2014年9月7日
MATLABベースのオープンソースソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerは、微小管動態を定量するために蛍光標識+先端の画像シリーズを分析するために使用することができる。
この手順の目的は、ソフトウェアパッケージとチップトラッカーを使用して、微小管とエンドトラッキングタンパク質、またはプラスチップダイナミクスと生きた成長コーンに関する定量的情報を取得することです。ここでは、EB one GFPダイナミクスと培養XUS lavis growth conesの画像解析の手順について説明しますが、タグ付きEB oneおよび培養胚成長コーンの高解像度ライブ画像を取得した後、他の細胞タイプにも同様のプロトコルを使用することができます。手順の最初のステップは、コマンド plus tip を使用して、EB one GFP 彗星を検出するためのトラックを取得し、彗星をトラックにリンクし、微小管ダイナミクスのパラメーターを決定することです。
2番目のステップは、コマンドとチップCトラックを使用して、成長コーン画像に重ね合わせた微小管トラックを視覚化することです。最後のステップは、プラスチップグループ解析を使用して、映画のグループの微小管トラックパラメータを解析および比較することです。ハンドトラッキングを使用して個々のプラスチップトラックを分析するなどの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、この方法で迅速かつ自動化された検出、追跡、視覚化、および分析が可能になることです。
画像解析の最初のステップは、EB one GFP彗星を検出し、彗星を飛跡に結びつけ、微小管ダイナミクスのパラメータを決定することです。これは、コマンドとヒントで取得します。画像解析の前にトラックを取得します。
各タイムラプスムービーを一連のTIFF画像ファイルに変換し、各シリーズをimagesという独自のフォルダーに保存します。images では大文字と小文字が区別されることに注意してください。解析を開始するには、MATLAB アプリケーションを開き、コマンド ウィンドウに「plus tip get tracks」と入力します。
これにより、新しいダイアログボックスが表示されます。をクリックして新しいプロジェクトを設定し、適切な画像フォルダを選択して、以前のTIFF画像シリーズを1つ以上選択します。この手順を完了すると、ファイルディレクトリが作成されます。
クリックしてください、わかりました。最初の画像が表示されたら、マウスを使用してクリックしてポリゴンを作成します。次に、成長円錐の全体を包含します。
マウスをダブルクリックしてポリゴンを閉じます。画像に別の成長円錐がある場合は、ダイアログボックスが表示されます。分析するには、 [はい] を選択します。
それ以外の場合は、[いいえ] を選択します。次のステップは、すぐに分析されるプロジェクトを選択することです。「プロジェクトを選択」をクリックし、フォルダを選択します。
リストを分析するには、ねばねばした画面が表示されます。画面の左側からプロジェクトを選択し、右側に移動します。クリックしてください、わかりました。
プロジェクトリストを保存する場所を選択し、「保存」をクリックして、検出、追跡、および後処理を選択します。これらの選択が行われると、ダイアログボックスの右側が設定可能になります。後処理の設定を入力します。
希望する特定の画像取得設定に応じて、[開始]をクリックします。その後、ソフトウェアは入力されたステップを実行します。コマンド ウィンドウには、各関数の推定残り時間が表示され、ステップの実行がいつ完了したかが示されます。
マイクロチューブトラックが定義されたので、機能plus tip Cトラックを使用して、トラックの視覚化と、成長コーン画像に重ね合わせたマイクロチューブトラックの表示を行います。これは、コマンド ウィンドウに [コマンド プラス チップ C トラック] タイプと [チップ C トラック] で取得されます。ダイアログボックスが読み込まれたら、[プロジェクトの選択]をクリックします。
視覚化するプロジェクトを含む親ディレクトリを選択し、select folderをクリックします。ウィンドウが表示されたら、視覚化するファイルを選択してクリックします。次に、[保存したROIを選択]をクリックし、前の手順で選択したものと同じ関心領域フォルダに移動して、R-O-I-Y-Xという名前のファイルを選択します。
[出力ディレクトリの選択] をクリックして、MATLAB がトラック可視化ファイルを保存する場所を指定し、[トラック ムービーの作成] を選択します。すべてのトラックを表示する画面が表示されます。プラスチップは、プラスチップのコメントから計算されたトラックを取得します。
このステップでは、トラックの時系列がムービー形式で保存されます。最後の機能は、マイクロチューブトラックパラメータの解析と比較のためのムービーのグループを作成するために使用されます。これは、コマンドとチップグループ解析で取得されます。
プラスチップゲットトラックが複数の映画に対して実行され、異なるデータサブセットが比較の準備ができています。コマンドウィンドウにプラスチップグループ分析を入力します:比較するグループを手動で選択するには、最初に階層から自動グループの選択を解除します。次に、プロジェクトの選択をクリックします。
すべての ROI フォルダを含む親ディレクトリに移動します。リストを分析するには、GUIウィンドウが表示されます。画面左側からグループに含めるすべてのプロジェクトを選択し、右側に移動します。
クリックしてください、わかりました。次に、プロジェクトリストを保存する場所を選択し、[保存]をクリックするとウィンドウが表示されます。クリックします。
さて、リスト選択のねばねばしたウィンドウが表示されます。再度、まとめる必要がある最初のグループに対応するファイルのみを選択し、クリックします。大丈夫です。グループ名を入力し、[OK]をクリックします。
ウィンドウが表示されたら、それに応じて回答し、グループの選択を続けます。次に、グループリストを保存する場所を選択し、[保存]をクリックします。[出力ディレクトリの選択]をクリックして、出力フォルダを保存する場所を選択します。
最後に、実行するグループ分析のタイプを選択します。ここでは、すべてのセルとグループからプールデータを選択します。[グループの比較] をクリックします。
この画像は、関数と先端の git トラックから取得した Micro tubial dynamics のパラメーターを示しています。この動画では、関数から得られる微小管トラックと先端Cトラックを示しています。最後に、この画像は、関数とチップグループの分析から得られた微小管パラメータを示しています。
スプレッドシート アプリケーションを使用する。これらのパラメータは、異なる映画グループから取得され、A処理プログラムを使用して箱ひげ図として調べることもできます。このビデオを見た後、プラスチップトラッカーを使用して、機能プラスチップgitトラックプラスチップCトラック、およびプラスチップグループ分析を利用して、微小管プラスチップダイナミクスと生体成長コーンに関する定量的情報を取得する方法をよく理解しているはずです。
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本記事では、蛍光標識された+TIPsを用いて微小管ダイナミクスを解析するためのMATLABベースのソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerの使用方法について解説します。本手順では、生きた成長円錐における微小管プラス端追跡タンパク質の挙動を定量化するための系統的なアプローチを提供します。
神経成長円錐における微小管ダイナミクスを定量化することで、軸索誘導やシナプス形成といった、神経発達障害モデルに関連するプロセスのメカニズムに関する洞察が得られます。+TIPコメットの軌跡を自動解析することにより、細胞骨格調節に影響を与える化合物のハイスループットスクリーニングが可能となり、神経科学の創薬パイプラインにおけるターゲット検証を支援します。この手法は、手動でのトラッキングと比較して解析バイアスを低減し、スループットを向上させるため、初期段階のターゲットエンゲージメント研究における予測信頼性を高めます。
本手法は、リード化合物の同定および前臨床有効性試験に先立ち、定量的な細胞骨格表現型に基づいたターゲット選定を行うという、創薬の初期探索プロセスに適合するものです。