聴覚神経の光遺伝学的刺激

この手順の全体的な目標は、光遺伝学的に改変されたらせん神経節ニューロンを持つ動物の聴覚神経を光学的に刺激することです。これは、最初に青色マイクロLED刺激装置または青色レーザーに結合された光ファイバーのいずれかを準備することによって達成されます。手順の次のステップは、レトロ耳介顕微手術アプローチを使用して蝸牛を評価することです。

3番目のステップは、光学的に誘発された脳幹反応を記録するために光刺激装置を配置することです。最後のステップは、下絨毛にアクセスして、光学的に誘発された活動を記録することです。最終的に、結果は、聴覚脳幹反応と局所電界電位の記録を通じて、聴覚系の刺激が成功したことを示すことができます。

下丘では、監査神経の光遺伝学的刺激。電気に代わるものとして、人工内耳はより優れた周波数と強度の分解能を約束します。これは監査人の研究にとって非常に興味深いものですが、この手法の意味するところは、聴覚障害者の聴力回復の改善にまで及びます。

この方法は、整形外科の発達の改良におけるパターン活性の役割、細胞局在化におけるスペクトル統合の要件、周波数特異的なフレーム投影間の相互作用の程度など、聴覚研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。中枢聴覚系では、マイクロLEDまたは光ファイバーの適切な配置と向きを学ぶのが難しいため、手順の視覚的なデモンストレーションが重要です。マイクロLED刺激装置は、200平方ミクロンのアクティブ表面を持つ青色LEDを使用し、マイクロLEDに最初にワイヤをはんだ付けします。

次に、エポキシを使用してLEDとその接続部をカプセル化し、一晩乾燥させます。硬化したら、外径1mmの範囲でワイヤーを送ります。ケイ酸塩ガラスキャピラリーを借ります。

ガラスは機械的安定性と電気絶縁性を提供します。キャピラリーとエポキシコーティングされたLEDの接合部をエポキシ樹脂でシールし、キャピラリーをマニピュレーターに取り付けられるようにキャピラリーを配置します。次に、電気接続を確認します。

まず、銅線を3本用意します。それぞれの一方の端を0.9%塩化ナトリウム浴に浸します。次に、もう一方の端をABRに接続します amplifier。

オシロスコープで信号をモニタします。次に、マイクロLEDをカスタムメイドの刺激装置に接続してテストします。スティミュレーターに接続されたマイクロLEDをバスに浸し、LEDに少なくとも20分間電力を供給します。

LEDを刺激しながら、オシロスコープのアーティファクトを監視します。障害のあるLEDは廃棄します。生後4〜10週齢のマウスに麻酔をかけます。

このマウスは、大腿部1.2プロモーターの下にチャネルオプシン2を10分間発現させます。麻酔薬を注射した後、動物の離脱反射をチェックして、麻酔の手術面を確認します。その後、目に軟膏を塗り、手術を開始します。

まず、レトロな耳介部分を丁寧に剃り、空気で満たされた中耳の空洞であるブラに近づきます。マイクロ鉗子を使用して、手術側の加熱パッドにマウスをセットします。首の筋肉、すなわち板状突起、胸鎖乳突筋、および鱗片を注意深く解剖します。

次に、ブラを公開します。これは、鼓膜が位置する表面にリングを持つ球状の骨構造です。インスリン針を使用して、穴からリングのすぐ下に穴を開けます。

ブラを覆っている骨を取り除きます。細かいロンとマイクロ鉗子を使用して、蝸牛のプロオーディトリアムを露出させます。次に、蝸牛を始動します。ストーマ。

まず、膜状の迷路を乱さずに骨嚢を削り取ります。次に、ステイン動脈と頂点開口部から遠く離れた2番目の蝸牛ターンで500〜800ミクロンの小さな窓を開きます。頂点は蝸牛を破裂させ、モディを骨折する可能性があります。

光遺伝学的聴覚脳幹反応またはOABRを測定する準備をします。まず、電極をアンプに接続した状態で、耳介の下、頂点、および脚の近くの背面の次の場所に針電極を挿入します。頂点と乳様突起皮下針の間の差電位を増幅します。

50キロヘルツでサンプリングし、トランス蝸牛刺激のために1〜10、000ヘルツの応答をフィルタリングします。マイクロLEDまたはファイバーを取り付け、機械式マニピュレーターで把持されたマイクロLEDと組み合わせます。慎重に所定の位置に配置します。

オシロスコープで差電位を視覚化します。光刺激装置の位置を最適化しやすいように、記録セットアップの近くに置いてください。信号の平均化を使用し、データをコンピューターに保存してオフラインで分析します。

次に、1〜5ヘルツの電流の3〜10ミリ秒パルスへの応答を使用して、マイクロLEDの位置と向きを最適化します。別のオプションは、250マイクロメートルの光ファイバーに取り付けられた473ナノメートルの連続波レーザーによるレーザー刺激です。これには、レーザー出力の高速アナログ制御または光学デバイスが必要です。

高速シャッター位置では、マイクロマニピュレーターでファイバーを直接蝸牛ストーマに装着し、デンタルセメントで固定して蝸牛内刺激を行います。丸い窓からファイバーを s Scala.Tempe に挿入します。1〜5ヘルツで10〜30ミリワットの3〜10ミリ秒のパルスで応答を引き出すことにより、ファイバーの位置と向きを最適化します。

刺激装置の位置決めは、プロトコルの最も重要なステップです。マイクロEDまたは光ファイバーは、OABRが明らかになるまで辛抱強く再配置する必要があります。良好な光遺伝学的聴覚脳幹反応が得られたら、シアノアクリレート接着剤または歯科用セメントで繊維を固定します。

このプロトコルでは、定位固定装置フレームを使用し、下絨毛の上に頭蓋骨を開いてマウスを準備します。顕微鏡を使用して、記録プローブを下眼絩の上に置き、最上部のチャネルが表面でちょうど見えるように挿入します。次に、記録アレイの個々のチャンネルと基準ネジおよび頭頂骨との間の差電位を増幅します。

32 キロヘルツのサンプル レートと 300 ヘルツのローパス フィルターを使用し、データを保存します。最適な蝸牛ストーマは重要であり、実験が成功する可能性を高めます。これは、窓が規則的に小さく、内部の蝸牛構造に損傷がないことを意味します。

例えば、出血は、チャネルRodinの2つのトランスジェニックマウスを用いたSTR ssisの損傷を示す。チャネルロダン2は、蝸牛内の螺旋状ギャングニューロンで発現され、マイクロLEDまたはレーザーによる青色光照射により、振幅と波形の光遺伝学的に音響A BRとは異なる大きな光遺伝学的A BRを誘発します。A BRは、音響ABRオプトジェネティクスよりも振幅が大きくなります。

したがって、A BRは電気的なABRに匹敵します。それらは両方とも、より多くのらせん神経節ニューロンを動員するか、またはらせん神経節ニューロンのより同期した活性化を誘発する可能性があります。聴覚経路を介した活動の伝播は、中央聴覚系の細胞外記録によって確認されました。例えば、蝸牛の光遺伝学的刺激は、聴覚中脳の神経活動を誘発した。

マイクロLED刺激装置の機械的安定性と安全な電気的絶縁、および過剰な炭素流の回避はすべて、蝸牛光遺伝学を成功裏に使用するための重要な要素です。このプロを試みる際には、エボラ出血熱の遠路動脈を傷つけないように注意することが重要です。一度マスタリングすると、下丘からの録音は、適切に実行すれば約3時間で行うことができます。

この手順aに続いて、下丘での単一ユニット記録のような方法が実施できる。聴覚経路の光遺伝学的刺激は、聴覚神経科学の研究が、これまで音響刺激や電気刺激では対処できなかった問題を問う道を開くでしょう。また、この技術が聴覚障害の臨床リハビリテーションに応用されることも期待しています。