のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの瞳孔の目の発達のライブイメージングムービーを生成するための効率的な方法を実証することです。これは、最初に瞳孔ケースのOパーマを取り除き、側面に沿って引き裂いて片方の目の神経上皮を露出させることによって達成されます。2番目のステップは、イメージングリグを組み立て、ワセリンの小さなビーズに蛹を取り付けることです。

接着ベルトの領域にある神経上皮の次の連続切片は、標準的な蛍光顕微鏡を使用して取得されます。最後のステップは、標準の画像編集ソフトウェアでフッテージを安定させ、色を調整することです。最終的に、ショウジョウバエの神経上皮の生細胞イメージングを使用して、そのパターンの細胞の挙動を解明します。

この段階では蛹はかなり壊れやすいため、蛹を部分的に解剖してからイメージングリグに正しく取り付けるのは難しい場合があるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。さらに、蛹の正しい向きと、眼の上皮の上のカバースリップの正しい配置は、イメージングを成功させるために重要です。手順を実演するのは、当研究室のMark Hellermanです。

実験を開始するには、以前に交差させた遺伝子型から白色のプレピュイを選択し、それらを1.5ミリリットルの遠心チューブに入れます。次に、蒸留水に浸した10センチ四方のティッシュをきれいなプラスチック製のチップボックスに入れます。マイクロ遠心チューブをチップボックスに挿入します。

湿った組織は蛹の乾燥を防ぎ、摂氏25度で17〜25時間インキュベートします。インキュベーション後、新鮮な両面テープを黒い葉巻解剖皿に置きます。蛹の背側を上にしてテープに置き、蛹の頭が蛹の胸部と腹部に付着しないように両面テープに取り付けられていることを確認します。

鉗子を使用して、Aパーマを慎重に持ち上げて取り外し、瞳孔の頭を露出させます。次に、瞳孔ケースの側面に沿って引き裂きます。片方の目の周りを露出させるために、粘着テープから瞳孔をそっと取り除きます。

あぶらとり紙で15平方ミリメートルの小さなフレームを作成し、中央に5ミリメートルの穴を開けます。フレームと蒸留水を浸し、顕微鏡の中央に置きます。30ccのシリンジでスライドさせます。

あぶらとり紙のフレームを囲むようにワセリンの均一なリングを絞り出します。次に、ワセリンの小さなビーズをスライドに直接追加します。蛹を慎重に横向きに並べ、ワセリンビーズで支えます。

ワセリンリングの上にカバースリップを置き、目の上の上皮に接触するようにします。調製物を穏やかに圧縮して、カバースリップをワセリンに対してシールし、瞳孔の眼領域とカバースリップ画像、瞳孔調製物との間に小さな平らな接触面を生成する。蛍光顕微鏡を使用して、眼のAALドメイン、付着接合部の領域の神経上皮を通る連続切片を7分ごとにキャプチャします。

適切なデコンボリューションソフトウェアを使用して、各ZackファイルおよびL-A-S-A-Fソフトウェアの背景を縮小し、シリアルセクション画像のコントラストを強化します。ツールパネルに移動します。「3D デコンボリューション」を選択し、「適用」をクリックします。

各 de convoluted スタック ファイルの最大投影法または MP イメージを生成します。各MP画像を位置合わせして、個々の細胞の挙動を強調し、生物の成長によって引き起こされる気を散らすものを減らします。メインメニューの[ファイル]タブからPhotoshop CS 5の組み込みアルゴリズムを使用して、スクリプトを開き、[ファイルをスタックにロード]を選択します。

次に、MP画像ファイルをロードレイヤーパネルにインポートします。「ソース画像を自動的に整列させる」オプションが選択されていないことを確認します。そうしないと、画像データが歪む可能性があります。

すべての MP ファイルがレイヤー ウィンドウに読み込まれたら、すべての画像が時系列順になっていること、および最も古い時点がレイヤーの一番上にあることを確認します。正しく順序付けられるまで、スタック、ドラッグ、ドロップします。必要に応じて、レイヤーの自動整列を選択します。

「再配置」を選択し、「OK」をクリックします。焦点が合っていない場合、初期MP画像の領域は、焦点が均一に焦点が合った網膜野を生成するように修正されてもよい。画像処理を開始するには、LAS のクロップ機能を使用します。

Saf は、初期スライスと最終スライスを手動で制限して、初期フォーカスが合っていない領域内の接着ベルトのみにまたがるようにします。[適用] をクリックして、この領域に最適化された新しいスタック ファイルを生成します。次に、ローカルに最適化されたスタックの新しい最大投影を生成し、PhotoshopでTIFファイルとしてエクスポートします。

スクリプトを開き、[ファイルをスタックにロード]を選択します。次に、初期 MP ファイルと最適化された MP ファイルをロード レイヤー パネルに入力します。ここでも、[ソース画像を自動的に整列させる] オプションが選択されていないことを確認し、[OK] を選択します。

両方のレイヤーを選択し、自動ブレンドレイヤーを選択して、均一に焦点が合った網膜野を生成します。この合成画像を TIF ファイルとして保存します。変形ツールを使用して画像を回転させ、網膜の背側腹軸がムービーフレームのY軸に揃うようにします。

個々のフレームのレベル調整を使用して、細胞膜と細胞体の間のコントラストを高めます。次に、[レイヤーからフレームを作成]を選択して、画像をムービーに変換します。レイヤーは、スタックの一番下から順番にアニメーション ウィンドウに追加されることに注意してください。

スタックの順序を逆にするには、すべてのフレームを選択してから、[フレームの反転] を選択します。各フレームのフレーム遅延時間を 0.8 秒に選択し、[QuickTime] を選択します。目的のビデオ形式をエクスポートして選択します。

最後に、[レンダリング オプション] で、フレーム レートを [カスタム] に選択し、フレーム レートに 15 を入力します。次に、[レンダリング]をクリックします。この手法では、眼全体に顕著な発達勾配が観察され、眼のパターン化の詳細な説明が促されました。

一次ラッピング中に、2つの細胞が一次細胞として動員され、互いに結合する光受容体束を急速に取り囲んで安定した接合を形成しました。未分化のインターロ物質細胞は、原色が包まれて密封されるにつれて、無秩序なパターンで横たわっていました。各視細胞は、局所的な細胞運動を再編成しました。

イニアル細胞は、各オーマの背側と腹側にグループ化されています。細胞間インターカレーションは、細胞を2つの行から1つの行に再配置します。インターインターカレーションに続いて、三次競技を顕微鏡で撮影しました。

競合する細胞は、置換される前に5〜10分間三次ニッチを占めていました。最終的に、単一の細胞が安定した三次ニッチを確立しました。最終的な剪定中に、アポトーシスの急増により、ICSの数が、複眼を横切る入射材料セル格子を効率的に生成するために必要な最小限にまで減少しました。

一度習得すれば、PPEのイメージングは正しく実行すれば4時間で完了します。その後の画像処理には約1時間かかります。