Name: 土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steinernematidae、Heterorhabditidae） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぶ土壌サンプリングと昆虫病原線虫の分離法。昆虫ベイト法と改良Whiteトラップを用いて、SteinernematidaeやHeterorhabditidaeを効率的に回収し、研究室での培養とバイオアッセイの基礎を確立する技術を解説します。

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1。土壌サンプルの採取<ol><li>各サンプリングサイトは4m 2 - 2の最小面積をカバーすることを検討してください。 </li><li>少なくとも15cmの深さ（ 図4）での土壌サンプルを収集します。 </li><li>この領域内に少なくとも5のランダムサンプルを取る。 </li><li>サンプルあたり3サブサンプルを取る。研究の目的は、サブサンプルを組み合わせて、または別のそれらを保つのどちらかによって異なります。 </li><li>ビニール袋に各サンプルを置きます。サンプル（ 図4）の漏れを回避するために二重の袋詰めを考えてみましょう。 </li><li>防水マーカーでラベルサンプル。各サンプリングサイトから以下の情報が含まれる：（ローカリティ/エリア/サイト名やGPSなどの座標情報）サイト情報を、日付、生息地、関連する植生、温度、標高など 注：必要に応じて、その後の識別のための試料を用いて収集した昆虫や他の無脊椎動物の存在を収集し、および/または記録します。彼らは潜在的な漢方を表すことができアルEPNホスト。 </li><li>水で徹底的に洗浄および/または70％エタノールまたは0.5％の漂白剤溶液でそれらを消毒することにより、サンプル間のきれいな収集ツール。 </li><li>研究室への輸送中に - （15°C 8）クーラー内のサンプルを保管してください。 </li><li>土壌の組成、質感、水分、導電性又は他の所望の土壌パラメータに関する情報を得るために分析用の土壌サンプルの一部を取る。 </li></ol> 。土壌サンプルからの2線虫の分離：昆虫苦しませるテクニック<ol><li>ごみを取り除き（ すなわち 、岩などの木材や樹皮、葉の部分。）腐生の微生物による汚染を避けるために、サンプルを用いて収集した。 </li><li>土を湿らせて、線虫の移動を容易にするために水を加える。 NOTE：ゆっくりと土壌の水分レベルを増加させるためにスプレーボトルを使用する。 </li><li>蓋付きの清潔なプラス​​チック容器に湿った土壌の約200〜250ミリリットルを配置します。 </li><li>昆虫の餌を追​​加。各サンプル（ 図5）の土壌表面に5から10昆虫を検討してください。 </li><li>蓋付きの容器をカバーし、上下逆にコンテナを回す。 </li><li> （ - 25°Cの通常22）暗闇の中で、RTでコンテナを維持する。 </li><li> 3日、死んだ虫を削除 - すべての2の容器を確認してください。 注：土壌サンプルをさらに苦しませるために、各コンテナに追加の健全な昆虫を追加します。 </li><li>容器から死んだ虫を取り除く。注：濃い紫色の死体に赤レンガをheterorhabditidsによって寄生されたのに対し、茶色や黄土色に着色した死体は、通常、steine​​rnematidsによって寄生されています。 </li><li>滅菌水に死体を洗浄します。 </li><li> （下記の手順を参照）、線虫の子孫の回収のために変更されたホワイトトラップに死体を置く。 </li></ol>感染した死体から3センチュウ回復：変更されたホワイト罠<ol><li> 50（または60）ミリメートル直径の上に置きます。大きなお皿（100ミリメートル）の内部ペトリ皿。 </li><li> 1罪を設定小さい皿の内側GLE円形の濾紙（ワットマン＃1）。 </li><li>必ず死体を作るより小さな皿のフィルター紙の上に置いて、死体は汚染を避けるために、お互いに手を触れないでください。 </li><li> CAで外側（大きい）ペトリ皿を埋める。滅菌蒸留水20ml。死体を保持している皿に水を追加しないでください。 </li><li>蓋（ 図6）を持つ大規模なシャーレとその内容をカバーしています。 </li><li>それに応じてお料理にラベルを付けます。線虫の名前（種/分離株）、感染日付（日付感染が設定された）とトラップの日付（これはトラップが設定されている日付です）：以下の情報を追加します。 </li><li>感染幼虫期（IJS）の出現が起こるまで、室温でトラップしておいてください。線虫種および/または考慮さ菌株によって25日 - このプロセスは、10の間に取ることができます。 </li><li>トラップの大きなお皿を取り出し、ビーカーに線虫で水を注ぐことによってIJSで収穫水。 </li><li>線虫は、Bの底にデカントすることができますエーカー。このプロセスには数分かかる場合があります。 </li><li>必ず線虫は、ビーカーの底に残っていること、丁寧に水を注ぐ。 </li><li>より多くの水を追加し、線虫をデカントできるようにすることで、線虫を洗浄します。水がきれいになるまで3回 - このステップでは、2を繰り返すことができます。 </li><li>組織培養フラスコ（250ml）に線虫サスペンションを配置します。 3000線虫/ mlに - 1000懸濁液の濃度を保つ。 </li><li> 20℃ - 低温室で、10間のインキュベーター内で線虫懸濁液と店のフラスコ 注：EPNの保存期間が可変であるように、定期的に保存されたフラスコを確認してください。 heterorhabditidsは、より定期的な検診が必要な場合があり、一方、継代培養を必要とせずに、12ヶ月 - 通常steine​​rnematids 6のために保存することができます。 </li></ol>

<ol><li>Bedding, R. A., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+the+detection+of+insect+parasitic+rhabditid+nematodes+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil.</a> Nematologica. 21, 109-110 (1975).</li>
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利害の対立が宣言されていません。

このデモでは、一般的に、EPNとその共生細菌を研究するために使用されている多くの技術を説明する2つのプレゼンテーションの最初のものです。これらの技術は、実験室でのEPN培養の成功確立のための重要なステップを表し、また、研究のためのモデル生物として、EPNを採用し、他のバイオアッセイのための基礎を形成する。 EPNの様々な土壌調査では、その豊かさと分布は季節、生息地や地域4、5,9,15間で異なることが示されている。土壌テクスチャ、水分含量、温度、ならびに宿主の可用性などの要因は、それらの分布において重要な役割を果たし得る。そのため、調査に関する予備的データが重要である。サンプルが採取されたら、それらはできるだけ早く処理されることが重要である。これは可能性でない場合は、それらは、低温室又は他の適切な温度制御ユニットに記憶されるべきである。異なる温度であってよいサンプルの起源に依存昆虫ベイトコンテナを格納するために検討した。意図のために通常、低い温度（ 例えば 、15℃）は、熱帯地域から温帯のサンプルとサンプルのために考慮され、暖かい温度（ <...

多くの線虫、昆虫に関連付けられ、それらの宿主の相互作用が有益から有害な範囲である。ここに、我々はまた、昆虫病原性線虫（あるいはEPN）として知られている昆虫の病原体である線虫のグループに焦点を当てる。 SteinernematidaeとHeterorhabditidae 11,13：二つの線虫の家族が線虫のこのグループに属している。その病原性効果は、実際には通性嫌気性の腸内細菌との相互作用によって付与される（ ラブダス細菌がheterorhabditids関連付けるsteinernematidsとのPhotorhabdus細菌に関連付ける）2。細菌は土壌中に住んでいる唯一の自由生活線虫ステージによって別の昆虫宿主（またdauerの少年、感染少年やIJとして知られている）、3段目の感染性若年性からベクトル化されています。かつて昆虫の中に、線虫は、大規模な敗血症による昆虫宿主を殺す昆虫の血リンパに細菌を放出する。また、細菌昆虫の組織を分解し、それらが成熟し増殖することができ、線虫 &#39;食料源となる。通常、成体線虫の1つまたは2つの世代の昆虫死体内に生成される。より以前の栄養の関係よりも、やり方を専門とし、彼らが寄生する他の昆虫を待ちます土に虫の死骸から外に移動するので、その腸内にこれらの細胞を育てる中で、いくつかの細菌細胞との最後の大人の世代の再アソシエートの子孫6,11,14（ 図1）。 彼らは、農業害虫3,4,5である昆虫の広い範囲に寄生することができるように1927年に発見されているので、EPNは化学農薬への貴重な選択肢と考えられてきた。しかし、過去20年間、これらの線虫とその共生細菌は、宿主微生物の生物生態や進化の側面を研究するための可鍛性のモデル系として認識されているinteractioNS 14。 このプレゼンテーションの目的は、方法及び最も一般的に土壌のサンプリングとEPNの単離のために使用される技術を示すことである。さまざまなツールが利用可能で、含む土壌試料収集するために使用することができます。土壌の芯抜き、こて、ポストホールディガー、オーガー、サンプリングチューブ、ハンドシャベル、とりわけ（ 図2）。 研究の目的に応じて、2つのサンプリング戦略を考慮することができる：a）層状と、b）ランダムサンプリング（ 図3）。層化サンプリングは、通常、所与の期間にわたって特定の又はdemarked領域における集中的な研究の一部として使用される。一般に、トランセクトはdemarkedされ、土壌サンプルを、一定期間（ 図3A）15上トランセクトに規定の間隔で採取する。広範な領域に着目すると、ランダムサンプリングが一般的である。このサンプリング戦略は、EPNのfの多様性を研究するために使用されているROM広い地域または地域（ 図3B）12。多くの要因は、標高、土壌のテクスチャや生息地の多様な範囲（ 例えば 、耕地、森林、牧草地、公園、海岸、水辺エリアなど）を含めた研究の焦点に応じて考えることができる。 私たちは、もともと寝具、Akhurst 1で説明した土壌サンプルからEPNを回復するための簡単かつ選択的な代替手段を表した昆虫苦しませる手法を示している。これは、線虫（IJステージ）昆虫宿主に引き付けられ、それに寄生されることを前提としている選択的な手順である。この技術はまた、真菌、および細菌8,10のような他の昆虫の病原体の単離のために考慮することができる。 我々はまた、感染した昆虫のホスト7,14から線虫の子孫を検索するために使用される修正されたホワイトトラップ技術を実証する。これが満たさ簡単です劣化昆虫死体からの不要な物を「クリーンな」線虫の子孫を取得する利点を提供していますHOD。 最後に、この記事で説明して示した技術が考案および/または、私たちの研究室だけでなく、様々な同僚や協力者によって記載されているもので行われるものに対応する。

<table><tbody><tr><td>Galleria mellonella</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>昆虫餌付け技術用</td></tr><tr><td>濾紙、55 mm グレード1 セルロース</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-048</td><td>感染チャンバーとホワイトトラップアセンブリ</td></tr><tr><td>60 x 15 mm ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>感染チャンバーとホワイトトラップアセンブリ</td></tr><tr><td>100 x 15 mm ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>感染チャンバーとホワイトトラップアセンブリ</td></tr><tr><td>ZIPloc ビニール袋</td><td>エース ハードウェアまたは地元の金物店</td><td></td><td>土壌サンプリング</td></tr><tr><td>機械式ピペッター P1000、P200 ml</td><td>VWR</td><td>89130-562; 89130-566&nbsp;</td><td>感染チャンバーとホワイトトラップアセンブリ</td></tr><tr><td>ピペットチップ1000ml、200ミリリットル</td><td>VWR</td><td>16466-004;53510</td><td>感染室とホワイトトラップアセンブリ</td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>エースハードウェアまたは地元の金物店</td><td></td><td>土壌サンプリング、次</td></tr><tr><td>亜塩素酸ナトリウム</td>エー<td>スハードウェアまたは地元の金物店</td><td></td>の<td>消毒土壌サンプリング、</td></tr><tr><td>70%エチルアロコール</td><td>AAPER</td><td>17212945の消毒</td>土壌<td>サンプリング、消毒</td></tr><tr><td>ショベル</td><td>エースハードウェアまたは地元の金物店</td><td>N / A</td><td>土壌サンプリング</td></tr><tr><td>管状土壌サンプ</td><td>ラーAccuproducts</td><td></td><td>土壌サンプリング</td></tr><tr><td>土壌プローブ、ロングハンドル</td><td>Nupla&nbsp;</td><td>PRB4T 69401クラシック</td><td>土壌サンプリング</td></tr><tr><td>測定テープ</td><td>エースハードウェアまたは地元の金物店</td><td></td><td>土壌サンプリング</td></tr><tr><td>フラグテープ、さまざまな色</td><td>エースハードウェアまたは地元の金物店</td><td></td><td>土壌サンプリング</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>VWR</td><td>ファルコン、29185-304&nbsp;</td><td>ホワイトトラップ、EPNのコレクション</td></tr><tr><td>ウォッシュボトル、ポリエチレン、広口</td><td>VWR</td><td>16650-107</td><td>ホワイトトラップ、EPNのコレクション</td></tr></tbody></table>

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（steine​​rnematidae、heterorhabditidae）

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

昆虫病原性線虫（別名EPN）は昆虫の広い範囲に寄生する土壌に生息する線虫の基を表す。 Steine​​rnematidaeとHeterorhabditidae：これらの線虫は二つの家族に属しています。今まで、70以上の種がSteine​​rnematidaeに記載されており、Heterorhabditidae約20種が存在する。線虫は、腸内細菌と共生のパートナーシップを持っており、彼らは一緒に昆虫種の広い範囲を殺す強力な殺虫複合体として機能します。 ここに、私たちは土壌から、EPNを収集するために考慮される最も一般的な技術に焦点を当てています。このプレゼンテーションの後半では、昆虫苦しませる技術、土壌サンプルからEPNを単離するために広く使用されているアプローチ、および感染した昆虫から、これらの線虫の回復のために使用されている修正されたホワイトトラップ技術に焦点を当てています。これらの方法および技術は、EPNカルトの成功確立のための重要なステップであるURES研究室でも、他の生物学の分野での研究のためのモデル生物として、これらの線虫を考え、他のバイオアッセイのための基礎を形成する。このプレゼンテーションに示す手法が実施され、/またはSPストック研究室のメンバーだけでなく、様々な著者が記載されているものが設計したものに相当する。

土壌サンプルの採取 EPNの3段目の感染少年は、土壌（ 図1）に存在するこれらの線虫のライフサイクルの中で唯一の自由生活のステージです。したがって、土壌サンプルを採取することは、これらの線虫から回復するための非常に効率的な方法である。 図4は、サンプルを採取する位置の深さを示す土壌断面を示している。サンプルの水分を維持することは線虫の生存のための重要な要因である。これにより、プラスチックバッグに土壌サンプルを維持し、実験室（ 図4）の通過中に冷たい温度でそれらを維持することが重要である。 線虫の回復流行とEPNの侵入と昆虫の大きなサンプル見つかるがない限り、自然の中で、自然にEPNによる寄生昆虫を見つける可能性は、3％未満である。したがって、昆虫と土壌サンプルの苦しませる便利APPRですその自然の生息地からEPNの回復を促進するためにoach。 図5は、<...

昆虫病原性線虫、昆虫の広い範囲に寄生する土壌に生息する回虫です。それぞれ、土壌サンプル、感染昆虫死体から線虫の回復のために、昆虫苦しませると変更されたホワイトトラップ：我々は2つ​​の技術を使用した土壌からこれらの線虫を分離するために使用されるサンプリング方法を示しています。

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

この手順の目的は、土壌サンプリングと腸内病原性線虫の単離に一般的に使用される方法と技術を実証することです。これは、最初にトランセクトアプローチによって、または示されているようにランダムサンプリングアプローチによって土壌サンプルを収集することによって達成されます。次に、土壌サンプルを昆虫で減少させ、腸内病原性線虫を選択的に回収しました。最後のステップは、改変された白いトラップを使用して感染した昆虫から線虫を収集することです。最終的に、これらの技術は、実験室での腸内病原性線虫培養の成功裏の確立のための重要なステップを表し、下流のバイオアッセイの基礎を形成します。土壌サンプリング技術の利点は、畑に行って病原性線虫の成熟期を収集できることです。私は、めったに遭遇しないこの線虫に感染している昆虫をサンプリングするのではなく。私たちが採用しているランダムサンプル戦略は、広い地理的地域または地域からの病原性線虫の多様性を評価するために一般的に使用されます。この手法は、1975年にアカーのベッティングで初めて説明されました。これは、自由な生活段階が昆虫宿主に引き寄せられ、寄生するという前提に基づく選択的な手順です。手順のデモンストレーションは、Rue Orozcoの大学院生と、私の研究室のMing Mingle研究技術者になります。研究室。サンプルを収集する場所は、最小面積が2平方メートルで、可能であれば4平方メートル以上である必要があります。土壌サンプルごとに、DM a Cサンプルエリア内で少なくとも3つの小さなサブサンプルを採取します。サブサンプルは、研究の目的を満たしている場合に組み合わせることができます。土壌サンプルを0〜15センチメートルの深さで収集します。各サンプルは250グラムから1キログラムである必要があります。土壌CORAのトラウ、ハンドシャベル、または同様のツールを使用して、選択した各サンプリングエリア内の少なくとも5つのランダムなサイトから収集します。各サンプルは二重に袋詰めし、防水マーカーでラベルを付ける必要があります。ラベルには、サイト、場所、標高、日付、および環境変数 (生息地の説明、関連する植生、サイトの気温など) に関する情報が含まれている必要があります。地元の昆虫や他の無脊椎動物種に注意してください。収集場所の間のラボで後で識別するためにすぐに識別できない種を収集し、収集ツールを水で十分に洗浄し、70%エタノールまたは0.5%漂白剤を使用して消毒します。土壌サンプルは、輸送のために摂氏8〜15度のクーラーボックスに保管します。CESは、サンプルの一部を分離して、土壌の組成、テクスチャ、導電率などの総特性を分析します。各土壌サンプルから、微生物汚染につながる可能性のある破片を取り除きます。次に、土壌を水で湿らせて、その中の線虫が動きやすくしま

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Research

JoVE Journal

Environment

環境

このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。...

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

ここでは、土壌サンプルから病原性真菌(EPF)を単離・選択するために用いたミミズ(テネブリオモリター)-ベイトシステムに基づくプロトコルを提示する。有効なコニディア数(ECN)式は、現場での害虫微生物制御のための生理学的特性に基づいて高い耐ストレスEPFを選択するために使用される。...

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

このプロトコルは、現場の天然基質から生きた線虫を効率的に抽出する方法を概説する。...

ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離

昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア...

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

このプロトコルは、自己発症 性Caenorhabditis...

自己 カエノールハブディティス 線虫の生態学的調査を行うための高度にスケーラブルなアプローチ

昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。...

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

Caenorhabditis elegans は生物学の主要なモデル種の1つですが、ほとんどすべての研究は、その自然に関連する微生物の不在下で行われています。ここで説明する方法は、将来の機能的 C.エレガンス...

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

私たちは、生物殺虫剤として昆虫病原性線虫を大量増殖させるための農家向けの2つの方法を提案します。最初の方法はポリアクリルアミドゲルを線虫培養基質として使用し、2つ目はポリマーコーティングされた綿を培養基質として使用します。いずれの方法も昆虫死体内で線虫の生 体内...

昆虫病原性線虫の栽培者ベース in vivo 増殖

この方法は、連続13℃で均一または差動植物組織標識用15 N同位体標識室を構築し、操作する方法について説明します。代謝およびAndropogonのgerardiiの構造的な標識からの代表的な結果が説明されています。...

連続の設計および動作<sup&gt; 13</sup&gt; Cと<sup&gt; 15</sup均一または差動、代謝および構造·&gt; N標識化会議所、工場同位体ラベル化

フィールドlysimetryと間隙水のサンプリングは、研究者が土壌や植生確立に適用される化学物質の運命を評価することを可能にする。このプロトコルの目的は、必要な計測機器を設置し、統合されたフィールドlysimetryと間隙水のサンプリング実験中に化学分析のためのサンプルを収集する方法を示すことです。...

統合フィールドLysimetryと間隙水土壌中の化学物質の移動性の評価のためのサンプリングと設立植生

学ぶ土壌サンプリングと昆虫病原線虫の分離法。昆虫ベイト法と改良Whiteトラップを用いて、SteinernematidaeやHeterorhabditidaeを効率的に回収し、研究室での培養とバイオアッセイの基礎を確立する技術を解説します。

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

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