Name: ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶペプチドアレイスクリーニングでがん関連タンパク質stillとCHFRドメインの相互作用部位を同定する方法。このハイスループットアッセイは、新規治療標的の発見に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AFは欧州共同体の第7次フレームワーク·プログラムの下での欧州研究評議会から始まる助成金によってサポートされていました（FP7 / 2007年から2013年）/ ERCグラント契約がn 203413を°、複雑なsystems.HAバイオハイブリッドとAIのためのミネルヴァセンターがサポートされていますダリアとダン·メイダンフェローシップによるエルサレムのヘブライ大学で高度な学位学生のため。

1.ペプチドアレイの設計<ol><li>一部は10〜20残基の重複ペプチドへの標的タンパク質の配列を分割する。具体的な実験と行うラボのリソースにオーバーラップの量を変化させるが、原理的にはより長いオーバーラップがより良い。ペプチドを設計する場合の相互作用を担当することができるタンパク質の二次構造要素を知ら考慮する。 </li><li>商業ベンダーを通じて設計されたペプチドアレイを注文。ここでは、共有結合C末端を通じてアレイに結合したペプチドを使用しています。 </li></ol> 2.非特異的結合をブロック<ol><li> NaClで0.05％のTween 20（TBST / PBST）を含む50mMトリスまたはリン酸緩衝液を作り、（正確なイオン強度を知るために）のHClまたはNaOHの測定量で所望のpHに調整し、所望のイオン強度。ここでは、7.5のpHおよび150mMのイオン強度を使用しています。 </li><li>ブロッキング溶液を作っ2.5％（w / vの）をTBST / PBST中脱脂粉乳。 </li><li>非特異的結合を防ぐために、ブロッキング溶液5mlにアレイを浸す。室温または一晩シェーカー上で4ºCで2〜4時間の配列をインキュベートする。 </li></ol> 3.タンパク質とインキュベート<ol><li>室温でシェーカー上で5分間5ミリリットルTBST / PBSTで二回、次に30秒間ブロッキング溶液と5mlで最初の配列を洗ってください。 </li><li> （w / v）の非特異的結合を防ぐために、脱脂粉乳、2.5％を含有するHisタグ化タンパク質溶液5mlで洗浄し、アレイをインキュベートする。ここでは、説明したブロッキング溶液中に溶解したタンパク質溶液の4.5μM（STIL 500〜650）を使用します。 NOTE：通常5-10μMタンパク質は（スクリーニングに使用されるが、タンパク質濃度は、結合親和性及びアレイで結合したペプチドの局所濃度に依存して、2-3μMでさえ低くすることができる効率合成）。バッファ内のタンパク質変化するが、上記と同じブロッキング溶液を用いてタンパク質を希釈することが一般的であることができ溶解する。 </li><li>室温または一晩、4ºCで3-8時間、タンパク質溶液中の配列をインキュベートする。 </li></ol> 4.抗体とインキュベート<ol><li> 5ミリリットルTBST / PBSTで配列を3回洗う。最初の洗浄は、室温でシェーカー上に2つの5分間の洗浄、続いて30秒間である。 </li><li>室温でシェーカー上で1時間、ブロッキング溶液と同じ濃度で同じ成分を含有するインキュベーション緩衝液中で：希釈したHRP結合抗体（1,500 1）5mlで洗浄し、アレイをインキュベートする。抗体が標的タンパク質またはタグのいずれかを結合することができる。 </li><li>セントせずに同じプロトコルを繰り返すことにより、アレイは、標的タンパク質（ 例えば 、オリゴマー化のための研究）からのペプチドが含まれている場合は特に、アレイ上のペプチドと抗体との相互作用を試験する対照実験を行うp 3が、タンパク質と共にインキュベートする。 </li><li> 5ミリリットルTBST / PBSTで配列を3回洗う。最初の洗浄は、室温でシェーカー上に2つの5分間の洗浄、続いて30秒間である。 </li></ol> 5.アレイを読む<ol><li> ECLウエスタンブロッティング基質キットで化学発光開発を行う。 </li><li>発光画像解析装置で検出を行う。 </li><li>結果を分析します。アレイ上の両方の重複が同じシグナルを示すので、結果は信頼性があることを確認してください。タンパク質パートナーの構造がわかっている場合、結合ペプチドのための構造上の検索および結合部位を探します。遠くの順序で並んでいても、ペプチドは、三次構造に一緒に近くなるとの結合部位を作成することができます。 </li></ol>

<ol><li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptides+to+study+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using peptides to study protein–protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li>
<li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot-synthesis%3A+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable%2C+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li>
<li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li>
<li>Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Mapping+of+Linear+Antibody+Epitopes+in+Human+Serum+Albumin+Using+High-Density+Peptide+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays.</a> PLoS ONE. 8 (7), (2013).</li>
<li>Uecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+peptide+for+the+FLT3+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase.</a> British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).</li>
<li>Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+studies+using+peptide+arrays%3A+the+example+of+HIV-1+Rev-integrase+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction.</a> Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique%3A+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports%E2%80%94principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li>
<li>Innovative Peptide Solutions. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jpt.com">http://www.jpt.com</a> (2014).</li>
<li>PEPSCAN shaping peptides to perfection. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.pepscan.com">http://www.pepscan.com</a> (2014).</li>
<li>Intavis Bioanalytical Instruments. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.intavis.com">http://www.intavis.com</a> (2014).</li>
<li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li>
<li>Castiel, A., Danieli, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stil+protein+regulates+centrosome+integrity+and+mitosis+through+suppression+of+Chfr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr.</a> Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).</li>
<li>Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STIL+protein+contains+intrinsically+disordered+regions+that+mediate+its+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions.</a> Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).</li>
<li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li>
<li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li>
<li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li>
<li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li>
<li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li>
<li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li>
<li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li>
<li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li>
<li>Olaussen, K. a, Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li>
<li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Vif%E2%80%93A3G+interaction+using+peptide+arrays%3A+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li>
<li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li>
<li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+%28tBID%29+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+%28MTCH2%29+Protein%3A+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li>
<li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ペプチドアレイスクリーニングは、そのパートナーで標的タンパク質の結合部位を同定するための優れたツールである。このアッセイは、実行するために迅速かつ容易であり、結果は、1つまたは2つの営業日で得ることができる。ペプチドアレイスクリーニングは汎用性があり、多くの目的に使用することができる。これは、リン酸化などの翻訳後の修飾を特徴付けるし、キナーゼの基質を同定するために使用することができる。例えば：骨髄性白血病急性する関連するFLT3キナーゼ、ペプチドアレイ6をスクリーニングすることにより発見さチロシン含有基質ペプチドをリン酸化する。チロシンキナーゼ阻害剤パゾパニブおよびラパチニブの阻害特性は、23のスクリーニングのペプチドアレイを用いて試験した。ペプチド配列は、タンパク質 - タンパク質相互作用を媒介する部位を同定するために使用することができる。この方法を使用して私たちの研究室で研究このようなタンパク質の例は：HIV-1 Vifタンパク質と細胞A3Gタンパク質間の相互作用は、私たちを特徴付けたペプチドアレイ24る。ペプチドアレイスクリーニングは、プロアポトーシスタンパク質AS...

タンパク質 - タンパク質相互作用は、生細胞内のプロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、タンパク質相互作用を研究するための優れたツールとして役立つ。ペプチドは容易に合成され、一方、他方の1,2-高スループット様式での複数のタンパク質標的上の特定の相互作用部位に焦点を可能にすることができるからである。ペプチドアレイスクリーニングは、短時間3に多数のパートナーと標的タンパク質との相互作用に関する大量のデータを得るための方法を実行するのは簡単、高速で。タンパク質 - タンパク質相互作用を検出し、分析するための他の生化学的または生物物理学的方法とは異なり、ペプチドアレイスクリーニングは、タンパク質の非常に低い濃度を必要とし、非常に弱い結合を検出することができる。ペプチド配列は、酵素活性6と高スループットを研究する抗体エピトープ5を特徴付ける、そのようなタンパク質-タンパク質または受容体-リガンド相互作用部位4、ホモまたはヘテロオリゴマー化インターフェースのマッピングのようなペプチド-タンパク質相互作用の多くの用途に使用することができる構造-活性関係（SAR）は7を研究。ペプチドアレイのスクリーニングについての詳細なレビューについてはカッツらを参照してください。4 ペプチドアレイのいくつかのタイプは、現在存在している。固体支持体にそれらを取り付ける前に、ペプチドの合成、または固体支持体上に直接ペプチドの合成は主に、SPOT技術の4,8を使用して、：ペプチドアレイを作製するための2つの主要な合成戦略があります。ザ·ペプチドは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）化学8、通常、固体支持体上で合成される。一般的な合成スキームの中でC末端を介してペプチドのN末端 ​​を介してアタッチメント（ 例えば、JPTのpepstarアレイ9）およびペプチドアタッチメントがある（ 例えば、PEPSCANのpepchipアレイ10、JPTのペプスポットアレイ9とINTAVISのcelluspotアレイ11）4。固体支持体は変わるので、それへのペプチド結合の化学を行いますことができます。システイン-末端ペプチドは、チオール基12を介してスライドガラスに付着させることができる。ペプチドのN末端 ​​に共有結合したアミノ酸のエステル化セルロース膜上のヒドロキシル基に結合することができる8を取り付け。 ここでは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための方法として、ペプチドアレイをスクリーニングするための詳細なプロトコールを提示する。私たちが使用する配列は、大規模なAMOを含むマイクロアレイであるCelluspots配列ですスライドガラスでサポートされている小さなセルロース膜上にスポット（最大384スポットの重複）のUNT。これは、低タンパク質のボリュームと抗体と協力し、一回の実験あたりのデータのかなりの量を得ることができます。この配列はまた、低親和性結合の検出を可能にする高いペプチド密度が含まれています。アレイは、正常な細胞増殖13を制御するために非常に重要であるSTIL、CHFRの相互作用をマッピングするために使用した。 2つのタンパク質間の制御されない相互作用が癌の発生につながる可能性がある。この相互作用をマッピングすることによって、私たちは、特定の結合部位を発見し、残基14を結合。これは、このタンパク質 - タンパク質相互作用を阻害する阻害剤の合理的設計のための道を開く。

<table><tbody><tr><td>ペプチドアレイ</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe 抗体 (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biological industries</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 camera&nbsp;</td><td>富士フイルム</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

タンパク質 - タンパク質相互作用は、生物の生きている細胞および対照恒常性プロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、ペプチドを容易に合成することができるので、タンパク質相互作用を研究し、特定の相互作用部位に焦点を可能にするための優れたツールを提供。ペプチドアレイは、2つのタンパク質間の相互作用部位の同定、ならびに治療目的のために、標的タンパク質に結合するペプチドのスクリーニングを可能にする。彼らはまた、高スループットのSAR研究を可能にします。結合部位の同定のため、typi校正ペプチドアレイは、通常、部分的に、所望の標的タンパク質の1つまたは複数のパートナータンパク質の完全な配列に由来する10〜20残基の重複ペプチドが含まれています。標的タンパク質を結合するためのアレイをスクリーニングするタンパク質の少量のみを使用して簡単かつ迅速な方法では、パートナータンパク質における結合部位に対応し、結合ペプチドを明らかにする。 この記事では、標的タンパク質とそのパートナーの間の相互作用部位をマッピングするためのペプチド配列をスクリーニングするためのプロトコルを記述します。ペプチドアレイを考慮し、それらの二次構造をとるパートナータンパク質の配列に基づいて設計されている。このプロトコルで使用されるアレイは、INTAVISバイオ分析·インスツルメンツによって調製しCelluspots配列だった。アレイは、非特異的結合した後、勉強タンパク質とインキュベートを防ぐためにブロックされます。抗体を用いた検出は、タンパク質間の特定の相互作用部位に対応する結合ペプチドを明らかにする。

STILは非常に重要な中心体タンパク質である。 19 -これは、正常な細胞分裂および細胞増殖13,15を制御する。 STILいくつかのタンパク質18,20,21と相互作用し、相互作用の大部分は、本質的に無秩序領域（IDR）14は 、その中央部を介して起こる。私たちは、STIL結合タンパク質CHFR由来のペプチドで構成される配列を設計しました。 CHFR応力22を有糸分裂に応答して誘導される腫瘍抑制因子である。 CHFRのSTIL結合ドメインの構造は時に不明であったため、プロトコルのステップ1.1で説明したように、私たちは、7残基の重複を有する15残基の長さのペプチドにタンパク質ドメインを分割。上記のプロトコルで詳述し、 図1に示すように、我々は、CHFR、STILの結合部位を同定するためのスクリーニングペプチドアレイを行った、我々は提供することができる二重に384のペプチドから成るINTAVIS Celluspotアレイを使用 図2に示されたように大量の情報。...

Peptideアレイスクリーニングは、タンパク質間相互作用部位を同定するためのハイスループットアッセイです。これにより、標的タンパク質の複数の相互作用をマッピングすることができ、タンパク質を標的とする阻害剤の部位を同定する方法として役立つことができます。ここでは、ペプチドアレイのスクリーニングと解析のためのプロトコールについて説明します。

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

この手順の全体的な目標は、2つのタンパク質またはタンパク質ドメイン間の相互作用をマッピングすることです。この場合、がん関連タンパク質ドメインはまだ研究されており、CHFRが研究されています。この手順の全体的な目標は、2つのタンパク質またはタンパク質ドメイン間の相互作用をマッピングすることです。この場合、がん関連タンパク質ドメインはまだ研究されており、CHFRが研究されています。第2のステップは、CHFRペプチドアレイをその結合パートナーである静止タンパク質とインキュベートすることです。次に、アレイを洗浄し、標識抗体である西洋わさびペルオキシダーゼとインキュベートします。次に、アレイを化学発光検出にかけ、結合を検出します。最後のステップは、結果を分析し、タンパク質間の結合部位を特定することです。この研究は、制御されていない相互作用が癌の発症につながる可能性のある、まだCHFR結合の合理的な阻害剤を設計する道を開きます。この方法は、瞑想する特定の領域は何かなど、タンパク質相互作用の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます 2つのタンパク質間の相互作用、ターゲットタンパク質の配列を10〜20残基ペプチドに分割します。それは部分的に重なっています。オーバーラップの量は変えることができますが、原則として、オーバーラップが長ければ長いほど良いです。ペプチドを設計する際には、相互作用に関与する可能性のあるタンパク質の既知の二次構造要素を考慮に入れてください。設計されたペプチドアレイは、商用ベンダーを通じて注文できます。この実験では、CHFRドメイン残基4 24から6 62までのペプチドがC末端を介してアレイに共有結合しています。設計された配列を受け取ったら、まずそれをブロックして非特異的結合を防ぐことで実験の準備をします。体積あたり2.5%の重量のブロッキング溶液を作成します。0.05%Tween 20またはTBSTを含むトリス緩衝液に粉乳を脱脂し、非特異的結合を防ぎます。アレイを5ミリリットルのブロッキング溶液に浸します。アレイを室温で2〜4時間、またはシェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。最初にアレイを5ミリリットルのブロッキング溶液で30秒間洗浄します。次に、アレイを5ミリリットルのTBSTで室温のシェーカーで5分間2回洗浄します。次に、洗浄したアレイを、1容量あたり2.5%の重量を含む5ミリリットルのポリヒスチジンタグ付きタンパク質溶液とインキュベートします。非特異的結合を防ぐために粉乳を脱脂します。ここでは、まだタンパク質残基500〜650の4.5マイクロモル溶液が使用される。次に、アレイをタンパク質溶液中で室温で3〜8時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。タンパク質溶液中でのインキュベーション後。アレイを5ミリリットルのTBSTで室温のシェーカーで30秒間洗浄し、続いてさらに5分間の洗浄を2回行います。次に、洗浄したアレイを5ミリリットルの希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体と、ブロッキング溶液と同じ濃度の同じ成分を含むインキュベーションバッファーに室温のシェーカーで1時間インキュベートすると、抗体は標的タンパク質またはタグのいずれかに結合し、コントロール実験を行い、別のアレイで同じプロトコルを繰り返すことにより、アレイ上の抗体とペプチドとの相互作用を試験できますタンパク質とインキュベートせずにスライドさせてから、アレイを読み取ります。以前と同じように5ミリリットルのTBSTで洗います。強化された化学発光ウェスタンブロッティング基質キットを使用して化学発光開発を実施します。富士フイルムのLAS 3000カメラなどの発光画像分析装置で検出を行います。結果を解析し、配列上の両方の重複が同じ信号を示していることを確認して、結果の信頼性を確保します。タンパク質パートナーの構造がわかっている場合は、結合ペプチドの構造を検索し、結合部位を探します。配列の遠くにあるペプチドは、三次構造で一緒に存在し、結合部位を作り出すことができることに留意してください。この例では、Stillは正常な細胞分裂を制御する非常に重要なCentro Somalタンパク質であり、細胞増殖はその天然変性領域を通じていくつかのタンパク質と相互作用します。設計したペプチドアレイを用いて、がん抑制因子CHFRのまだ結合している部位を明らかにしました。配列内の各黒いスポットは、A-C-H-F-R由来のペプチドを表しており、各ペプチドは重複して存在するため、各ペプチドが2回出現することに注意し、結果の信頼性を検証しています。ペプチドアレイのスクリーニングにより、まだ天然変性領域の残基500〜6に結合する7つのCHFR由来ペプチドが明らかになった50。これらの結果により、CHFR上の静止画の結合部位をマッピングすることができました。CHFR一次配列上のこれら7つのペプチドの距離にもかかわらず。それらは、CHFR三次構造中の静止画の明確に定義された結合部位を作成します。この方法は、この手順に従って、すべてのタンパク質タンパク質相互作用の特性評価に適用できます。蛍光や同位体、ITCなどの定量法を使用して、ペプチド導入を定量化する必要があります。

identifying-protein-protein-interaction-sites-using-peptide-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。...

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

このビデオでは、ビオチン化細胞透過性ペプチドを使用して細胞内のタンパク質間相互作用を検出する技術を示しています。細胞透過性ペプチドは、結合ペプチドが細胞内に侵入し、その相互作用タンパク質に特異的に結合するのを促進します。ビオチンは、アビジンに結合した後、細胞溶解物から相互作用するタンパク質の複合体を精製することができます。...

タンパク質間相互作用を検出するためのビオチン化細胞透過性ペプチドプローブ

このビデオでは、ペプチドマイクロアレイ技術を適用して、ヒストンペプチド上の翻訳後修飾(PTM)を認識する抗体の特異性をプロファイリングする技術を示しています。既知のPTMの組み合わせを持つ固定化された蛍光色素標識ヒストンペプチドを含むマイクロアレイスライドを、標的PTM特異的抗体で処理します。このプロセスは、標的に対する抗体の特異性と、非標的PTMとの潜在的な交差反応性を特定するのに役立ちます。...

抗体の特異性プロファイリングのためのペプチドマイクロアレイ技術

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

タンパク質相互作用：SILACの免疫沈降実験は、新規タンパク質を発見するための強力な手段を表す。対照および試験試料の両方におけるタンパク質存在量の正確な相対的定量を可能にすることによって、真の相互作用は、実験的な汚染物質から容易に区別することができ、低親和性相互作用は、あまりストリンジェントな緩衝液条件を使用することによって保存した。...

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

SPOT法で合成されたPeptideアレイは、Protein lysine...

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。...

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ...

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

学ぶペプチドアレイスクリーニングでがん関連タンパク質stillとCHFRドメインの相互作用部位を同定する方法。このハイスループットアッセイは、新規治療標的の発見に有用です。

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

さらに動画を探す