マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析その場で TUNEL法を用いた

この手順の全体的な目標は、C 2のDNA切断と細胞死を検出することです。これは、トンネル試薬が細胞核に入ることができるように、最初に組織切片を透過させることによって達成されます。次に、TDT酵素を使用して、これらの細胞のDNA切断の3つの主要な末端にDTPを共有結合します。

次に、DUTPに蛍光プローブをタグ付けします。最終的に、トンネル陽性シグナルは、細胞内のDNA切断の相対頻度を反映して、組織切片で定量化されます。この手法がサザンブロッティングや免疫組織化学などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、比較的高速に特異的であり、ノイズや自家蛍光を排除する方法を提供することです。

孤立した後肢をPBS中の4%パラホルムアルデヒドに15ミリリットルのチューブに固定することから始め、4°Cで4時間から最大24時間固定することができます。組織が胚の場合、わずか2時間しか必要ありません。ただし、固定後は溶液を10%スクロースに置き換えて組織を凍結保護し、摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、溶液を滅菌ろ過された30%スクロースに変更し、一晩または後肢がチューブの底に沈むまでインキュベーションを続けます。埋め込むときは、後肢が埋め込み媒体に完全に沈んでいることが重要です。埋め込み型は、ドライアイスに直接置くか、ドライアイス上のアイソップペンタンに置き、媒体を凍結することができます。

凍結切片の場合。ブロックは、厚さ10ミクロン以下の転写セクションを切断し、より厚いセクションはトンネル標識試薬によって貫通されません。これらの薄い切片をゼラチンまたはベクターボンドコーティングされたスライドガラスに室温で集めます。

非常に迅速に、スライドをドライアイスに移して保管します。まず、凍結した組織切片のスライドを室温まで解凍し、16〜64時間乾燥させます。スライドが室温になったら、PBSを充填したカップリングジャーで切片を10分間再水和します。

この再水和ステップを一度繰り返してから、組織切片を乱さずにラボワイプでスライドを慎重に乾燥させて切片をパーミーズし、スライドを湿度チャンバーに入れ、50マイクロリットルの非タンパク質分解サポニンベースの市販試薬を切片にピペットで移します。セクションに直接ピペットで移さないでください。これは、取り外したり損傷したりする可能性があるためです。次に、パラフィルムの小片を切片の上に置き、試薬を広げます。

気泡が発生した場合は、パラフィルムを塗り直してください。スライドを1時間後に1時間インキュベートします。PBSで5分間の洗浄を2回使用して試薬を取り出し、慎重に軽くたたいて乾かします。

次に、TDTによるDNA切断の標識として、市販のキットを使用してください。まず、XTDTバッファーを1つ作成し、セクションにピペットで移します。次に、スライドを加湿チャンバーで5分間インキュベートします。

次に、キットの指示に従ってTDTラベリングミックスまたはポジティブコントロールスライドを作成します。TDTラベリングミックスにDNAを添加します。ネガティブコントロールスライドの場合は、TDT酵素をミックスから省略します。

次に、ワイプを使用して、スライドからできるだけ多くのバッファーを取り除き、ラベリングミックスにピペットで貼り付けます。50マイクロリットルで十分です。再度、泡を作らずにパラフォームで溶液を広げます。

スライドをチャンバー内で摂氏37度で1時間インキュベートします。第三に、キットの指示に従ってone x stopバッファーを作成します。ラボワイプでラベリングミックスを取り除いた後、2〜300マイクロリットルのストップミックスを追加して、セクションを完全に覆います。

次に、スライドをチャンバー内で5分間インキュベートします。このステップではパラフィルムは使用しません。ストップバッファーを取り外すには、PBSで2分間の洗浄を2回使用します。

今新たに準備されたフルオレセイン標識液の50マイクロリットルをピペットで。スライド上にパーフィルを塗布し、チャンバー内で20分間インキュベートしますが、今度は暗闇でインキュベートします。PBSで2分間の洗浄を1回行い、一部のフックを希釈して洗浄しながら、ラベリング溶液を取り出します。

PBSで1ミリリットルあたり3、3、2、5、8〜1マイクログラム。洗浄後、希釈したフック溶液の1〜200マイクロリットルでセクションを覆います。その後、スライドを5分間インキュベートし、光から遮蔽してフックを取り外して染色し、PBSで5分間の洗浄を3回使用します。

次に、スライドをラボワイプで慎重に乾かし、イメージング用のカバースリップを塗布します。dpi、fitzy、Texas red フィルターを使用して切片を画像化し、フック染色、トンネル染色、自家蛍光シグナルを 1 つの画像で 3 つの偽色チャネルに分離します。すべてのスライド間で同じイメージング設定を標準化および維持して、簡単に比較できるようにします。

解剖学的参照のために自動露出またはゲイン設定を使用しないでください。画像解析ソフトウェアでhとeで染色された隣接する後肢切片の明るい明視野画像を使用します。トンネルチャネルをオフにします。

次に、他のチャネルを使用して定量化する筋肉領域の輪郭を手動でトレースします。トレースした領域をマスクに変換します。次に、トンネルチャネルを再びオンにし、最小強度しきい値を調整して自己蛍光シグナルを除外します。

調査で分析されたすべてのセクションに同じしきい値制限を使用します。次に、しきい値ピクセルをマスクに変換します。各画像で、筋肉領域マスクとしきい値トンネルマスクを組み合わせます。

これにより、トレースされた筋肉領域内のトンネル信号が表現されます。次に、結合されたマスクを定量化して、トンネル陽性オブジェクトの数と、筋肉内のトンネル信号の総ピクセル面積を決定します。これらの値を統計分析に使用します。

低倍率のトンネル陽性物体は、骨格筋に明るい不規則な断片として現れることがあります。しかし、より高い倍率では、細胞死タイプがこのアポトーシスに関与している場合、古典的なアポトーシス形態を持ついくつかのトンネル陽性物体が観察されるべきである。D DNAを添加したポジティブコントロールは、すべての組織に均一に分布した豊富なトンネル陽性シグナルを示すはずです。

セクション内。TDT酵素を含まないネガティブコントロールは、低強度のバックグラウンドを持ち、自家蛍光のみを示す必要があります。記載されたプロトコルにより、RBCの骨および内皮細胞が、調製された上肢切片における自己蛍光シグナルに寄与することが見出された。

真のトンネル陽性信号ははるかに強烈でした。これは、ピクセル強度閾値を使用して自家蛍光シグナルから分離できます。トンネル信号を分離する別のオプションは、トンネルチャネルから赤色の自家蛍光チャネルをデジタル的に差し引くことでした。

この技術を使用すると、骨格筋細胞が死滅します。評価したSMAのマウスモデルでは、トンネル標識により、5日齢のSMAマウスでは対照群よりも多くのアポトーシス細胞が明らかになりました。トンネル染色を定量化することにより、この観察結果は後肢内の複数の筋肉群に対して統計的に有意であることが示されました。

トンネル技術を習得すると、約4時間で完了し、信頼性の高い定量的結果を生成できます。