ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

この手順の全体的な目標は、2つのタンパク質またはタンパク質ドメイン間の相互作用をマッピングすることです。この場合、がん関連タンパク質ドメインはまだ研究されており、CHFRが研究されています。この手順の全体的な目標は、2つのタンパク質またはタンパク質ドメイン間の相互作用をマッピングすることです。

この場合、がん関連タンパク質ドメインはまだ研究されており、CHFRが研究されています。第2のステップは、CHFRペプチドアレイをその結合パートナーである静止タンパク質とインキュベートすることです。次に、アレイを洗浄し、標識抗体である西洋わさびペルオキシダーゼとインキュベートします。

次に、アレイを化学発光検出にかけ、結合を検出します。最後のステップは、結果を分析し、タンパク質間の結合部位を特定することです。この研究は、制御されていない相互作用が癌の発症につながる可能性のある、まだCHFR結合の合理的な阻害剤を設計する道を開きます。

この方法は、瞑想する特定の領域は何かなど、タンパク質相互作用の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます 2つのタンパク質間の相互作用、ターゲットタンパク質の配列を10〜20残基ペプチドに分割します。それは部分的に重なっています。オーバーラップの量は変えることができますが、原則として、オーバーラップが長ければ長いほど良いです。

ペプチドを設計する際には、相互作用に関与する可能性のあるタンパク質の既知の二次構造要素を考慮に入れてください。設計されたペプチドアレイは、商用ベンダーを通じて注文できます。この実験では、CHFRドメイン残基4 24から6 62までのペプチドがC末端を介してアレイに共有結合しています。

設計された配列を受け取ったら、まずそれをブロックして非特異的結合を防ぐことで実験の準備をします。体積あたり2.5%の重量のブロッキング溶液を作成します。0.05%Tween 20またはTBSTを含むトリス緩衝液に粉乳を脱脂し、非特異的結合を防ぎます。

アレイを5ミリリットルのブロッキング溶液に浸します。アレイを室温で2〜4時間、またはシェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。最初にアレイを5ミリリットルのブロッキング溶液で30秒間洗浄します。

次に、アレイを5ミリリットルのTBSTで室温のシェーカーで5分間2回洗浄します。次に、洗浄したアレイを、1容量あたり2.5%の重量を含む5ミリリットルのポリヒスチジンタグ付きタンパク質溶液とインキュベートします。非特異的結合を防ぐために粉乳を脱脂します。

ここでは、まだタンパク質残基500〜650の4.5マイクロモル溶液が使用される。次に、アレイをタンパク質溶液中で室温で3〜8時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。タンパク質溶液中でのインキュベーション後。

アレイを5ミリリットルのTBSTで室温のシェーカーで30秒間洗浄し、続いてさらに5分間の洗浄を2回行います。次に、洗浄したアレイを5ミリリットルの希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体と、ブロッキング溶液と同じ濃度の同じ成分を含むインキュベーションバッファーに室温のシェーカーで1時間インキュベートすると、抗体は標的タンパク質またはタグのいずれかに結合し、コントロール実験を行い、別のアレイで同じプロトコルを繰り返すことにより、アレイ上の抗体とペプチドとの相互作用を試験できますタンパク質とインキュベートせずにスライドさせてから、アレイを読み取ります。以前と同じように5ミリリットルのTBSTで洗います。

強化された化学発光ウェスタンブロッティング基質キットを使用して化学発光開発を実施します。富士フイルムのLAS 3000カメラなどの発光画像分析装置で検出を行います。結果を解析し、配列上の両方の重複が同じ信号を示していることを確認して、結果の信頼性を確保します。

タンパク質パートナーの構造がわかっている場合は、結合ペプチドの構造を検索し、結合部位を探します。配列の遠くにあるペプチドは、三次構造で一緒に存在し、結合部位を作り出すことができることに留意してください。この例では、Stillは正常な細胞分裂を制御する非常に重要なCentro Somalタンパク質であり、細胞増殖はその天然変性領域を通じていくつかのタンパク質と相互作用します。

設計したペプチドアレイを用いて、がん抑制因子CHFRのまだ結合している部位を明らかにしました。配列内の各黒いスポットは、A-C-H-F-R由来のペプチドを表しており、各ペプチドは重複して存在するため、各ペプチドが2回出現することに注意し、結果の信頼性を検証しています。ペプチドアレイのスクリーニングにより、まだ天然変性領域の残基500〜6に結合する7つのCHFR由来ペプチドが明らかになった50。

これらの結果により、CHFR上の静止画の結合部位をマッピングすることができました。CHFR一次配列上のこれら7つのペプチドの距離にもかかわらず。それらは、CHFR三次構造中の静止画の明確に定義された結合部位を作成します。

この方法は、この手順に従って、すべてのタンパク質タンパク質相互作用の特性評価に適用できます。蛍光や同位体、ITCなどの定量法を使用して、ペプチド導入を定量化する必要があります。