Name: 転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚からの心臓解剖法で、心臓特異的RNAを抽出し転写解析を行う技術です。発生段階別の遺伝子発現プロファイルを調べ、心臓発生のメカニズム解明に貢献します。

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この精製プロトコルの基本原理を概説してくださったC. Burns氏、C. McRae氏、そしてこの方法を私たちの研究室で最初に実装してくださったF. Priller氏に感謝します。S.A.-S.は、ドイツ研究振興協会(DFG)のハイゼンベルク教授職によってサポートされています。本研究はDFG grant SE2016/7-1の支援を受けて行われました。

このプロトコルは、ドイツのベルリン州法の動物のケアのガイドラインに従います。ゼブラフィッシュの取り扱いは、動物保護のための地方自治体（LaGeSo、ベルリン·ブランデンブルク）によりモニターした。 1.ハート抽出のためのゼブラフィッシュ胚の取得<ol><li>そのようなTgは（myl7：EGFP）などのクロス心臓レポーターゼブラフィッシュtwu34ジェニックライン9ハート固有のGFP発現を持つ胚を得るために。 </li><li>希望胚段階10,11まで28.5℃で、卵の水で胚を維持する。収集された胚の集団が遺伝子発現の変動を制限するために、両方の遺伝的および発達段階によって均質であることを確認してください。 </li><li>手動で胚をDechorionate。 </li></ol> 2.解剖ゼブラフィッシュ胚ハーツ注：氷の上のすべてのソリューションを保管してください。可能な場合は、チームワークを行います。1人はEMBから心を解剖ryos別の人は、蛍光実体顕微鏡下で心をソートしながら。これは、数時間で胚の数百の処理を可能にする。 <ol><li> 1.5ミリリットルの遠心チューブに約100の胚を転送します。トリカイン（E3培地中0.16 mg / mlで）で胚を麻酔。胚を明確に麻酔をされると進みます（彼らは泳ぐとチューブの底に沈殿物が、その心はまだ暴行されていません）。 </li><li>トリカイン/ E3ソリューションを削除し、1ミリリットルL-15/10％FBS培地で1回の胚を洗浄し、氷上で維持する。 注：L-15/10％FBS培地の心はをRNAlaterまたはトリゾールに移されるまで、全体の解剖手順の間に生きている臓器や細胞を維持することが重要である。 </li><li>卵黄が完全に破壊されるまで、ラウンドゲルローディングチップで胚およびピペット上下に5-8回に1ミリリットルL-15/10％FBS培地を追加します。胚が滴下溶液の表面上に、ドロップが破裂するように、ピペット胚を穏やかに破壊される。 注：どのように積極的に、どのくらいの頻度胚が上下にピペッティングしなければならないことは胚の発達段階に依存し、 すなわちより多くのピペット操作（ 例えば 56 HPFで）後期段階で必要とされている。 </li><li>解剖胚の最初のバッチのために、あまりにも静かにピペットであれば、いくつかの心は胚に付着したままかもしれないので、胚の整合性と実体顕微鏡下で解剖の心の割合を評価する。それに応じて解剖の次のラウンドのためにピペット操作の仕方を調整します。 注：プラスチック製にこだわり心を最小限に抑えるために、低保持ピペットチップとマイクロチューブを使用してください。 </li><li> 50ミリリットルの遠心チューブに置か100μmのフィルター上にサンプルを適用します。 1ミリリットルL-15/10％FBS培地で1.5mlチューブをすすぎ、その後（いくつかの心臓は、チューブの壁に付着しているかもしれません）サンプルの損失を最小にするために、フィルタにこれを適用する。 1ミリリットルLで二回フィルターを洗浄-15 / 10％FBS。このステップでは、心臓は、フィルターを通過し、50 mlチューブに回収する。 </li><li> 15ミリリットルの遠心チューブの上に配置さ30μmフィルター上にフロースルーを適用し、1ミリリットルL-15/10％FBS培地で1回フィルターをすすぐ。この第2の濾過工程においては、心臓は、フィルタ内に保持され、より小さな破片を洗い流す。 </li><li>逆さまにフィルターを回して、1ミリリットルL-15/10％FBSで3つの連続した​​回の洗浄を適用することにより、1％アガロースでコーティングされたシャーレにフィルタの外心をフラッシュする。 </li><li>蛍光実体顕微鏡下にピンセットで非蛍光胚破片（ 例えばアイレンズ）から手動で独立したGFP陽性心と皿の中央でそれらを集中する。ステップ3に従ってそれらを収集します。 注：胚が24 HPFよりも古い場合は、心は組織がまだ生理的に正常であることを示す、暴行されるべきである。 </li></ol> 3. DissecからmRNAを単離しテッドハーツ<ol><li> 0.75ミリリットルのRNAlater（氷上）を含む1.5ミリリットルチューブに可能な限り最小容量（ 例えば 、10μL）で心とピペットを収集します。何の心は、蛍光実体顕微鏡下でそれを見ることによって、ピペットチップに残っていないことを確認します。 </li><li>あるいは、化学フードは蛍光顕微鏡のすぐ近くに利用可能である場合、化学フードの下のTrizol（注意）に集め心を移す。これはピペットチップにし、また心の遠心分離中にこだわりの心の損失の可能性を回避する（3.4、3.5および3.7ステップ）。トリゾールと同じチューブに分離のいくつかのラウンドからの心をプールし、3.8のステップに直接進む。最終体積は元のトリゾール容積の10％を超えてはならない。 注：使用前にトリゾール製品安全データシート（MSDS）をお読みください。ボンネットの下にTrizol試薬を処理し、推奨される個人用保護具を着用する。皮膚、目やclothiとの接触を避けてくださいNG。発火のすべてのソースを削除します。 </li><li> RNA単離の効率が採取した組織の量を使用すると向上として、（氷上）RNAlaterで同じチューブに分離のいくつかのラウンドからの心をプール。全試料体積は、元のRNAlater体積の10％を超えると、（氷上で）保存のために0.75ミリリットルRNAlaterで追加のチューブを使用する。 </li><li>遠心機で4℃で20分間15700×gで試料は心を沈降する。 </li><li>蛍光実体顕微鏡下では、3ミリリットルL-15/10％FBS培地を含む1％アガロースでコーティングされたシャーレにできるだけ丁寧に限り多くの上清を回収したが、遠心分離管の底に沈殿し、心を乱すことがありません。心の最大15％がRNAlaterでの高粘度のために上清中に残ることができるのでステップ3.7で説明したように、それらを取得。 </li><li>化学フードの下で、沈降した心を含むチューブに0.5ミリリットルのTrizolを追加し、氷上に保つ。 </li><li>蛍光microscoの下でPEの、希釈する3ミリリットルL-15/10％FBSを有する別の1％アガロースでコーティングされた皿にRNAlater中/ L-15/10％FBS溶液を含む1％アガロースでコーティングされた皿から（ステップ3.5）からの心臓を転送RNAlaterを出。ペトリ皿の中央に心を収集し、化学フードの下のTrizol中で沈降した心のチューブに小さな音量でそれらを転送する。 </li><li>心を破壊し、室温で5分間インキュベートし、トリゾールで心を含む渦1.5mlチューブ。 </li><li>化学フードの下で、100μlのクロロホルム（注意）を追加し、完全に混合し、1.5ミリリットルに事前に紡糸しPLGチューブ（使用前に最大速度で遠心30秒）をトリゾール/クロロホルム溶液を転送する。室温で3分間インキュベートする。 注：使用前にクロロホルムのMSDSを参照してください。ボンネットの下にクロロホルム試薬を処理し、推奨される個人用保護具を着用する。皮膚、眼、そして衣服との接触を避ける。金属、アルカリなどの非互換性から遠ざけること。 </li><li> Centrifugeと4℃で15分間15700×gでのサンプルと新しい1.5mlチューブへ水相を転送する。 </li><li> 5〜10μgのグリコーゲンとイソプロパノール（-20℃で）予冷250μlのを追加します。よく混ぜ、-20℃で一晩インキュベートする。 </li><li>遠心機で4℃で30分間15700×gでサンプルし、上清を廃棄する。 </li><li> 、1ミリリットルを75％エタノールでペレットを洗浄し、4℃で15分間15700×gで遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li>それは（10〜15分間、例えば ）の白色になるまで室温でペレットを乾燥させてエタノールを蒸発さう。 </li><li>ペレットに20μlのRNaseフリーのddH 2 Oを追加し、RNAを溶解させ、55℃で10〜15分間インキュベート。その後氷上に保つ。 </li><li>吸光度測定によってRNA濃度および純度を評価。 1％アガロースゲル上でサンプルを実行して、RNAの完全性を評価する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、遺伝子発現解析のためのゼブラフィッシュ胚の心臓組織の迅速な濃縮を可能にする。 RNA精製だけで十分で動作しますので、心の喪失は、プロトコルのすべての段階で阻止される場合は、最初の、試料の量が大幅に改善されている：心臓特異的RNAサンプルの量と質が大幅にいくつかの重要なステップに依存します出発材料。次に、実験者に完全に依存したサンプルの純度は、ソートや厳密に他の組織を除外して、ペトリ皿内の心臓を収集することにより決定される。第三に、サンプルの品質は、批判的に胚の破壊の際に発生する可能性がRNAの分解を制限することに依存します。これは、細胞死を回避するために、細胞培養培地を使用し、サンプルを氷上で維持することによって達成される。心をRNAlaterまたはトリゾールに転送された後にRNAの分解が停止される。心はシャーレに暴行されていることを強力に実証する心臓トン問題は、解剖後に生理的に正常です。 私たちは、十分なRNAが安全に（一緒に5〜10μgのグリコーゲンと）沈殿させることができる、そこから少なくとも300の心（ すなわち約500胚）で始まることを...

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が広くによりサイズが小さく、蛍光タンパク質の組織特異的な発現を有するトランスジェニックレポーターラインの利用可能性と合わせて、高速で透明かつ子宮外胚発生、 インビボでの器官形成を研究するために発生生物学で使用されている。初期のゼブラフィッシュ胚の酸素は、心拍、血流に依存しないので、この小さな脊椎動物は、心臓発生を研究するために特に適している。これらの機能は、心血管の変異体1,2の多数の特徴付けを可能にしたとゼブラフィッシュは現在、心疾患3を研究するための広く認識モデル生物である。 胚発生の間の遺伝子発現を研究するために、転写物は一般にホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）4によって分析され、RT-qPCRを5、マイクロアレイ6、または次世代シークエンシング（RNA配列）7。同時にWISHは全体胚内の遺伝子発現の空間的·時間的な分析を可能にする、転写レベルは通常、RT-qPCRを、マイクロアレイまたはRNA-配列アプローチによって評価される。しかしながら、これらの方法は、特異的な遺伝子発現プロファイリングのための組織の濃縮を必要とする。 ゼブラフィッシュ胚の心臓は全体の胚のごく一部を表すので、心臓の開発中にトランスクリプトーム研究は心の解剖と濃縮のためのプロトコルが必要。また、生理学的に関連するデータを得るためには、RNA抽出まで、完全に機能的心臓組織を維持することが重要である。ここでは、急速に生理的に通常の単離及び効率的にさらなる分析のための高品質なRNAサンプルを得るために、ゼブラフィッシュの胚の数百人から心を打つためのプロトコルを記述します。本発明の方法は、バーンズとマクレー、2006年8によって報告されたプロトコルに基づいています。心臓組織の充実のために、両方の方法は、トランスジェニック心筋のレポーターラインを使用する他の組織に対するゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性を利用する。簡単に言えば、狭いピペットチップを通して上下に多くの胚をピペッティングすることにより、心臓を同時に胚の体から解放され、その後、2急速ろ過段階で胚の破片から分離。蛍光標識した心は、手動で残りの破片から選別し、さらなる処理のために収集されます。

<table><tbody><tr><td>魚の飼育と卵の収集のための機器&nbsp;</td><td></td><td></td><td>詳細はゼブラフィッシュBook11</td></tr>をご覧ください <tr><td>蛍光実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵微量遠心機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV分光光度計</td><td></td><td></td><td>例えば Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>核酸電気泳動チャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿4cm&Oslash;、E3媒体</td><td></td><td></td><td></td>マイクロ</tr><tr><td>ピペットとチップ(P20、P100、P1000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml遠心分離チューブ15ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>と50ml遠心分離チューブデュ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モン#5鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>のペアでコーティングExactaCruz&trade;滅菌ラックの丸型ゲルローディングのヒント、1-200&mu;l&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>sc-201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;mフィルター (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu;mフィルター(プレセパレーションフィルター-30&micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes&nbsp;</td><td>プライム</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>エッグウォーターミディアム</td><td></td><td></td><td>60&mu;g/ml インスタント オーシャン シー ソルト ddH2O、0.00001% (w/v) メチレン ブルー</td></tr><tr><td>E3 培地&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Tricaine (3-amino 安息香酸エチルエステル)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml Tricaine Stock Solution, pH 7</td></tr><tr><td>1% Agarose (in E3 medium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% アガロースゲル (TBE buffer 中)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&acute;s L-15 ミディアム&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 &micro;g/&micro;l RNaseフリー水</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% エタノール (DEPC-ddH2O中)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ヌクレアーゼフリー水または滅菌済み DEPC 処理済み ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr> 電気泳動<tr><td></td>用核酸ローディングバッファー <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE(トリス/ホウ酸塩/EDTA)バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

ゼブラフィッシュ胚の心臓は胚全体のごく一部を表す、わずか数百の細胞から構成されている。したがって、グローバル胚トランスクリプトによってマスクされているから心臓のトランスクリプトームを防止するためには、さらなる分析のために心臓の十分な数を収集する必要がある。ゼブラフィッシュの心臓の開発が急速に進行していくまた、心臓の収集およびRNA抽出方法は、サンプルの均一性を確保するために迅速である必要がある。ここでは、ゼブラフィッシュの胚から機能/鼓動心を収集するための迅速な手動の解剖プロトコルを提示する。これは、トランスクリプトーム解析によって、このような定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCRの）として、心臓特異的な遺伝子発現レベルを決定するために、後続の心臓特異的RNA抽出のための必須の前提条件である。この方法は、他の組織と比較して、ゼブラフィッシュ胚の心臓の差動接着特性に基づいている。これは、迅速なPHYが可能になり流体せん断力の中断、段階的にろ過およびトランスジェニック、蛍光標識された心のマニュアルコレクションの組み合わせによる心外組織から心臓のsical分離。

独占的に心筋（図1）内twu34トランスジェニック系統9、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する：ここでは、ゼブラフィッシュのTg（GFP myl7）を使用して、代表的な心臓の解剖実験について説明します。我々は、解剖心、それらが心臓サンプルの純度を評価するために誘導された胚の両方を収集した。簡単に言えば、ホモ接合のTg（myl7：GFP）は、すべての胚の心臓をGFP標識したように、ゼブラフィッシュ9は 、野生型と外部交配しtwu34。いくつかの500の胚（56ゼブラ）を1.5 mlチューブに移した（約100の胚を各）（図1A1、図1B）。プロトコルセクション（ステップ2）および図1（a）に記載したように各チューブを加工した。ハーツは、ピが発表し、上下に数回（図1A2）した後、100μmのフィルターに塗布した（図1A3）。胚組織の大きな部分は、このフィルターに保持された。この画分を取得し、foをトリゾールに入れ「胚心なし」のRNAサンプル（図1A3）を取得するには...

ゼブラフィッシュの心臓発生中の心臓遺伝子発現プロファイルを分析するために、総RNAを単離した心臓から抽出されなければならない。ここでは、心臓特異的mRNAを得るために、ゼブラフィッシュの胚からの迅速な手動の切開によって、機能/鼓動心を収集するためのプロトコルを提示する。

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

この手順の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの胚から迅速な手動解剖によって心臓を収集し、心臓固有のMr.NA.Thisを得ることです。次に、解剖された心臓は、2つの迅速なろ過ステップで胚の破片から分離されます。次に、蛍光標識された心臓は、残りの破片から手動で選別されます。最後に、採取した心臓から心臓特異的なRNAを抽出します。最終的に、心臓解剖プロトコルを使用して、トランスクリプトーム解析を実行するのに十分な量の胚性心臓を収集します。この方法は、シルバーフィッシュの心臓発生分野で重要な質問をするのに役立ち、例えば、どの転写物が異なる発生段階で心臓内で発現されるか、また野生と変異体の心臓発現を比較するのに役立ちます心臓抽出用のゼブラフィッシュ胚を得るために、トランスジェニックマイルセブンEGFPなどの心臓内で蛍光タンパク質を発現する成体トランスジェニック魚を実体顕微鏡下で交配します。胚の発達を監視します。心臓が実際に蛍光標識されていることを確認し、胚が目的の段階に達したときに手動で胚をデコレートします。約100個の胚を1.5ミリリットルのフュージチューブに移し、E3ミディアムにトリカ1ミリリットルあたり16ミリグラムのポイントを追加して麻酔をかけます。チューブを氷の上に置きます。トリカ溶液を取り出し、1ミリリットルの氷冷L 15 10%FBS培地を使用して胚を洗浄し、氷の上に保ちます。この洗浄液を取り除いた後、L 15 FBSを1ミリリットル加え、丸いゲルローディングチップを使用して胚を5〜8回上下にピペットで動かし、卵黄を完全に破壊し、溶液の表面に胚を滴下して液滴が破裂し、胚が穏やかに破壊されるようにします。実体顕微鏡下で解剖された胚のこの最初のバッチでは、それらの完全性と解剖された心臓の割合を評価し、それに応じてピペッティングの方法を調整します。その後のバッチでは、100 μmのフィルターを50 mLの遠心分離チューブにセットし、胚性サンプルを塗布します。次に、1ミリリットルのL 15 FBSを使用してフージチューブをすすぎ、溶液をフィルターに塗布して、フィルターに残った心臓を洗い流します。L 15 FBSを使用して2回洗ってください。次に、30マイクロメートルのフィルターを15ミリリットルの遠心分離チューブに置き、心臓を含むフロースルーを塗布します。L 15 FBSを使用してこのフィルターをすすぎ、心臓を保持し、小さな破片を洗い流します。次に、30マイクロメートルのフィルターをアグロスコーティングされたペトリ皿の上に逆さまにし、L 15 FBS培地の1ミリリットルの洗浄を3回適用して、フィルターから心臓を洗い流します 蛍光顕微鏡の下で、一対の鉗子を使用してGFP陽性の心臓を非蛍光組織から手動で分離し、それらを皿の中央に集中させます。心臓の生理機能は、解剖後もまだ鼓動しているため、正常に見えます。プロシージャ。心臓からmRNAを単離するには、可能な限り少量の培地にmRNAを採取し、0.75ミリリットルのRNAを含む氷上の1.5ミリリットルのチューブにピペットで移します。後で蛍光顕微鏡下で。ピペットチップを表示して、ピペットチップに心臓がくっついていないことを確認します。テキストプロトコルに従って、後で数回の単離から心臓をRNAのチューブに引き込んだ後、15、700G、摂氏4度で20分間サンプルを遠心分離します。次に、蛍光顕微鏡下で、できるだけ多くのセートを慎重に収集し、3ミリリットルのL 15 10%FBS培地を含む1%アグロスコーティングされたペトリ皿に移します。次に、化学フードの下で、沈殿した心臓を含むチューブに0.5ミリリットルのトリオールを追加し、氷上に保ちます蛍光顕微鏡の下で、上清に残った心臓を新鮮な1%アグロスコーティング皿に移しますL 15 10%FBSで、後で非常に粘性の高いRNAを希釈します。次に、心臓を少量に集め、それらを三重に沈殿した心臓のチューブに移して心臓を破壊し、チューブをボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。次いで、化学フードの下に、クロロホルム混合物の100マイクロリットルを十分に加え、溶液を1.5ミリリットルのPrepUに移し、PLGチューブ室温で3分間インキュベートし、サンプルを15,700Gsおよび摂氏4度で15分間遠心分離し、水相を新しい1.5ミリリットルのチューブに移す。次に、5〜10マイクログラムのグリコーゲンと250マイクロリットルの予冷済みイソプロパノールを追加します。よく混ぜ合わせ、翌日マイナス20°Cで一晩インキュベートします。サンプルを15、700G、摂氏4度で30分間遠心分離し、スナットを廃棄します。75%エタノールの1ミリリットルを適用してパレットを洗浄し、遠心分離機を洗浄し、スナットを廃棄します。残りのエタノールを室温でペレットから蒸発させ、ペレットが白くなるまで待ちます。20マイクロリットルのRNAを含まない二重蒸留水をペレットに加え、55度で10〜15分間インキュベートしてRNAを溶解します。次に、チューブを氷の上に置きます。分光光度計を使用してRNA濃度と純度を決定し、1%agrosゲル上でサンプルを実行して、受精後56時間と受精後36時間で胚の破片から選別する前の心臓サンプルのRNAサンプルのRNAaA比較を評価します。受精後56時間の胚は、濾過後の受精後36時間よりも多くの胚の破片を産出しました 56 HPF心臓サンプルの純度を決定するために、心臓と追加の心臓転写産物の発現レベルをR-T-Q-P-C-Rによって比較しました。このゲルは、単離された心臓と心臓のない破壊された胚から抽出されたRNAを示しています。吸光度測定により、300個の心臓から約660ナノグラムのRNAが得られたことが明らかになりました。これは、最終容量が20マイクロリットルの場合、マイクロリットルあたり33ナノグラムです。相対的遺伝子発現レベルは、ここに示すマーカーのR-T-Q-P-C-R実験によって計算されました。予想通り、マイル7は、ここに見られるように心臓サンプルのない胚と比較して、心臓サンプルで非常に濃縮されていました。内皮細胞マーカーであるKDRLは、心臓で中程度に濃縮されていました。赤血球マーカーのヘモグロビンβ胚1.1は、解剖後も心臓がまだ鼓動していたにもかかわらず、心臓サンプルで過剰に発現しており、心臓から赤血球を排出するはずでした。レンズマーカーαA結晶とCNSマーカーのコントラストレベルでは、心臓サンプルのGFAPが大幅に減少しました。これらの結果は、心臓解剖プロトコルがゼブラフィッシュの全胚から高品質の心臓特異的RNAを生成することを示しています。この実験では、解剖手順中に心臓を失うのを避けるために、サンプルを監視することが重要です。

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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このプロトコルの目標は、生理学的および病理学的条件の下で胚性ゼブラフィッシュにおけるセグメント性心機能の評価のための新しい方法を詳述することです。...

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光シート蛍光顕微鏡で 生体内...

ゼブラフィッシュ胚における高速心臓ダイナミクスの光シート顕微鏡

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の心臓形態と機能を評価するための低コストの光学顕微鏡法を説明しており、高度なイメージングシステムを必要とせずに発生性心毒性の再現性評価を可能にします。...

標準顕微鏡とビデオ分析を使用したゼブラフィッシュ胚の機能的心臓イメージング: 環境および生物医学研究への応用

本研究は、個々のゼブラフィッシュ胚性心臓における全域DNAメチル化を定量化するための高感度免疫蛍光を用いたイメージング法を確立します。この方法は限られた組織材料の課題を克服し、亜硫酸水素変換の必要性を回避します。...

ゼブラフィッシュ幼虫の心臓における全局DNAメチル化の検出

学ぶゼブラフィッシュ胚からの心臓解剖法で、心臓特異的RNAを抽出し転写解析を行う技術です。発生段階別の遺伝子発現プロファイルを調べ、心臓発生のメカニズム解明に貢献します。

転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

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