土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

この手順の目的は、土壌サンプリングと腸内病原性線虫の単離に一般的に使用される方法と技術を実証することです。これは、最初にトランセクトアプローチによって、または示されているようにランダムサンプリングアプローチによって土壌サンプルを収集することによって達成されます。次に、土壌サンプルを昆虫で減少させ、腸内病原性線虫を選択的に回収しました。

最後のステップは、改変された白いトラップを使用して感染した昆虫から線虫を収集することです。最終的に、これらの技術は、実験室での腸内病原性線虫培養の成功裏の確立のための重要なステップを表し、下流のバイオアッセイの基礎を形成します。土壌サンプリング技術の利点は、畑に行って病原性線虫の成熟期を収集できることです。

私は、めったに遭遇しないこの線虫に感染している昆虫をサンプリングするのではなく。私たちが採用しているランダムサンプル戦略は、広い地理的地域または地域からの病原性線虫の多様性を評価するために一般的に使用されます。この手法は、1975年にアカーのベッティングで初めて説明されました。

これは、自由な生活段階が昆虫宿主に引き寄せられ、寄生するという前提に基づく選択的な手順です。手順のデモンストレーションは、Rue Orozcoの大学院生と、私の研究室のMing Mingle研究技術者になります。研究室。サンプルを収集する場所は、最小面積が2平方メートルで、可能であれば4平方メートル以上である必要があります。

土壌サンプルごとに、DM a Cサンプルエリア内で少なくとも3つの小さなサブサンプルを採取します。サブサンプルは、研究の目的を満たしている場合に組み合わせることができます。土壌サンプルを0〜15センチメートルの深さで収集します。

各サンプルは250グラムから1キログラムである必要があります。土壌CORAのトラウ、ハンドシャベル、または同様のツールを使用して、選択した各サンプリングエリア内の少なくとも5つのランダムなサイトから収集します。各サンプルは二重に袋詰めし、防水マーカーでラベルを付ける必要があります。

ラベルには、サイト、場所、標高、日付、および環境変数 (生息地の説明、関連する植生、サイトの気温など) に関する情報が含まれている必要があります。地元の昆虫や他の無脊椎動物種に注意してください。収集場所の間のラボで後で識別するためにすぐに識別できない種を収集し、収集ツールを水で十分に洗浄し、70%エタノールまたは0.5%漂白剤を使用して消毒します。

土壌サンプルは、輸送のために摂氏8〜15度のクーラーボックスに保管します。CESは、サンプルの一部を分離して、土壌の組成、テクスチャ、導電率などの総特性を分析します。各土壌サンプルから、微生物汚染につながる可能性のある破片を取り除きます。

次に、土壌を水で湿らせて、その中の線虫が動きやすくします。200〜250グラムの湿った土を蓋付きのプラスチック容器に入れます。次に、昆虫の餌を追加します。

5〜10匹の昆虫で十分です。フタを取り付け、容器を裏返して暗所に置きます。2〜3日ごとに室温で、死んだ昆虫を取り除き、必要に応じて健康な昆虫と交換して追加の重み付けを行います。

昆虫の死体が茶色または黄土色の場合、これはスタインとネマがパリットに寄生していることを示唆しています。一方、死体がレンガ色から濃い紫色の場合は、ヘテロを予想してください。改造された白いトラップを使用して、昆虫の餌に寄生した線虫を収集します。

まず、50mmまたは60mmのシャーレの蓋を100mmのシャーレの底面に入れます。次に、円形のワトマンのシートを置きます。小さい皿の中のナンバーワンの濾紙。

昆虫の死体を滅菌水ですすぎ、濾紙に移します。それらが互いに接触しないように広げます。大きい方の皿だけに約20ミリリットルの蒸留水を入れ、アセンブリを大きな皿で覆います。蓋。

線虫の名前、昆虫の餌付け日、日付を皿にラベル付けします。トラップがセットアップされます。トラップを室温に保ち、昆虫の死体から出現する感染性の幼若線虫またはIJを監視します。

これには10〜25日かかる場合があり、トラップが保管されている場所の温度と湿度レベルによって異なります。トラップ内の水位が蒸発した場合は、必ずIJをプレートに補充してください。線虫が含まれているはずの大きい皿から水を収穫します。

線虫を数分間沈めてから、ゆっくりと水をデカントします。線虫が少量の水に残ったら、戻水を加えてから慎重に注ぎ、さらに数回洗い流します。次に、線虫の個体数を推定するために段階希釈を行います。

250ミリリットルの培養フラスコで、線虫の濃度を1ミリリットルあたり1〜3000センチュウに調整します。この懸濁液は摂氏10度から20度の間で保管してください。一般的に自然界では、腸内病原性線虫に寄生された昆虫を見つける可能性は非常に低いです。

したがって、G黒色腫幼虫を餌として使用した概説されたプロトコルを使用して、そのような線虫をはるかに効率的な速度で単離した。5日後、昆虫は感染し、赤い色をしていました。修正された白いトラップは線虫の痕跡を示しました。

これらのトラップから15日後、線虫は水中に集まり、きれいな外観を持ち、昆虫組織もありませんでした。ガリウムメラニア幼虫を使用した単一の抽出サイクルでは、土壌サンプル中のすべてのOma病原性線虫を回収するには不十分な場合があります。そのため、これを複数回行うことをお勧めします。

また、ガレリアではなく他の昆虫を考慮することをお勧めします。これにより、回復の可能性も高まります。昆虫と土壌サンプルのディベートは、細菌や真菌などの他の昆虫病原体の分離にも考慮できる手法です。