウィザードを使用して、bio numerics 7.1で新しいデータベースを作成します。次に、実験タイプパネルのコマンドを使用して、maldi などのスペクトル実験タイプを作成します。
次に、データベース設計パネルを使用してレベルを作成し、データベースメニューに移動して、ここでlevel add new levelコマンドを使用して新しいレベルを追加します。種レベル、生物学的複製レベル、技術レベルを作成します。生の質量スペクトルをインポートします。
まず、flex解析を使用して、ファイルメニューをナビゲートし、mass spectrumのエクスポートコマンドをクリックして、生のマススペクトルをテキストファイルとしてエクスポートします。次に、生の質量スペクトルをテクニカルレプリケートのレベルでデータベースにインポートします。生の質量スペクトルを前処理するには、2 次フィッティング アルゴリズムを使用してインポートおよび再サンプリングします。
次に、サイズが 50 ポイントのローリング ディスクを使用してベースライン減算を実行し、連続ウェーブレット変換または CWT を使用してノイズを計算します。ウィンドウ サイズが 20 ポイント、ベータが 10 ポイントのカイザー ウィンドウを使用してスペクトルを平滑化します。次に、200ポイントのサイズのローリングディスクを使用して2番目のベースライン減算を実行します。
最後に、各質量スペクトルの安全な特性パターン(ピークサイズ、ピーク強度、S/N比を含むピークリストなど)を前処理した後、CWTを使用して最小S/N比10のピークを検出します。次に、解析メニューのsummarizedコマンドを使用して、前処理されたスペクトルから複合マススペクトルを作成します。ターゲットレベルとして生物学的複製を選択します。ここは。
同じコロニーの 10 回のテクニカルレプリケートのマススペクトルを組み合わせて、そのコロニーの複合マススペクトルが得られ、生物学的レプリケートレベルでその分離物の 3 つの複合マススペクトルが得られます。最後に、3 つの複合スペクトルを要約して、その分離に対して種レベルで 1 つの複合スペクトルを作成します。類似性に基づくクラスター分析と多次元スケーリングを実行するには、色付きのグループを作成します。
まず、3つの生物学的複合質量スペクトルを選択し、グループのメニューにある「選択から新しいグループを作成」コマンドをクリックして、対応する分離物のグループを作成します。次に、これら3つのマススペクトルに自動的に使用される色を設計します。クラスター分析を実行するには、クラスタリング メニューをナビゲートし、[クラスター解析の計算] コマンドをクリックします。
比較設定の 1 ページで、ピアソン相関を選択し、他のパラメーターは既定値のままにします。2 ページで、算術平均を使用した非加重ペア グループ法を選択します。次に、[完了]をクリックします。
統計メニューの多次元尺度構成法コマンドを使用して多次元尺度構成プロットを取得し、ピーク マッチングを実行します。実験パネルでスペクトルタイプmaldiをクリックします。次に、レイアウトを選択します。
画像を表示、スペクトルの個々のピークが表示されます。次に、スペクトルメニューの「ピークマッチングを行う」コマンドを使用してピークマッチングを実行し、ピーククラスを特定し、「統計マトリックス」をクリックして二元配置クラスタリングを実行します。採掘。ピーククラスに一致したピークの強度は、類似係数ベースの方法を使用して細菌を同定するためのヒートマップとして表され、クラスター分析で実施されるようなテクニカルレプリケートレベルでの質量スペクトルに基づいて比較を作成し、類似性の比較のためにログラムを保存します。
未知の質量スペクトルを選択し、解析をクリックします。選択したエントリを特定します。識別ダイアログボックスが表示されます。
比較ベースの分類子タイプを選択し、[次へ] をクリックします。次のページで、保存したグラムを参照比較として選択し、[次へ] をクリックします。識別方法として基本的な類似性を選択し、再度[次へ]をクリックして、スコアリング方法として最大類似性を選択します。
各パラメータの適切なしきい値と最小差値を入力し、[次へ] をクリックします。計算が完了すると、結果パネルに識別ウィンドウが表示されます。データベースの中で、未知に最も一致するメンバーがリストされます。
クラスタリング分析に基づくログラムは、データベース内の各分離物間の類似性を示します。データセットには、15 の異なる種のスペクトルが含まれており、各種には 3 つの複合スペクトルが含まれています。二元配置クラスター解析は、研究者が種または種内の株の潜在的なバイオマーカーを特定するのに役立ちます。
ここでは、ピーク強度は色で表され、緑は低強度、赤は高強度を意味します。最後に、これらの分析に基づいて、未知化合物の質量スペクトルをグラムと比較し、類似係数に基づく同定が達成されます。
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概要
本研究では、MALDI-TOF MSを用いた細菌の迅速同定の手順について詳細に説明します。同定の手順には、スペクトルの取得、データベースの構築、および追跡解析が含まれます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 質量分析法
- 細菌同定
背景
- MALDI-TOF MSは細菌同定のための強力なツールである。
- マススペクトルは、細菌の特性パターンまたはフィンガープリントを提供する。
- 正確な同定にはデータベースの構築が不可欠である。
- 統計解析により、同定法の信頼性が向上する。
研究目的
- ライブラリに基づいた細菌同定の詳細な手順を開発する。
- 細菌同定におけるMALDI-TOF MSの有効性を実証する。
- マススペクトルに基づく異なる同定方法を比較する。
使用された手法
- MALDI-TOF質量分析計を用いた細菌からのマススペクトルの取得。
- 参照マススペクトルによるモデルデータベースの構築。
- クラスター分析およびピークマッチングを用いたスペクトルの処理と解析。
- 同定のための、ブラインドコード化された細菌と参照スペクトルの比較。
主な結果
- 類似性係数を用いることで、細菌を正確に同定することができます。
- 潜在的なバイオマーカーとピーククラスが、同定の助けとなります。
- 統計解析により、同定手法の正確性が裏付けられています。
- 結果は、細菌同定におけるMALDI-TOF MSの信頼性を実証しています。
結論
- MALDI-TOF MSは、迅速な細菌同定のための有効な手法である。
- 類似度係数に基づく方法とバイオマーカーに基づく方法のどちらも有効である。
- 正確な結果を得るためには、データベースの構築と解析が極めて重要である。
よくある質問
産業界への影響
MALDI-TOF 質量分析法は迅速な細菌同定を可能にし、信頼性の高い属および種レベルの特性解析を提供することで、抗菌薬探索における初期段階のターゲット検証を支援します。この手法は、標準化されたスペクトルフィンガープリントとデータベースによる比較を通じて、微生物スクリーニングワークフローにおけるメカニズム的な曖昧さを低減します。このアプローチは、微生物株の分化について再現性のある定量的なアウトプットを提供することで、リード化合物同定パイプラインにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：環境分離物における微生物の同一性を明らかにすることで、治療仮説を検証する。
- 運用の価値：再現性のある属および種レベルの同定を通じて、生物学的リスクの低減を支援する。
- 予測的価値：洞窟由来のマイクロバイオームにおいて病原性株と非病原性株を区別することで、ポートフォリオの優先順位付けを可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： スペクトルフィンガープリント法を用いて、下流の抗菌剤スクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを調製します。
- 運用的価値： ピークマッチングとクラスター分析により、アッセイの標準化と再現性を確保します。
- 拡張性： 繰り返し行われるスクリーニングキャンペーン向けにカスタムデータベースを構築することで、プラットフォームの再利用を容易にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：種レベルの同定を通じて、環境微生物の発見から前臨床検証までを繋げます。
- バイオマーカーの整合：ピーククラス解析により、株特異的な追跡のための潜在的なバイオマーカーを特定します。
- リスク調整済み進展：化合物テストの前に微生物の同一性を確認することで、go/no-go判断に根拠を与えます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、微生物の同定による仮説検証を可能にし、再現性のあるスペクトルデータを用いてリード化合物の同定を支援し、さらに株特異的なバイオマーカー検出を通じて前臨床段階の意思決定に情報を提供することで、初期の創薬ワークフローに統合されます。
- 探索生物学： 特殊な環境から自生細菌を特定することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 複合質量スペクトルおよびピーク強度マッピングを通じて、アッセイの準備状況と定量的なアウトプットを提供します。
- 分析： 条件比較のための類似度係数やヒートマップなどの統計的アウトプットを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 種レベルの同定とバイオマーカーの整合性を通じて、発見から前臨床研究への橋渡しを行います。
- エンタープライズ再利用： カスタムデータベースの構築により、プロジェクトを跨いだ反復的なスクリーニングを可能にする再利用可能な機能を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 予測の信頼性向上、ターゲットの検証、微生物スクリーニングにおけるメカニズムの曖昧さの解消。
- 運用的価値： 同定ワークフローの標準化、再現性、および拡張性の向上。
- 戦略的価値： 抗菌剤開発プログラムにおける、より適切なgo/no-go判断、資本効率の向上、および後期段階における生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： 確認された微生物の同定に基づく、リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定。
実施上の検討事項
- 質量分析、バイオインフォマティクス、および微生物培養の専門知識が必要です。
- MALDI-TOF装置、BioNumericsソフトウェア、およびスペクトル解析インフラストラクチャが必要です。
- スペクトル取得、データベースのキュレーション、およびピークマッチングプロトコルのチーム間標準化が求められます。
- 洞窟分離株以外の多様なモデルシステムに本手法を適用する場合、適応に関する検討が必要となります。
- 正確な同定のためには、高品質なリファレンススペクトルと最適化された前処理パラメータが必要であるという制約があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
1:46
Deposition on the MALDI Target
2:38
Mass Spectra Acquisition Using FlexControl Software
3:56
Database Construction Using Bionumerics Software
6:41
Mass Spectrum Data Analysis
8:24
Bacteria Identification with a Custom Database
9:40
Results: Similarity-coefficient-based Method Can Correctly Identify Bacteria to the Species Level
10:33
Conclusion
