Name: 複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 学ぶメタゲノムとメタトランスクリプトーム解析の手法。嚢胞性線維症の喀痰サンプルからウイルスと細菌のコミュニティをDNA・RNAレベルで研究する包括的なワークフローを確立し、複雑な宿主関連サンプルの処理方法を示します。

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この作品は、フォレスト·ロワーに授与国立衛生研究所（1 R01 GM095384-01）によってサポートされていました。私たちは、リボゼロ疫学キットへの早期アクセスを提供するためのエピセンター、イルミナ社に感謝します。我々は、超遠心分離管ホルダーの設計と生産のためのマークハタイに感謝。私たちは、撮影·プロセスを支援するための重要な測定値と原稿の議論のためにアンドレアス·ハースとベンジャミンノウルズに感謝し、そしてローレンポール。

著者らは開示するものは何もない。

ウイルスメタゲノムウイルス粒子は、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿または少量濃縮器を用いて濃縮される。いくつかのケースでは、濃度は必要とされないかもしれないが、予備濾過または低速遠心分離工程は、真核細胞および微生物細胞を除去するために使用される。ウイルス溶解物をさらに濃縮され、密度勾配超遠心分離9,41または小型フィルタ（ 例えば 、0.45μm）は、真核細胞および大菌体25を除去した。使用して精製され密度勾配超遠心分離は、典型的には、スクロースまたはウイルス粒子41を分離し、濃縮する塩化セシウムのような密集が、不活性の溶液を用いて行われる。物理的な分離は、サイズおよびウイルス粒子の浮遊密度に基づいている。したがって、フィルタの孔サイズの適切な選択及び勾配の厳密な製剤は、物理的な回復の成功と、特定のウイルスのコミュニティを単離することが不可欠であるVLPは、41（抽出密度内のフィルタや秋を通過しないすなわち 、ウイルス粒子メタゲノム中に検出されません）を分離し、コミュニティを決定します。ウイルスの単離および濃縮後、両方の自由な核酸、および微生物および真核細胞の形態で試料中に存在する非ウイルスゲノム物質が混入してもよい。したがって、試料中のウイルス粒子（ 図1Aおよび図1B）の純度を確認することが重要である。クロロホルム処理は、一般的に前に核酸抽出に自由に核酸を分解するためにヌクレアーゼ処理に続いて、残りの細胞を溶解するために使用される。 提示されたワークフローの警告は、CsCl勾配を入力するには余りにも浮力かもしれエンベロープウイルス粒子を除外することができるようにウイルス粒子を単離するための密度勾配分離を使用することであった。代わりの「キャッチオール」の方法は、密度勾配SEPARを省略することである0.45μmのからコミュニティDNAをATIONと隔離 - このアプローチはまた、綿棒または血漿からのものとして少量の試料を収容するのに適切であるクロロホルムおよびDNアーゼIで処理したろ液を。しかし、これはクロロホルム耐性細菌汚染およびDNase I耐性細胞外DNAのより高い量をもたらし得る。 高いDNA収量がシーケンシングオプションのより広い選択肢を提供することにより、現在のシークエンシングプロトコルは1 ngのシーケンシングライブラリの準備のための核酸のμgの1する必要があります。生成viromesのDNA濃度は、多くの場合、より多くは200ng /μlに検出限界以下の範囲である。回収されたウイルス核酸の量は、直接配列決定ライブラリーを調製するため不十分である。このような場合には、核酸増幅が不可欠である。リンカ増幅ショットガンライブラリ（LASLs）複数置換増幅（MDA）に基づき、2,42,43及び全ゲノム増幅は2である方法は、最も一般的に配列決定のための十分なDNAを生成するために使用される。このようなファージPhi29 DNAポリメラーゼに基づくもののようなMDA法は、増幅偏り苦しむことが知られており、優先的に非定量的分類学および機能的特徴44,45、結果として一本鎖DNAと環状DNAを増幅することができる。 LASLsアプローチの最適化バージョンは、最小限のバイアスを導入することが示された（出発物質の少量のための）より高い感受性を促進し、容易に異なる配列決定プラットフォーム43のために適合されている。しかし、このアプローチは、多くのステップを有するDNAの損失を最小限にするために特殊な装置を必要とし、二本鎖DNAテンプレートに制限されている。私たちの研究室では、このアプローチは成功し、気管支lavage-、coral-と海水由来のVLP（未発表とフルビッツら 46）から抽出したDNAの検出可能と検出できない量を増幅するようになってきた。 データ解析パイプラインの開発は、CLAを持ってssicallyウイルスのコミュニティの非常に多様かつ大部分は未知の性質に起因ウイルスのメタゲノム解析の最も困難な側面の一つとなって。日付現在のウイルスデータベースへの生物圏における推定10 8ウイルスの遺伝子型が、ありますが、このおおよその合計ウイルスの多様性の約1 / 100,000です〜4000ウイルスのゲノムを、含まれています。そのため、ウイルスのメタゲノムで分類学と機能の割り当てのために（例えばBLAST 47など）の類似性ベースの検索は、固有の課題を有している。多くの配列がデータベース中のゲノムへの著しい類似性を有することができないので、未知のものとして分類される。相同性ベースの検索は、データをシーケンスする分類関数を割り当てるための最も重要なアプリケーションであっても、データベースに依存しない分析に基づく代替的なアプローチは、48 50を開発されてきた。 Fancello ら 51はビラで使用された計算ツールとアルゴリズムの完全なレビューを提供Lのメタゲノミクス。 微生物メタゲノム一般的に、低張溶解処理した微生物群集（HL-DNA）から抽出したDNAの総量は、20 ngのから5μgの範囲。収率は、患者の健康状態およびこの研究（ 表2）で抽出したHL-DNAの全収率で見られる変動を説明収集痰試料の量に大きく依存している。配列データは、シーケンシングライブラリーの品質に依存して、良好な品質を生成するための重要なステップは、生成された。 図2の酵素ベースのDNA断片化手順を使用して、CF痰由来の微生物のDNAから生成されたシークエンシングライブラリーの典型的なサイズ範囲を示す。最適なライブラリーサイズは、配列決定プラットフォームおよびアプリケーションの選択に依存し、必要に応じて、したがって、断片化の手順は、超音波処理し、噴霧などの代替的なアプローチを介して、最適化することができる。に加えて提示代表的な結果は、複数の時点にわたる複数の患者から採取したCF痰に提示される方法の成功はまた、（2012）9。Limらの文献に示されており、リムら。（2014）10。 これまでの研究9,10は、すべての患者は変動が原因で、抗生物質処理のような摂動する可能性がありながら、それによってコミュニティ内の主要なプレーヤーの持続性を反映して、時間をかけてシフトする微生物群集のユニークなセットを保有することを示唆している。これらの変動はあっても、外部摂動またはサンプリング手順とサンプル処理に起因することなく、日々発生するかどうか、疑問のままです。 HL-DNAのメタゲノムおよび16S rDNAのアンプリコンの分析に基づいて、7日間の長手方向のサンプリングは、抗生物質摂動なしこと微生物プロファイルの日内変動を示している（1日目、2、および3）（ 図3Aおよび3B）最小であった。イントロの際経口抗生物質の生産抗生物質シプロフロキサシンは、Pとして既知の細菌性病原体の広いスペクトルをターゲットにしている間すぐに3日目サンプリング後、コミュニティプロファイルの変化は4日目に明らかになった緑膿菌 、 黄色ブドウ球菌 、及び連鎖球菌性肺炎 、治療はPの相対的存在量を増加させ緑膿菌は、ストレプトコッカス種を減少させながら。とP. melaninogenicaの 。 6日目までに、コミュニティはゆっくりと最初の出発コミュニティ構造に回復した。結果は、単一の患者内の微生物のプロファイルの変動による気道におけるコミュニティ摂動に可能性が高いことを示唆している。 HL-由来のDNAからの16S rDNAのライブラリとメタゲノムの微生物のプロファイル間の一貫性を考えると、我々は本研究で用いた16S rRNAのプライマーから生じるバイアスを否定した。 16S rDNAの分類学上の全体に見られる差異の一つの可能​​な説明総DNAおよびHL由来DNA（ 図3B）から生成されたアルプロファイルは、 シュードモナス属の高い量の存在下であってもよい。抗生物質治療後に外DNA。これは、3日間のシュードモナス属を対象とし、抗生物質処理、後に、これらの差は7日目で最も明らかであったという知見によってサポートされています。他人に加えて。シプロフロキサシンは、一般的にCFおよび慢性P.を有する患者における第一選択薬として使用され緑膿菌感染活動のそのスペクトルは、ほとんどのCF-関連した病原体が含まれていても。私たちは、抗生物質治療がストレプトコッカス種などの影響を受けやすい地域社会を根絶するという仮説を立てた。従って、耐性のPで満たされたニッチを作成する緑膿菌 。 緑膿菌はバイオフィルムのコミュニティを増加を通して抵抗を得てもよいし、細胞外DNAは、バイオフィルムのアーキテクチャ52の主要な構造的支持であることが示されている。でもTとして彼はコミュニティ構造は、細胞外DNAは、CF痰に残っている可能性があり、回復した。したがって、これらのデータは、低張溶解し、潜在的にのみヒト由来のDNAを除去しないで利益をこのワークフローに提示洗浄工程だけでなく、微生物由来の細胞外DNAが実際の微生物のプロファイルを偽ることができることを示唆している。 Metatranscriptomics 高品質metatranscriptomeは、比較的少数のリボソームRNA（rRNAの）配列を含有し、地域社会の転写産物（mRNA）の公平なサンプリングを表している必要があります。によるmRNAの半減期が短いと、限られた量に、そのプロトコルは、ここに提示され、回収された転写物の数を最大にするために、サンプルの取り扱いを最小限に抑えることが重要である。 近年では、rRNAを枯渇のためのいくつかのアプローチが開発され、市販のキットに適合される。これらには、がMicroB エンリッチ 、リボゼロ、およびサンプル固有のサブトHが含まれるybridizations 53オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および5 &#39;一リン酸を含むRNAを標的とするエキソヌクレアーゼ酵素活性に基づいていたmRNA-ONLYキットに基づいている。また、このような優先的に線形RNAをpolyadenylatesと増幅のMessageAmp II-細菌キットとしてのmRNAの濃縮度のためのいくつかのアプローチも利用できます。これらの方法（ 例えば、mRNA-ONLY、がMicroB のE XPRESSとのMessageAmp）の中には、最適な効率のために同時に使用されている。しかしながら、これらのアプローチのすべての有効性は、部分的に分解のrRNAの作業としてしばしばCF試料から抽出した全RNAで観察された場合は特に、制限される。ポリアデニル化依存性RNA増幅は、真核生物および原核生物の両方のmRNAからなるmetatranscriptomesを生成するために使用することができない。加えて、ポリ（A）テールは、有用な配列データの量が減少するかもしれない配列に付加。ホモポリマーストレッチを有する領域は、より低い品質スコアを有することがcとなる傾向があるかなりの数のausingするシングおよびポストシーケンスソフトウェアによってフィルタリングされる読み出し、ポリ（A）尾部を切断、トリミング後の平均有用読み取り長を大幅に54減少する。 複雑なCFの微生物のコミュニティや、部分的に分解したRNA（ 図4Aおよび4C）への対応、これまでの研究では、リボゼロゴールドキットによるハイブリダイゼーション捕獲法を使用して組み合わせる治療法と比較して、ヒトと微生物rRNAの両方を除去するのに効果的であったことを示した他のキ ​​ット9（ 表3）。結果として得られるデータは、ヒト宿主と微生物の転写産物の両方の同時分析を可能にする。収量と品質のRNA、ならびに配列決定プラットフォームの究極の選択に応じて、cDNA合成工程を含む、これらのプロセスの多くは、シーケンシングライブラリーの生成を合理化することができる。例えば、リボゼロ処理したRNAはmetatranscriptomeシング天秤座を作製するために使用することができるScriptSeq RNA-のSeqライブラリ調製キットを使用してリース。 動物関連コミュニティのメタゲノム解析は、ホストとその関連コミュニティを含んで全体の機能エンティティの総合的な表現を提供。ここに提示されたワークフローは、特に、所望のウイルスおよび微生物に加えて多量の粘液、細胞残屑、細胞外DNA、タンパク質および糖タンパク質複合体の高い量、ならびに宿主細胞を含有するもの、複雑な動物に関連する様々な試料に適応可能である粒子。ウイルスおよび微生物粒子はすべての段階で失われる可能性があるにもかかわらず、単離および精製は、宿主DNAの量を最小にすることが不可欠である粒子。メタゲノミクスデータを調べコミュニティの代謝電位を提供するが、符号化された機能9の発現差異を明らかにすることによって、これを補完するmetatranscriptomics。ゲノミクスおよび転写産物データの総合的な評価は、新しいインをもたらしたコミュニティの相互作用のダイナミクスにightsと改善治療法9,10,55の開発を容易にします。

<html>人体に関連付けられたウイルスおよび微生物群集の配列決定技術1,2の適用により、過去10年間で広く研究されている。成果は、ヒトの健康および疾患における重要性微生物の認識につながっている。主要なイニシアチブは、ヒトの皮膚に存在する細菌（および一部の古細菌）について説明し、人間microbiomeプロジェクトから来て、口腔内、気道、尿生殖路、および消化管3。気管支肺胞洗浄（BAL）4,5及び鼻咽頭スワブ4を通して、健康なヒトの気道のさらなるmicrobiome研究は、肺環境サンプリング装置、気道における一過性微生物のコロニー形成の結果としての役割を果たすことができることを示している。しかし、障害者気道表面における微生物の植民地化の影響は、嚢胞性線維症（CF）患者で見られるもののような重篤な慢性肺感染症につながることができます。 tは&quot;&gt; CFは、嚢胞性線維症膜貫通レギュレーター（CFTR）の突然変異遺伝子6によって引き起こされる致死性遺伝病である。これらの変異は、今度は、上皮の頂端面を横切って経上皮イオン輸送に影響を与える欠陥CFTRタンパク質を生じる。疾患に影響複数の器官系が、死亡率と罹患率の大半は、CF肺疾患7に起因するものである。CF肺は微生物のコロニー化のためのユニークな生態系を提供します。イオン輸送に欠陥が好気性からなる微小環境を作成し、CF気道に蓄積する粘液を引き起こし静的な栄養豊富な粘膜表面によって固定、微好気性、嫌気コンパートメント。この環境は、ウイルス、細菌、および真菌を含む微生物のコロニー形成および増殖を促進します。急性および慢性の肺の微生物感染症は、その結果、一定だが効果のない免疫応答を引き起こす大規模な気道リモデリング、肺容量の喪失、そして最終的にパルモNARY失敗。 CF肺に関連した細菌群集はよく16SリボソームRNA（rRNAの）遺伝子配列決定8と散弾銃のメタゲノミクス9,10を使用することを含む、両方の文化に依存すると文化に依存しないアプローチを使用して、記載されている。 16S rRNAのベースのアプローチは、微生物種の広い範囲を特徴付ける、コミュニティの多様性において幅広いシフトを捕捉することができる。しかし、それは（2010年11。クラーソンらにまとめた）コミュニティを定義する際に、その解像度に制限され、代謝ポテンシャルの予測は特定され分類群のために知られているものの一般的な機能に限定されている。従って、16S rRNAの遺伝子配列決定法は、CF肺に存在する多様な微生物群集の必要な分類学的および機能的な分析精度は不十分である。ここで説明するメタゲノムアプローチは、その限界を克服する、16S rRNAのベースのアプローチを補完するものであり、比較的効果的な方法を可能にするCF肺に微生物群集の分類学と遺伝的内容の両方を分析する。 動物関連試料から単離された微生物DNAは、しばしば、宿主DNAを大量に含んでいる。 14 - CF痰または肺組織試料は、通常、免疫応答において好中球によって放出されたヒトDNAの大量の総DNA 12のしばしば99％以上を含む。いくつかの無傷のヒト細胞が存在することができるが、このDNAの大部分が溶液中で遊離または微生物の表面に吸着される。また、非常に粘性の粘液栓、細胞破片、および他の未知の汚染物の存在は、さらに、微生物細胞の単離を複雑にする。いくつかの方法が選択的にヒトDNA 16、及びMolYsisキット、限られた成功すべてを分解するために、微生物細胞15からDNアーゼI、臭化エチジウムアジドでの処理を、ヒトを分離するパーコール勾配を含む、ヒトDNAのこれらの試料を枯渇するために試験した。<html> CF痰のために最も効果的な微生物のDNA精製を、今日までは、Breitenstein らによって記載された方法の改変。（1995）17となっている。ここに低張溶解（HL）メソッドと呼ばれるこのアプローチは、ムチンのジスルフィド結合、真核細胞の低張溶解、及び可溶性DNA 9のDNアーゼI処理を減らすためにβメルカプトエタノールの組み合わせを使用します。選択肢の欠如にもかかわらず、HL方法が原因群集組成9,10の観察された変動するかどうか、不要な微生物の溶解および（II）の結果は、（i）可能なバイアスのためにいくつかの懸念を表明したサンプル処理に関連したバリエーションの成果物です。散弾銃のメタゲノムの生成に加えて、我々は、総DNAと連続7日間にわたって単一の患者から採取した痰試料の同じセットを使用して、HL法から抽出された微生物のDNAの16S rRNA遺伝子プロファイルを比較することにより、これらの問題に対処する。 ENT &quot;&gt;微生物群集と比較すると、動物に関連したウイルスのコミュニティの特徴付けは18,19限られているCF気道におけるウイルスのコミュニティが最小限しか20特徴づけられている- 。。22に CF気道におけるウイルスのコミュニティのDNAを特徴づける第一メタゲノム研究CF肺に関連したほとんどのウイルスはファージは20であることを示した。CFと非CFの個人におけるファージの代謝可能性が大幅に異なっていた。具体的には、CFの個人におけるファージコミュニティがCF気道の生理機能に細菌宿主適応の反射遺伝子を実施し、およびCF肺組織におけるウイルスの細菌毒性20。その後のメタゲノム研究は、解剖学的領域22の間のウイルスのコミュニティの別個の空間的不均一性を示した。また、CF肺組織は、任意のエコシステム22に現在まで観察最低ウイルスの多様性を保有。同定ほとんどのウイルスは、ファージたCFの病原体に感染する可能性を秘めた。しかし、このようなヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびヒトパピローマウイルス（HPV）などの真核生物ウイルスも検出された。肺組織における嚢胞切開中に観察された一つのイベントでは、ヒトパピローマウイルスゲノムの99％以上が、患者が肺の乳頭又は癌と診断されなかったにもかかわらず、回収された。これは、本ウイルスの多様性は、組織損傷の重症度を反映するだけでなく、露出させ、下にある未同定の疾患を説明することができるだけでなく、ことを示している。ここで説明するプロトコルは、多量の粘液、宿主および微生物細胞遊離DNA、ならびに細胞破片の大量から成る試料からのウイルス様粒子（VLP）を単離するためのシンプルかつ強力な方法を提供する。 メタゲノミクス補完、metatranscriptomicsは微生物群集とホスト9,23間での遺伝子発現のダイナミクスを監視するために使用される。この場合、両方の微生物及びHOSトンmRNAを優先的に選択する必要がある。細菌のmRNAがポリアデニル化されていないため、オリゴdTベースのmRNAプルダウン方法が悪用されることはありません。サンプルは真核生物のmRNAを大量に含有することが知られている場合にはポリアデニル化依存性RNA増幅は、ホストに関連したサンプルでは使用できません。 CF痰を含む多くの動物に関連したサンプルは、RNアーゼを含む細胞破片とヌクレアーゼの高い量に加えて高密度の細胞を含む。したがって、別の困難な課題はmetatranscriptome処理中に広範なRNAの分解を防止するためである。ほとんどの場合、CF喀痰から抽出した全RNAは、派生RNAの下流の適用および有用性を制限する、部分的に分解される。近年では、rRNAを枯渇のためのいくつかのアプローチが開発され、市販のキットに適合される。これらのアプローチの有効性は、しかし、特に部分的に分解されたrRNAを9,24を操作するときに、制限されている。ここで用いられている方法を許可効率的な下流の合計のrRNA除去に適し部分的に分解全RNAの検索のためにED。二つの異なるキットを比較し、部分的に分解された全RNAからのrRNAの除去効率の直接比較は、リムらによって示された。（2012）9。 全体として、この論文の目的は、一例として、誘発痰サンプルを用いて、単一の動物に関連したサンプルから、ウイルス及び微生物ガンメタゲノムを生成するためのプロトコルの完全なセット（ 図1）、及びmetatranscriptomeを提供することにある。分子検査室ワークフローは交差汚染を最小限にするために別個の前後の増幅領域を含むべきである。方法は、そのような組織22、鼻咽頭および口腔咽頭ぬぐい液25、気管支肺胞洗浄（BAL）とサンゴ（未発表データ）のような他のサンプルタイプに簡単に適応可能である。各サンプルを収集するとすぐに処理された場合は特に微生物のメタゲノムと満たされるべきであるatranscriptomics研究が望まれている。試料が凍結した場合、それは潜在的に細胞の完全性を破壊するように凍結微生物メタゲノム無傷の微生物細胞の単離を制限する。しかし、凍結はmetatranscriptomics及びウイルス分離が、凍結融解プロセスによって影響を受ける可能性が回復したウイルス粒子のRNAの品質および量を排除するものではない。それは、その誘発喀痰はBALがあまりにも侵襲され得るように、成人CF患者および他の慢性肺疾患26,27に関連した多くの研究におけるサンプルの主要な供給源を務めているに注意することが重要である。我々の研究では、痰試料を最小限に唾液サンプル内の口腔微生物汚染を保つために、滅菌生理食塩水を用いて口腔のうがい薬及びすすぎ以下、 すなわち 、慎重かつ一貫したサンプリング方法で収集した。

<table><tbody><tr><td>グアニジン イソチオシアネート ベース RNA 溶解バッファー</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>10296-028</td><td>TRIzol LS 試薬は、この研究で使用されました</td></tr><tr><td>シリカビーズ; 0.1 から 0.15 mm</td><td>コール パーマー</td><td>YO-36270-62</td><td>ジルコニア - ケイ酸ビーズは、この研究で使用されました</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール、分子グレード (乾燥粉末)</td><td>プロメガ</td><td>V3155</td> 他の<td>会社</td></tr><tr><td>から購入することができます滅菌シリンジフィルター;0.45 以上m細孔径親水性PVDF膜</td><td>ミリポア</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I酵素&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター; 0.02 &micro;m 細孔径</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-926-13</td><td>直径:25 mm</td></tr><tr><td>超透明遠心チューブ</td><td>ベックマン</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &frac12; in.(14 x 90 mm)、SW41 TiローターおよびVLPsに適した密度勾配超遠心分離</td></tr><tr><td>SW41 Tiローター</td><td>ベックマン</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 固定角ローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNAポリメラーゼ</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro;l</td></tr><tr><td>Phi29 ランダム ヘキサマー</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>S0181</td><td>以前にフィデリティ システムズから購入</td></tr><tr><td>環状ポリプロピレン サポート リング付きアルミナ マトリックス フィルター; 0.02 & マイクロ;この</td><td></td><td></td><td>研究では、Whatman Anodiscフィルターメンブレンを使用しました;直径25 mm</td></tr><tr><td>SYBR金核酸ゲル染色</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>他の会社から購入することができます</td></tr><tr><td>グリコーゲン、RNAグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FERR0551</td><td>他の会社から購入可能</td></tr><tr><td>オークリッジ高速遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-562-16B</td><td>SS-34固定角ローターに適した大容量DNA抽出手順用</td></tr><tr><td>総rRNA除去キット</td><td>エピセンター</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) は、rRNA の除去とシーケンシング ライブラリ調製</td></tr><tr><td>塩化セシウム&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサデシトリメチル-臭化アンモニウム(CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとmetatranscriptomes：不純を精製する

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

ハイスループットシークエンシングのアクセス可能性は、生物学の多くの分野に革命をもたらしました。良いホスト随伴ウイルスおよび微生物群集を理解するために、DNAおよびRNA抽出のための総合的なワークフローが開発された。ワークフローは同時に次世代配列決定のための単一のサンプルからのウイルスおよび微生物メタゲノム、ならびにmetatranscriptomesを生成する。これらのアプローチのカップリングは、分類学的特性や地域社会符号化された機能の両方の概要を説明します。それは非常に粘性があるとムチンの高い量、無料の好中球のDNA、および他の未知の汚染物質が含まれているため、提示された方法は、嚢胞性線維症（CF）痰、問題のサンプルタイプを使用しています。ここに記載されているプロトコルは、これらの問題を対象とし、正常に最小限の人間のDNAの混入でウイルスおよび微生物のDNAを回収。メタゲノミクス研究を補完するために、metatranscriptomicsプロトコルは、両方の微生物を回収するために最適化された比較的少数のリボソームRNA（rRNAの）配列を含み、宿主のmRNA。データ特性の概要は、メソッドの成功を評価するための基準として機能するために提示されている。追加のCF痰サンプルはまた（i）の単一の患者内で連続7日間を横切るmicrobiomeプロファイルの一貫性を評価し、及び（ii）の16SリボソームRNA遺伝子に基づいた配列決定メタゲノムアプローチの一貫性を比較するに収集した。結果は、抗生物質の摂動のない微生物のプロファイルの日内変動が最小であったと共通のCF-関連した細菌の分類学プロフィールは低張溶解（HL）由来DNAから生成された16S rDNAのライブラリとメタゲノムの間で非常に類似していたことを示した。しかし、総DNAおよびHL-由来のDNAから生成された16S rDNA遺伝子分類学的プロファイル間の差異は、低張溶解し、洗浄工程でのみヒト由来のDNAを除去しないで利益を得ることを示唆しているだけでなく、微生物由来extracellul実際の微生物のプロフィールを偽って、AR DNA。

例として、嚢胞性線維症の気道を使用すると、原稿は、動物関連のサンプル中の微生物およびウイルスのコミュニティを特徴づけるためにメタゲノムとmetatranscriptomicアプローチの組み合わせを含む総合的なワークフローを提供します。

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

この手順の全体的な目標は、嚢胞性線維症の喀痰などの複雑な宿主関連サンプルを収集および処理し、メタゲノムおよびメタトランスクリプトームアプローチを使用してウイルスおよび微生物群集を研究することです。これは、最初に被験者にネブライザーを介して 7% の高張生理食塩水を吸入し、次に 30 分間にわたって誘導された喀痰サンプルを収集することによって達成されます。次に、サンプルを直ちに均質化し、ウイルスメタゲノム、微生物メタゲノム、メタトランスクリプトーム、および余分な喀痰とラベル付けされた4つのチューブに均等に分配します。次に、メタトランスクリプトームチューブを密封し、水平に配置し、喀痰を中速で10分間均質化します。最後に、個々のアリコートは、メタゲノム研究のための核酸単離の前にウイルスまたは細菌細胞を単離および精製するために別々に処理されます。最終的に、単離された核酸は、メタゲノミクスおよびメタトランスクリプトミクスライブラリを生成するためのハイスループットシーケンシングライブラリ調製に使用されます。この手順の主な利点は、DNAおよびRNAレベルでのウイルスおよび細菌群集の研究のための複雑な宿主関連サンプルを処理するための包括的なワークフローを提供することです。サンプルの適切な取り扱いを確保するためには、サンプルの前処理ステップが重要である一方で、ウイルスおよび微生物細胞の精製ステップは習得が難しいため、この手順の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です 手順の複雑さのため サンプル収集の前に、サンプルごとに4本の15ミリリットルチューブに次のようにラベルを付けます。 2つ目は微生物メタゲノム番号3、メタトランスクリプトームとチューブ番号4は追加の喀痰です。メタトランスクリプトームとラベルされたチューブに2ミリリットルの0.1ミリメートルシリカビーズを加え、続いて6ミリリットルのギネイソチオシアネートベースのRNA溶解バッファーまたはGITC溶解バッファーを加えます。テキストプロトコルに概説されているサンプル収集手順に従って、プレウェイドサンプルカップを使用して、サンプル収集後にカップを計量し、空のカップの重量を差し引くことにより、サンプル量を推定します。残りの重量については、1グラムは1ミリリットルのサンプルに相当します。サンプルの容量が8ミリリットル未満の場合は、0.02マイクロメートルの適切な容量を1つのXPBSでろ過して、最終容量を最大8ミリリットルにします。次に、すぐに3ミリリットルのシリンジを使用して、喀痰内に目に見える塊が残らなくなるまでサンプルを均質化します。同じシリンジを使用して、すぐに2ミリリットルの喀痰を引き出し、シリカビーズとGITC溶解バッファーを含むマイクロトランスクリプトームチューブに注入します。蓋を閉め、パラフィルムを使用して蓋をしっかりと密閉します漏れを防ぐために、ボルテックスサーを使用して、中速で10分間痰をすぐに均質化します。同じ注射器アリコートを使用して、ウイルスメタゲノムと微生物メタゲノムとラベル付けされたチューブにそれぞれ2ミリリットルの喀痰を入れ、残りの喀痰を喀痰カップから余分な喀痰とラベル付けされたチューブに移します。すべてのチューブを摂氏4度または氷上に保管し、必要に応じてラボに輸送してウイルスメタゲノムを生成します。緩衝液および溶液の調製に続いて。0.02 μメートルのろ過された生理食塩水マグネシウム緩衝液を総容量 6 ミリリットルまで加えて、サンプルを前処理します。粘液の溶解を助けるために、各サンプルに6.5ミリリットルのDTTを6ミリリットル加えます。激しく渦巻き、摂氏37度で1時間混合し、インキュベートします。サンプルを激しく渦巻いた後、再び3056G、摂氏10度で15〜20分間回転します。各上清を新しい15ミリリットルのチューブに集めます。次に、シリンジに取り付けられたポイント45マイクロメートルフィルターを使用して、上清を新しい15ミリリットルチューブにろ過します。100マイクロリットルのサンプルをマイクロフュージチューブに取り出し、クロロホルム処理を行います。上清を抽出し、DN1処理を行います。等量のホルムアルデヒドを4%パラで加えて、サンプルを固定します。落射蛍光顕微鏡については、包括的なウイルス粒子濃縮アプローチのテキストプロトコールを参照してください。それ以外の場合は、新たに調製した塩化セシウム溶液を使用して、塩化セシウム溶液1ミリリットルあたり1.7グラムを各チューブに1ミリリットル、続いて1ミリリットルあたり1.5グラム、1ミリリットルあたり35グラム、最後に塩化セシウム溶液1ミリリットルあたり1.2グラムの1ミリリットルを充填することにより、塩化セシウムグラジエントを設定します。最後に、6〜8ミリリットルのサンプルを個々のグラジエントチューブにロードします。個々のレイヤーをマークして、各分数の位置を示します。次に、2の反対側の各ペアのバランスを1ミリグラム以内にします。各チューブをスピンバケットに慎重にロックします。ローターに負荷をかけ、82、844G、摂氏4度で2時間遠心分離します。遠心分離後、3ミリリットルのシリンジに取り付けられた18ゲージの針で、密度勾配を乱さずにチューブをホルダーから慎重に取り外します。針の開放端が上を向いていることを確認してください。1.5グラム/ミリリットルの密度層のすぐ下にチューブを突き刺し、約1.5ミリリットルの溶液をゆっくりとシリンジに引き込みます。.針をゆっくりと取り外し、チューブに残っている画分が穿刺を通じて新しい15ミリリットルのチューブに滴下するのを待ちます。これを上部フラクションウエストとラベル付けします V psを含むシリンジ内の溶液を2つの新しいマイクロフュージチューブに移します。緩衝液および解決が準備されたら、テキストの議定書に従って、ポイント22マイクロメートルのろ過された1つのXPBSの5つの容量を加える 化学フードの下で各ホモジネートを薄めるためには、ベータMARのcaptaのエタノールを容量の最終濃度に2%容量に加え、そしてインキュベーションの後で2時間室温で混合物を振とうする。サンプルを3056GSおよび摂氏10度で15分間回転させます。上清を捨てた後、10ミリリットルの分子グレードの水を使用してペレットを再懸濁し、室温で15分間インキュベートしてから洗浄を繰り返します。最後のスピン後、SUP natinを廃棄したら、1つのXDNAバッファーを5ミリリットル使用してペレットを再懸濁してから、15マイクロリットルのdsを追加します。サンプル1ミリリットルにつき1個を摂氏37度でインキュベートし、2時間繰り返し混合します。サンプルを回転させてスナットを廃棄した後、10ミリリットルのSEバッファーを使用してペレットを再懸濁します。次に、サンプルを回転させ、洗浄を繰り返します。2ミリリットルのSEバッファーを使用してペレットを再懸濁し、懸濁液を2本のマイクロフュージチューブに移します。次に、チューブを室温で16, 000GSで15分間回転させます。最後に、上清を取り除いた後、グラム陽性菌の指示に従ってゲノムDNA抽出キットを使用します。DNAを単離するために、ウイルスメタゲノムを生成するための以前の結果をここにまとめます。ウイルスは、密度勾配超遠心分離ステップから70%のヒトDNAサンプルCCF 4Aを省略した1つのサンプルのみで、ヒト由来の配列をほとんど含まず、その結果、97%を超えるヒト由来の配列を含んでいました。この図は、密度勾配超遠心分離前後の一般的なCF喀痰サンプルの蛍光画像を示しています。ここで見られる密度勾配分離に続いて、大きな粒子がない場合、透明なvlpが観察されました。経口抗生物質を投与し始めた1人の嚢胞性線維症患者から、毎日7つの喀痰サンプルが採取されました。収集の3日目後、各サンプルから収集された低張溶解法またはHL DNAの総収量は、各サンプルに対して生成されたIlluminaシーケンシングライブラリから210ナノグラムから5マイクログラムを超える範囲でした。1つのライブラリを除くすべてのライブラリで100万以上のシーケンスが生成され、データの前処理時に85%以上の高品質のシーケンスが保持されました。print seqソフトウェアを使用すると、ヒト由来の配列の総量は14%から46%の範囲でしたここに示すように、サブサンプルの微生物プロファイルは、2回の低張溶解処理後のサンプルと非常に類似しています。さらに、2回目の低張溶解は、メタゲノム内の非ヒト配列の割合を6〜17%増加させます。臨床サンプルや潜在的な病原体を扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。サンプルの取り扱い中は、常に個人用保護具を使用する必要があります。この手順を実行する際には、汚染を防ぐために、優れた分子生物学および微生物学の技術が必要です。この手順に従うと、ウイルスや微生物のメタゲノム研究だけでなく、CF喀痰などの複雑なサンプルからのメタトランスクリプトーム研究も行えるようになるはずです。

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Research

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Biology

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