Name: 人間の伏在静脈のための手順生体外灌流および外部補強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぼう、人間の伏在静脈を用いた生体外灌流法と外部メッシュ補強による内膜肥厚の抑制効果を評価する手法。この技術は血管生物学と再生医療の研究に応用されます。

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この作品は、SNF [31003A-138528]、OctavとマルセラBotnar財団、ノバルティス財団とエママスチャンプ財団からの補助金によってサポートされていました。私たちは、その優れた技術支援のためにマルティーヌLambelet、ジャン=クリストフシュテーレに感謝します。

ローザンヌ大学の倫理委員会は、ヒト組織の使用のために1983年に改訂され、1975年のヘルシンキ宣言で概説した原理に従っている実験を、承認した。 1人間の大伏在静脈の収穫<ol><li>虚血下肢バイパス手術を受けた患者から非静脈瘤人間伏在静脈の余剰部分を取得します。手術室では、ヨウ素溶液で脚全体を消毒し、足に脚の付け根から足を露出するために患者をドレープ。 </li><li>膝への鼠径部から正中切開を行います（中断された皮膚の部分を残して）。 </li><li>周囲の組織（ノータッチ技術）の椎弓と大伏在静脈を収穫。 4-0シルクネクタイと静脈のセキュアな側枝。すぐにRPMI-1640、G、4℃で9センチメートル2.5〜4ミリメートルの外径と大伏在静脈の長い余剰セグメントの最小値を格納するlutamax培地、12.5％ウシ胎児血清を補充した、実験室に持ってきて。 </li></ol> 2 EVPSデザイン<ol><li> 図1に示されている一般的な機器を組み立てます。すべての機器をオートクレーブ滅菌条件下ですべてのコンポーネントを保つ。また、システムは、防水であり、培地中に化学物質を漏洩しないことを確認してください。表紙にポリメチルメタクリレート（PMMA-GS）を使用します。スチール（X5クロムニッケル18 10）と静脈のサポートなどポリオキシメチレンプラスチック（POM）。 </li><li>静脈との接続の配置を可能にするために所望の形状に灌流チャンバーを設計します。 （円筒構造を使用している場合、または半径）の深さを確認してください、それが培養培地により一定報道（ 図1）と一緒に容器の最小限の屈曲および拡張を可能にするように少なくとも2.5 cmです。シールは、主要な問題であり、長方形のPMMA-GS建設が使用されている理由である。 </li><li>希望geometrに静脈のサポートをデザインyを。静脈よじれや膨満の上を回避するには、（静脈がねじで一緒にねじられるようねじは、その目的のために使用することはできません）押したり引っ張って長さ調節が可能です。 NOTE：L字型（血管に適合するように直径5mm）2静脈シリンダをサポートピース及び静脈（ 図1Bおよび図2）スライド2によって接続されたフルスチールロッドは、ここで使用されている。 </li><li>のp流体柱の= 0-10 = hxをρ×gではp =圧力（N / m 2であり、ペンシルベニア州）は、h =高さ（m）ρ：システムに適用される「静止圧」であることなど、低圧塔を設計する=液体の密度（㎏/ m 3）であり、g =重力定数（9.81メートル/秒2）。上から下へのデザイン4つの接続ダクト、：（静脈へ）、（静脈）からの流出のために、流入圧力を加えると培地交換を可能にするために。 </li><li>メディアを準備します。これまでの研究5,11-14に基づき、12.5グルタマックスを補充した、RPMI-1640]を選択します％ウシ胎児血清および1％抗生物質 - 抗真菌溶液（10,000 U / mlのペニシリンG、プラス10 mg / mlの硫酸ストレプトマイシンを加えた25 mg / mlのアムホテリシンB、プラス0.5 / mlの：ゲンタマイシン）。剪断応力（SS）は3 Qは流速（ml /秒）であるSS = 4μQ/π* rで与えられる、静脈セグメントの半径（cm）のrは、μは灌流媒体の粘度である。 <ol><li> 70kDaのデキストランを添加して粘度を調整することでSSを調節する。粘度計粘度を測定します。ここでは、9〜15ダイン/ cm 2とSSを設定するために、8％の70kDaデキストランを追加します。 </li></ol></li><li> 60パルス/分、圧力システムに適用され、コンピュータによって制御から独立した150±15ml /分の一方向の流れを生成する一定振幅の拍カージオイド信号を誘導するために歯車ポンプを設定する。運転ソフトウェアは一定の取得と監視圧力、流速、脈​​拍数、及び信号を積分いることを確認してください。必要に応じて、第二のポンプを使用します（非同期hronized）非層流、乱流を生成する。 </li></ol> 3 EVPSアセンブリ（図1） <ol><li>開始する前に、すべての機器が滅菌されていることを確認してください。層流フード内で無菌状態の下で、以下のすべての手順を実行します。 </li><li>媒質で満たされたペトリ皿に静脈を置きます。外科用メスを使用して、3等分静脈を分割。 </li><li>すぐに、PBS中の1セグメントをすすぐ。 3部にセグメントを分割し、形態計測のためにホルマリンに1を修正。定量的な転写産物（RT-PCR）とタンパク質（ウェスタンブロット）分析のために他の二つをフリーズします。コントロールとして、これらのセグメントを考慮して、非灌流静脈。 </li><li>灌流2残りのセグメントを使用してください。 <ol><li>非常に穏やかに静脈内に媒体を注入し、通常の流れ方向を決定する;弁の存在下で、静脈が反転される。 </li><li>静脈をシーリング実験成功に最も重要である。担保を通して漏れがないか確認してください。 6-0絹縫合糸を持つ任意のリークを固定します。 </li> &lt;/オール&gt; </li><li>時間（2.3、 図1）での静脈2つの金属シリンダー間のセグメント、一方の端を接続します。くぼみの周りEthibon 3-0（ 図1AおよびB）でシリンダーを固定します。 <ol><li>以前媒質で満たされた灌流チャンバー内に全体を静脈セグメントを配置します。第二のセグメントに対して同じ手順を繰り返します。 注記：正しくシリンダに静脈をシールしないと、漏れの原因となる再介入を必要とし、大幅に感染し、実験失敗のリスクが増加します。 </li></ol></li><li> （メッシュ）第二のセグメントを強化するには、L字型のピース（2.3及び図1）から（添付静脈で）2シリンダーを離します。 <ol><li>やわらかに、任意の楽器と静脈を触れないでください。静脈へのその後のシリンダの最初のメッシュをスライドさせます。プッシュ/プル押し合いは、静脈上のメッシュを取得します。 </li><li>メッシュはJを確保静脈の全面を覆うたらEthibon 3-0とシリンダにacketed静脈。 </li><li> L字型の支持体に静脈/シリンダ化合物を再構成し、以前媒質で満たされた灌流チャンバーに移す。 </li></ol></li><li> 3.2ミリメートルの内径過酸化物で処理したシリコンチューブを使用して、Yスプリッタにそれぞれ金属製の円筒（インおよびアウトフロー）を接続します。 </li><li>チューブの同じタイプを使用して第2のYスプリッタに流出スプリッタを接続します。このYスプリッタからは、両方の血管を通る灌流圧を測定するために一本のチューブを使用しています。閉ループ系（ 図2）を形成するために戻って列に、もう一方を接続します。 </li><li>インキュベーターの内部では、ポンプヘッドに低圧塔を接続するために長い（1メートルの長さ）のチューブを使用しています。 </li><li>他の長尺管を流入Yスプリッタにポンプヘッドを接続することにより設定します（ 図1）完了します。 </li></ol> 4。静脈灌流<ol><li> EVPSアセンブリは、同時された後mpleted、（補充できるように、静脈流出ダクトの下に留まる）培地でカラムを埋める。システムが一杯になるまでカラムに多くの媒体を追加します。 pHが37±0.1℃に維持インキュベーターにすべてのシステムを移動（ヘンダーソン·ハッセルバッハ式に基づいてCO 2 / pHのアルゴリズムを使用して）7.40±0.01で一定に保った。 </li><li>インキュベーターの外歯車ポンプヘッドを持参し、ギアポンプドライブに接続します。アセンブリを固定する棒をねじ込み。 </li><li>ポンプパワーのスイッチを入れ、それが駆動ソフトウェア上で起動しても同様に、すべての区画内に分配される媒体5分を許可していることを確認してください。 </li><li>圧力を監視するには、動脈ラインの監視を使用しています。コンピュータにリンクされた圧力変換器にEVPS圧力出力を（それが動脈カテーテルに相当）を接続します。 <ol><li>チューブが完全に媒体で充填され、任意の気泡を含んでいないことを確認してください。 「動脈リチウムを通じて脱泡培養システムね&quot;チューブ（ 図2）。ディスプレイに注意を払い、60パルス/一定の振幅の分の拍動カーディオイド信号を探します。この時点で、平均圧力0〜10 mmHgでの間である。圧力が&lt;0で、列には、漸進的に（静脈とチューブとの間の静脈担保または不十分なシール）漏れを探して空になります。 </li></ol></li><li>静脈試験用または動脈試験のための90ミリメートルHgで6ミリメートルHgのに最小限の圧力を設定してください。これらの条件下で、空気インジェクタ、カラムおよびシステムに必要な圧力を加える。 </li><li>高圧塔に接続されたチューブを使用して、2日ごとに培地を変更します。圧力変化の損傷を防止するために、最初の列プラグを開く。 </li></ol>灌流の5。完了<ol><li>灌流の3または7日後：インキュベーターからEVPSを取ると静脈をディスマウント。捨てる5mmの近位および遠位静脈が機器に付着し終了します。中央、厚さ5mm厘をカット残りのセグメントからのGSとホルマリンに（形態計測）を固定。残りのフラグメントを凍​​結し、さらなる分子解析のための粉末に減らす。 </li></ol>

<ol><li>Sal Go, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+summary%3A+heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+american+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the american heart association.</a> Circulation. 129, 399-410 (2014).</li>
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<li>Longchamp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+external+mesh+reinforcement+to+reduce+intimal+hyperplasia+and+preserve+the+structure+of+human+saphenous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of external mesh reinforcement to reduce intimal hyperplasia and preserve the structure of human saphenous veins.</a> Biomaterials. 35, 2588-2599 (2014).</li>
<li>Saucy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+pulsatile+perfusion+of+human+saphenous+veins+induces+intimal+hyperplasia+and+increased+levels+of+the+plasminogen+activator+inhibitor+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research.+Europaische+Chirurgische+Forschung.+Recherches+Chirurgicales+Europeennes%22%5BJournal%5D)">Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 45, 50-59 (2010).</li>
<li>Dubuis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atorvastatin-loaded+hydrogel+affects+the+smooth+muscle+cells+of+human+veins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pharmacology+and+experimental%22%5BJournal%5D)">Atorvastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins.</a> The Journal of pharmacology and experimental. 347, 574-581 (2013).</li>
<li>Deglise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+connexin43+expression+in+human+saphenous+veins+in+culture+is+associated+with+intimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Increased connexin43 expression in human saphenous veins in culture is associated with intimal hyperplasia.</a> Journal of Vascular Surgery. 41, 1043-1052 (2005).</li>
<li>Muto, A., Model, L., Ziegler, K., Eghbalieh, S. D., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+vein+graft+adaptation+to+the+arterial+circulation%3A+insights+into+the+neointimal+algorithm+and+management+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal+%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: insights into the neointimal algorithm and management strategies.</a> Circulation Journal : Official Journal of the Japanese Circulation Society. 74, 1501-1512 (2010).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+murine+intimal+hyperplasia+model+founded+on+a+focal+carotid+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis.</a> The American Journal of Pathology. 182, 277-287 (2013).</li>
<li>Berard, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvage+treatment+for+venous+aneurysm+complicating+vascular+access+arteriovenous+fistula%3A+use+of+an+exoprosthesis+to+reinforce+the+vein+after+aneurysmorrhaphy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery+%3A+the+Official+Journal+of+the+European+Society+for+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Salvage treatment for venous aneurysm complicating vascular access arteriovenous fistula: use of an exoprosthesis to reinforce the vein after aneurysmorrhaphy.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery : the Official Journal of the European Society for Vascular Surgery. 40, 100-106 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

この研究は、ヒトの静脈に広範囲血行動態の研究を実行するためのex vivoで静脈灌流システム（EVPS）をuncovers。このシステムは、 生体内で細胞を循環させることによって放出された炎症性悪化や成長因子の非存在下で定義された血行動態パラメータの下に伏在静脈灌流を可能にします。このように、人間の静脈グラフト5,11,12,15におけるIHの制御に関与根底にある経路のより良い理解を提供します。 再現性のある定量化可能な血行力学的摂動は、in vivoで制限されている。いくつかの複雑なネズミ顕微手術手順が記載されている。右総頸動脈及び流出枝連結、ミッドグラフト又は総頚動脈狭窄の追加作成にドナーマウスから大静脈の介在を経由してバイパス同系移植モデルを用いて、流れ、SSは急性減少し、IH 3強化。外側に内向きに改造に対するさらなる相互ことができます遠位総頸動脈狭窄16対半ば焦点を使用してrogated。大型動物（ヒツジ、ブタ、およびヒヒ）では、バイパ...

心血管疾患は、欧米諸国1における罹患率および死亡率の主要な原因である。血管内治療の進歩にもかかわらず、バイパス手術は、このように万人以上の静脈グラフトは、米国で毎年行われている、現代的な治療法の柱のまま。しかし、研究の数十年にもかかわらず、下肢静脈グラフト30〜60％が内膜肥厚（IH）2による第一年以内に失敗する。機械的な力、特に低せん断応力（SS）と高い壁張力が、この過形成応答3,4の開始と発展に極めて重要である。この問題に対処するために、ex vivoで静脈灌流システム（EVPS）は厳密に制御され、血行動態条件（圧力およびせん断応力）、ヒト伏在静脈の行動の下で、研究し作成した。本研究では、動脈のような循環への挿入に続いて、高圧（= 100mmHgの平均）prolifを刺激するのに十分であったや機能の内膜層（IH）5への平滑筋細胞の遊走。 哺乳類の研究は、「動脈血静脈」をサポートし、急性の血行動態は静脈が一度動脈環境に移植の顔に変化に対抗するための効率的な方法として、外部の補強を使用することを示唆している。過膨張を防止メッシュは、せん断応力が増加し、壁張力、その結果、IH 6-10を減少させた。しかし、根底にある機序およびバイパス開通性を向上させる上で、人間の静脈への適用は十分に特徴付けられていない。私たちのEVPS静脈を一旦動脈レジメン（高いせん断応力および圧力）、外部マクロ多孔質ポリエステル管状メッシュの非存在下および存在下でのヒト伏在静脈の挙動に挿入面する変化を模倣する条件において、比較した。病理学的リモデリングおよびIHを防止することにより、メッシュは、その潜在的な臨床効率11の証拠を提供</sup&gt;。 この研究は1）は、外部マクロ多孔質ポリエステルメッシュはIHを減少させ、その潜在的な臨床応用するために重要な情報を提供することを実証制御された圧力とせん断応力の2）の下でex vivoでのヒト伏在静脈灌流のモデルを紹介します。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 - Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine/Fungizone</td><td>Bioconcept</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Leuconostoc spp. 500 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L</td><td>Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG</td><td>100 0 324 00</td><td></td></tr><tr><td>クライオセクショニング埋め込み媒体 - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16) - 7.5 m</td><td>Idex Health &サイエンスGMBH</td><td>MF0037ST</td><td></td></tr><tr><td>Yスプリッター&nbsp;</td><td>イデックスヘルス&科学GMBH</td><td>Yコネクタ</td><td></td></tr><tr><td>35 mm培養皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430165-100EA</td><td></td></tr><tr><td>15 mlファルコンチューブ</td><td>BD Bioscence</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mlファルコンチューブ</td><td>BD Bioscence</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>ギアリングポンプ - Reglo-Z</td><td>Idex Health &サイエンスGMBH</td><td>SM 895&nbsp;</td><td>&nbsp;App-NR 03736-00194</td></tr><tr><td>ポンプヘッド</td><td>Idex Health &サイエンス GMBH</td><td>MI0008&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>モニタリングキット TRANSPAC IV</td><td>icumedical</td><td>011-0J736-01</td><td></td></tr><tr><td>20 ml シリンジ</td><td>B. Braun Medical SA</td><td>4612041-02</td><td></td></tr><tr><td>エティボン 3-0 FS-2</td><td>Ethicon- Johnson&ジョンソン</td><td>EH7346H</td><td></td></tr><tr><td>メッシュ ProVena 6-8mm</td><td>B. Braun Medical SA</td><td>1105012-14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl: 塩化ナトリウム溶液灌流 0.9% (100 ml)</td> <td>B. Braun Medical SA</td><td>534534</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Standard Drive</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>7521-10</td><td></td></tr><tr><td>アクイジション カード</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6024 E</td><td></td></tr><tr><td>流量計モジュール</td><td>Transonic Systems株式会社</td><td>TS410およびT402</td><td></td></tr>ストップ<tr><td>コック、3ウェイ</td><td>BDコンネクスタルアーロック</td><td>394600</td><td></td></tr><tr><td>ミレックスフィルター</td><td>ミリアン</td><td>SE2M229I04</td><td></td></tr></tbody></table>

人間の伏在静脈のための手順生体外灌流および外部補強

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

大規模な閉塞性動脈疾患のための現代的な治療の主力は、静脈バイパス移植である。しかし、その耐久性は、最終的には血管閉塞及び移植の失敗につながる内膜肥厚（IH）の脅威にさらされている。機械的な力、特に低せん断応力と高い壁の張力は、開始するために、これらの細胞および分子の変化を維持すると考えられているが、それらの正確な寄与は解明されていない。選択的にIHの生物学上の圧力とせん断応力の役割を評価するために、ex vivoで灌流システム（EVPS）は、動脈レジメン（高せん断応力および高圧）の下で人間の伏在静脈のセグメントを灌流するために作成されました。さらなる技術革新は、同じ静脈、外部メッシュで補強された1から2のセグメントの同時灌流を可能にした。静脈は、非接触技術を使用して採取し、直ちにEVPSアセンブリ実験室に移した。たてISOLの一つのセグメントated静脈（コントロール、0日目）に灌流されていませんでした。他の二つのセグメントが最大7日間灌流し、1は完全に4ミリメートル（直径）外部メッシュで保護されている。圧力、流速、および脈拍数を連続的にモニターし、大腿動脈内で優勢な血行力学的条件を模倣するように調整した。潅流が完了すると、静脈がディスマウントされ、組織学的および分子分析のために使用される。 エキソビボ条件下では、高圧灌流（動脈、平均値= 100 mmHgで）がIHおよびヒト静脈のリモデリングを生成するのに十分である。これらの変化は、外部ポリエステルメッシュの存在下で還元されている。

EVPSは、人間の伏在静脈の再構築およびIHをグラフト上で独立して血流力を評価するための貴重なツールを提供します。 図1は、灌流チャンバーと静脈のサポートを示しています。 図1AおよびBにおいて、前静脈サポート（ 図1A）および後（ 図1B）アセンブリは、それぞれ描かれている。これは、簡単に（左から右へ）スライドできる2 L字型片の支持体として働く9センチメートルを測定する1プレーンステンレス鋼管の、（上から下に）構成さに信頼性の高い技術を提供される静脈への支援の大きさを調整します。これらの作品はそれぞれ、統合されたネジ（矢印）によって所定の位置に固定された鋼製のシリンダ（静脈コネクタ）に合うように、POMディスクを保持している。 図1C-Dが単独（C）および静脈サポート（D）の挿入後に灌流チャンバーを示しています。灌流チャンバーでは、くぼみがするように設計されている場所（上）...

内膜過形成（IH）及び静脈グラフト不全の発症を導くメカニズムはまだよく理解されていない。本研究では、制御された流れと圧力の下で、人間の静脈を灌流するためにex vivoでシステムが記載されている。さらにIHの開発を制限する外部メッシュ補強の効率を評価した。

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

次の実験の全体的な目標は、圧力、純粋なストレス、および外部強化が人間の内膜過形成に与える影響を評価することです。これは、同じ静脈から2つのセグメントを同時に高圧灌流することによって達成されます。1つのセグメントは外部メッシュで補強されていますが、静脈セグメントは組織学的および分子学的分析のためにセクションにカットされます。これらの分析は、内膜過形成に対する外部補強の効果を評価するために使用されます。結果は、外部補強が、通常7日間の灌流後に観察される内膜過形成を減少させることができることを示しています。セノバンバイパスグラフトは、末梢動脈疾患に苦しむ患者に最適な治療法の1つです。しかし、移植片の失敗につながるt過形成の発症は、そのような工芸品の主要な制限要因です。この改造は、新しい治療法を開発するために、バンを動脈環境に適応させることによるものです。この現象に関与する分子メカニズムの理解は不可欠です。そこで、灌流のex vivoモデルを開発しました。私たちのシステムの主な利点の1つは、他の交絡免疫因子や内分泌因子なしで血行動態パラメータの研究を可能にすることです。当研究室の博士課程のMD学生がこの技術を実演します。ヒト静脈サンプルは、下肢バイパス手術を受けている患者から採取されます。静脈は収集され、無菌条件下で実験室に運ばれ、層流フードの下に置かれます。そのような静脈の最小サイズは9センチメートルの長さです。内径は2.5ミリメートル以上、外径は4ミリメートル以上です。静脈は3つに分かれています。採取されたセグメントでさえ、12.5%FBSを補充した氷冷RPMI 1640過剰最大メディアに保存され、PBSで1つのセグメントをすすぎます。これは、再び3つの部分に分割されたコントロールです。モルフォの場合は1つの部分をForminに固定し、他の2つの部分は分子解析のために凍結します。EVPSは、ポリメチルアクリル、メチルポリオキシエチレン、鋼などの化学物質を浸出させない防水材料でできている必要があります。灌流チャンバーは、血管の屈曲と拡張を最小限に抑え、培地交換を容易にするために、少なくとも2.5センチメートルの深さでなければなりません。静脈支持体は、上から下にL字型のアタッチメントに接続された鋼棒です。圧力カラムの接続ダクトにより、静脈への圧力インとアウトフロー、および媒体の変化を調整して、正常な流れ方向を決定できます。灌流用の残りの2つのセグメントには、培地を穏やかに注入します。セグメントにバルブがある場合、流れは遅くなります。EVPSでは、バルブが流れを妨げないように、静脈を逆にする必要があります。静脈を2つの金属シリンダーに接続します。一度に1つの端。きつい結び目を使用して、くぼみの周りにVicryl 3 ohでシリンダーを固定します。次に、媒体を装填した灌流チャンバーに静脈を移します。3 番目の静脈セグメントについては、前に示したように、静脈の一方の端を円柱に取り付けます。次に、メッシュを静脈にそっとスライドさせます。次に、メッシュと静脈を縫合糸でシリンダーに固定します。最後に、メッシュの長さを調整し、静脈のもう一方の端とメッシュをシリンダーに固定します。アセンブリを2番目の灌流チャンバーに移動します。EVPSは、シリコンチューブで閉ループに組み立てられています。各アウトフローシリンダーを、過酸化物処理されたシリコンチューブのセグメントを使用してYスプリッターに接続します。流入する金属シリンダーごとに同じことを行います。次に、アウトフロースプリッターを2番目のYスプリッターに接続します。このYスプリッターから。一方の流出を圧力変換器に接続されたチューブに接続し、もう一方の流出を圧力柱に接続するには、1メートルのチューブを使用して圧力塔をポンプに接続します。ポンプを流入Yスプリッターに接続してセットアップを完了します。別のメーターのチューブを使用して、残りのチューブを圧力カラムに接続します。最も低いダクトはメディア交換の役割を果たします。EVPSを組み立てた後、カラムを静脈流出ダクトのすぐ下に中程度から充填します。次に、二酸化炭素を使用して摂氏37度に設定されたインキュベーターにシステムを移動します。インキュベーターの外側でpHを一定の7.4に保ちます。ポンプギアヘッドをギアドライブに取り付けて、圧力を監視します。EVPSの圧力出力を圧力トランスデューサーに接続します。チューブが完全に満たされ、気泡がないことを確認してください。毎分60パルスで一定の振幅でパルスイタルカーディオ信号は、ギアリングポンプを独立してパイロットするコンピューターソフトウェアを介して設定されます。結果として得られる流量は、毎分約160ミリリットルです。圧力は、コンピュータによって制御される調整可能な圧力調整器と直列に接続された遠心ポンプによって独立して設定および調整されます。3〜7日後、各灌流セグメントの灌流を終了します。静脈の結紮部分を廃棄するために、両端から5ミリメートルを取り除きます。次に、静脈の中央部分から固定用の5ミリメートルのリングを切り取ります。分子解析のために残りのフラグメントを凍結します。3番目のセグメントをホルミンに埋め込んで、組織学および分子解析を行います。7日間の高圧灌流の後、組織学的分析のために静脈切片を調製しました。すべての条件について、h染色とe染色により、培地層のSMCの内腔と核の内側に内皮細胞の核が明らかになりました。エラスチン灌流静脈の肥厚、病理学的外見のリモデリング、および培地の菲薄化が明らかになった。マッソンのトリコーム染色は、3つの筋肉層のうち1つだけが内層に蓄積した平滑筋細胞を持続させたことを示しています。対照的に、静脈の外部補強はSMC分布と培地構造を維持しましたこの技術は、厳密な敗血症の下で作業する必要があります。一度マスターすれば、このシステムを使えば2時間もかからずに行うことができます。乱流などの他の条件は、非ラナーフローのメッシュ補強の効率など、追加の質問に答えるためにテストできます。

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