複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

この手順の全体的な目標は、嚢胞性線維症の喀痰などの複雑な宿主関連サンプルを収集および処理し、メタゲノムおよびメタトランスクリプトームアプローチを使用してウイルスおよび微生物群集を研究することです。これは、最初に被験者にネブライザーを介して 7% の高張生理食塩水を吸入し、次に 30 分間にわたって誘導された喀痰サンプルを収集することによって達成されます。次に、サンプルを直ちに均質化し、ウイルスメタゲノム、微生物メタゲノム、メタトランスクリプトーム、および余分な喀痰とラベル付けされた4つのチューブに均等に分配します。

次に、メタトランスクリプトームチューブを密封し、水平に配置し、喀痰を中速で10分間均質化します。最後に、個々のアリコートは、メタゲノム研究のための核酸単離の前にウイルスまたは細菌細胞を単離および精製するために別々に処理されます。最終的に、単離された核酸は、メタゲノミクスおよびメタトランスクリプトミクスライブラリを生成するためのハイスループットシーケンシングライブラリ調製に使用されます。

この手順の主な利点は、DNAおよびRNAレベルでのウイルスおよび細菌群集の研究のための複雑な宿主関連サンプルを処理するための包括的なワークフローを提供することです。サンプルの適切な取り扱いを確保するためには、サンプルの前処理ステップが重要である一方で、ウイルスおよび微生物細胞の精製ステップは習得が難しいため、この手順の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です 手順の複雑さのため サンプル収集の前に、サンプルごとに4本の15ミリリットルチューブに次のようにラベルを付けます。 2つ目は微生物メタゲノム番号3、メタトランスクリプトームとチューブ番号4は追加の喀痰です。メタトランスクリプトームとラベルされたチューブに2ミリリットルの0.1ミリメートルシリカビーズを加え、続いて6ミリリットルのギネイソチオシアネートベースのRNA溶解バッファーまたはGITC溶解バッファーを加えます。

テキストプロトコルに概説されているサンプル収集手順に従って、プレウェイドサンプルカップを使用して、サンプル収集後にカップを計量し、空のカップの重量を差し引くことにより、サンプル量を推定します。残りの重量については、1グラムは1ミリリットルのサンプルに相当します。サンプルの容量が8ミリリットル未満の場合は、0.02マイクロメートルの適切な容量を1つのXPBSでろ過して、最終容量を最大8ミリリットルにします。

次に、すぐに3ミリリットルのシリンジを使用して、喀痰内に目に見える塊が残らなくなるまでサンプルを均質化します。同じシリンジを使用して、すぐに2ミリリットルの喀痰を引き出し、シリカビーズとGITC溶解バッファーを含むマイクロトランスクリプトームチューブに注入します。蓋を閉め、パラフィルムを使用して蓋をしっかりと密閉します漏れを防ぐために、ボルテックスサーを使用して、中速で10分間痰をすぐに均質化します。同じ注射器アリコートを使用して、ウイルスメタゲノムと微生物メタゲノムとラベル付けされたチューブにそれぞれ2ミリリットルの喀痰を入れ、残りの喀痰を喀痰カップから余分な喀痰とラベル付けされたチューブに移します。

すべてのチューブを摂氏4度または氷上に保管し、必要に応じてラボに輸送してウイルスメタゲノムを生成します。緩衝液および溶液の調製に続いて。0.02 μメートルのろ過された生理食塩水マグネシウム緩衝液を総容量 6 ミリリットルまで加えて、サンプルを前処理します。

粘液の溶解を助けるために、各サンプルに6.5ミリリットルのDTTを6ミリリットル加えます。激しく渦巻き、摂氏37度で1時間混合し、インキュベートします。サンプルを激しく渦巻いた後、再び3056G、摂氏10度で15〜20分間回転します。

各上清を新しい15ミリリットルのチューブに集めます。次に、シリンジに取り付けられたポイント45マイクロメートルフィルターを使用して、上清を新しい15ミリリットルチューブにろ過します。100マイクロリットルのサンプルをマイクロフュージチューブに取り出し、クロロホルム処理を行います。

上清を抽出し、DN1処理を行います。等量のホルムアルデヒドを4%パラで加えて、サンプルを固定します。落射蛍光顕微鏡については、包括的なウイルス粒子濃縮アプローチのテキストプロトコールを参照してください。

それ以外の場合は、新たに調製した塩化セシウム溶液を使用して、塩化セシウム溶液1ミリリットルあたり1.7グラムを各チューブに1ミリリットル、続いて1ミリリットルあたり1.5グラム、1ミリリットルあたり35グラム、最後に塩化セシウム溶液1ミリリットルあたり1.2グラムの1ミリリットルを充填することにより、塩化セシウムグラジエントを設定します。最後に、6〜8ミリリットルのサンプルを個々のグラジエントチューブにロードします。個々のレイヤーをマークして、各分数の位置を示します。

次に、2の反対側の各ペアのバランスを1ミリグラム以内にします。各チューブをスピンバケットに慎重にロックします。ローターに負荷をかけ、82、844G、摂氏4度で2時間遠心分離します。

遠心分離後、3ミリリットルのシリンジに取り付けられた18ゲージの針で、密度勾配を乱さずにチューブをホルダーから慎重に取り外します。針の開放端が上を向いていることを確認してください。1.5グラム/ミリリットルの密度層のすぐ下にチューブを突き刺し、約1.5ミリリットルの溶液をゆっくりとシリンジに引き込みます。.

針をゆっくりと取り外し、チューブに残っている画分が穿刺を通じて新しい15ミリリットルのチューブに滴下するのを待ちます。これを上部フラクションウエストとラベル付けします V psを含むシリンジ内の溶液を2つの新しいマイクロフュージチューブに移します。緩衝液および解決が準備されたら、テキストの議定書に従って、ポイント22マイクロメートルのろ過された1つのXPBSの5つの容量を加える 化学フードの下で各ホモジネートを薄めるためには、ベータMARのcaptaのエタノールを容量の最終濃度に2%容量に加え、そしてインキュベーションの後で2時間室温で混合物を振とうする。

サンプルを3056GSおよび摂氏10度で15分間回転させます。上清を捨てた後、10ミリリットルの分子グレードの水を使用してペレットを再懸濁し、室温で15分間インキュベートしてから洗浄を繰り返します。最後のスピン後、SUP natinを廃棄したら、1つのXDNAバッファーを5ミリリットル使用してペレットを再懸濁してから、15マイクロリットルのdsを追加します。

サンプル1ミリリットルにつき1個を摂氏37度でインキュベートし、2時間繰り返し混合します。サンプルを回転させてスナットを廃棄した後、10ミリリットルのSEバッファーを使用してペレットを再懸濁します。次に、サンプルを回転させ、洗浄を繰り返します。

2ミリリットルのSEバッファーを使用してペレットを再懸濁し、懸濁液を2本のマイクロフュージチューブに移します。次に、チューブを室温で16, 000GSで15分間回転させます。最後に、上清を取り除いた後、グラム陽性菌の指示に従ってゲノムDNA抽出キットを使用します。

DNAを単離するために、ウイルスメタゲノムを生成するための以前の結果をここにまとめます。ウイルスは、密度勾配超遠心分離ステップから70%のヒトDNAサンプルCCF 4Aを省略した1つのサンプルのみで、ヒト由来の配列をほとんど含まず、その結果、97%を超えるヒト由来の配列を含んでいました。この図は、密度勾配超遠心分離前後の一般的なCF喀痰サンプルの蛍光画像を示しています。

ここで見られる密度勾配分離に続いて、大きな粒子がない場合、透明なvlpが観察されました。経口抗生物質を投与し始めた1人の嚢胞性線維症患者から、毎日7つの喀痰サンプルが採取されました。収集の3日目後、各サンプルから収集された低張溶解法またはHL DNAの総収量は、各サンプルに対して生成されたIlluminaシーケンシングライブラリから210ナノグラムから5マイクログラムを超える範囲でした。

1つのライブラリを除くすべてのライブラリで100万以上のシーケンスが生成され、データの前処理時に85%以上の高品質のシーケンスが保持されました。print seqソフトウェアを使用すると、ヒト由来の配列の総量は14%から46%の範囲でしたここに示すように、サブサンプルの微生物プロファイルは、2回の低張溶解処理後のサンプルと非常に類似しています。さらに、2回目の低張溶解は、メタゲノム内の非ヒト配列の割合を6〜17%増加させます。

臨床サンプルや潜在的な病原体を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。サンプルの取り扱い中は、常に個人用保護具を使用する必要があります。この手順を実行する際には、汚染を防ぐために、優れた分子生物学および微生物学の技術が必要です。

この手順に従うと、ウイルスや微生物のメタゲノム研究だけでなく、CF喀痰などの複雑なサンプルからのメタトランスクリプトーム研究も行えるようになるはずです。