幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

この手順の全体的な目標は、幹細胞から高品質の網膜色素上皮(RPE)を再現性よく導き出すことです。これは、最初に誘導性多能性幹細胞を増殖させることで達成されます。第2ステップでは、培地を交換して細胞をRPE運命に導きます。

次に、RPE細胞を皿内の他の分化細胞から単離し、次に十分な数の細胞が得られるまで培養物を増殖させます。最終的には、培養物の暗い色素沈着と丸石の形態を使用して、RPE細胞が最終分化に達していることを確認できます。この手法が自然分化などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、定義された要素を追加することで分化と時間が加速され、RPEの収量が増加することです。

そのため、これまでに何千ものげっ歯類が、IPSAのさまざまな網膜変性疾患に由来するRPE細胞を使用して治癒されてきました。しかし、もし私たちが効率的かつ効果的にこれらの病気の診療所で人間を治療するためにこれを翻訳する場合、それは絶対に私たちが高品質の、RPEの販売とIPSの高数を提供する確立された再現可能なプロトコルを開発することが絶対に不可欠ですこの方法の視覚的な表現は、1人だけが任意の時間にフードの下で顕微鏡で働くことができます、 分離ステップを視覚化するのが難しくなります。私の研究室の研究技術者であるミッチェル・プリンスは、幹細胞由来のRPE培養の分化を指示するために、マウス胚フィーダー細胞の層上の目的の幹細胞株を6ウェルプレートのウェルあたり6個の細胞に2回10回で指示するために、手順のデジタル培養の側面に関連するプロトコルを実証します。 コロニーがCOFの流暢さに達するのを待ってから、分化して毎日の摂食に切り替えます。

ニコチンアミドを添加した培地。3週間後、RPEの分化を強化するために、活性剤またはIDEのものを給餌に追加し始めます。2週間後、分化培地とニコチンアミドのみに切り替えて、毎日の摂食を中止します。

給餌の翌日に培地のpHインジケーターが黄色に変色しなくなったら、色素沈着した細胞のアイレットが切断して除去するのに十分な大きさになるまで、培養物をインキュベーターに戻します。次に、色素沈着したアイレットを単離するために、天然の細胞環境を模倣したゼノフリーマトリックスを備えた24ウェルプレートのウェルをコーティングします。次に、24ウェルプレートのウェルを必要な数だけ分化培地で充填します。

また、細胞培養フードでは、解剖スコープとメスを使用して、元のプレートの底にある各色素沈着アイレットを2〜6個に切り刻み、鋭利な鉗子で色素部分をつかみ、次に1〜2個の色素沈着片をそれぞれに移します24。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で、細胞が付着するまで3〜5日間よくインキュベートします。その後、週に3回メディアを交換し始めます。

分化培地で細胞を3〜4週間増殖させます。継代まで週に3回細胞に栄養を与え続けます。RPEは、細胞を剥離するために、摂氏37度で200マイクロリットルの予温非トリプシン細胞解離溶液を追加します。

5〜8分後、新鮮な分化培地で反応を停止し、200マイクロリットルのピペットで培養物を単一細胞懸濁液に再懸濁し、細胞の少ないコロニーをプールします。次に、解離したコロニーを15ミリリットルのチューブに移し、細胞をスピンダウンします。Resusは、ペレットを3ミリリットルの分化培地に懸濁し、それぞれがコロニーをマトリックスの各ウェルに移し、ウェルごとに3ミリリットルの分化培地を追加で含む6ウェルプレートをコード化します。

次に、細胞が約90%コンフルエントになるまで細胞を1〜2週間膨張させ、示したように1ミリリットルの解離溶液で細胞を再度剥離します。今度こそです。1000マイクロリットルのピペットを使用して細胞を再懸濁し、シングルセル溶液を50ミリリットルのコニカルチューブに移します。

そして、細胞を再びスピンダウンした後、ペレットを懸濁します。分化の18ミリリットルで、培地は最終的にマトリックスコード培養容器内の細胞をリプリングし、さらなる下流分析のための継代の最小数で最大数の所望の細胞を得るため、色素沈着コロニーは誘導性多能性幹細胞株培養の5〜7週間後に現れ始める。これらのコロニーは、培養が維持されるにつれて数週間成長し続けることができます。

十分なサイズに達したら、手動で切除することができます。非RPE細胞とのコンタミネーションを避けるための慎重な切除により、十分に純度の高いRPE培養物の生成が大幅に促進されます。一度習得すると、技術が適切に実行されれば、8〜12週間で多数のRPE細胞を導き出すことができます。

この手順を試みる際には、培地の作成や細胞の供給中に培養物を汚染しないように注意することを覚えておくことが重要です。この動画をご覧になった方には、IPSから高品質なRPE細胞を大量に作製していただけることを願っています。これにより、ベンチからベッドサイドへのより迅速な移動が容易になり、現在治療不可能な網膜変性腫瘍性疾患に苦しむ患者に細胞ベースの治療が提供されることを願っています。