Name: 幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぼう 幹細胞から網膜色素上皮細胞を効率的に導出する方法。定義された因子を用いた分化誘導により高品質なRPE細胞を再現性良く産生し、網膜変性疾患の細胞治療や創薬研究への応用を促進します。

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私たちは、以下の方々に感謝いたします：Tim Krohne博士とEyal Bain博士(ならびにMandy Lehmann博士およびDavid Friedlander博士)は、分化プロトコルの開発に寛大な支援を提供していただきました。この研究で使用されたRPE細胞の分化を支援してくださったFelicitas Bucher博士。また、このプロジェクトに非常に寛大な資金を提供してくださった国立眼病研究所(NEI助成金EY11254およびEY021416)、カリフォルニア再生医療研究所(CIRM助成金TR1-01219)、およびLowy Medical Research Institute(LMRI)にも感謝します。

幹細胞由来のRPEの1.ダイレクト分化注：全てのインキュベーションステップを、5％CO 2中で37℃で実施される<ol style="margin-left: 40px;"><li>維持培地（; 表1 MM）でのhESまたはHIPSライン（毎日餌）を維持する。ラインは、品質管理の十分な基準に達したら、マウス胚性フィーダー細胞（MEFの）の層の上にそれらを維持する6ウェルプレート250,000 /ウェルの密度で播種した。異種非含有培養もタッカーらによって設立されたプロトコルに従って生成することができます。40。 </li><li>幹細胞のコロニーがコンフルエントに到達できるように。 </li><li>ニコチンアミド（; 表1 DM / NIC）に分化培地に切り替え。毎日食べます。 </li><li> RPE分化を強化するために、培養3週間後、ニコチンアミドのいずれかアクチビンAまたはIDE-1（ 表1 DM / NIC / AAまたはDM / NIC / IDE1）で分化培地に切り替える。 </lI&gt; <li>培養での5週間後、DM / NICに切り替える。メディア停止中のpH指示薬が給餌の翌日黄色回し一日一回の授乳は、もはや必要ありません。 </li><li> （ 図2D-Fおよび3Aを参照してください）を切断して除去するのに十分な大きさであることを表示する色素性細胞の小島のを待ちます。 </li></ol> 2.単離色素性島<ol style="margin-left: 40px;"><li>コー​​ト天然の細胞環境を模倣マトリックスと24ウェルプレートのウェル（異種非含有であることが好ましい）。 注：角膜ブレードと鋭い、先の細い鉗子は、ピッキングのために非常に有用である。ピッキングしながら、分化した細胞のシート全体を切り離すことができます。慎重に作業し、当初は皿の中央にコロニーを拾い、この問題を回避してください。 </li><li>必要に応じて、分化培地（ 表1 DM）を24ウェルプレートのような多くの井戸を埋める。この決定は、着色されたコロニーの数に依存する集めた。 </li><li>解剖スコープを持つ細胞培養フードでは、手動で着色された島を切り出す。約2-6バラバラにメスを使用して、元のプレートの下にあるそれぞれの膵島を切り刻むと鋭いピンセットで着色された部分をつかむ。 </li><li>各24ウェルに1-2着色された部分を転送します。 </li><li>細胞が接着するまで、メディアを1週間に3回の変更を開始、その後、3〜5日間のメディアを変更しないでください。 （彼らはこの時間後に付着していない場合は、可能性が、彼らは決して良いことである）。 </li><li>分化培地（DM; 表1）で3~4週間細胞を増殖-典型的な培養物の画像を図3Bに示されている。細胞はまだ全体をよく埋めないかもしれないが、より長い待っていることは助けていないようです。細胞を1週間に3回を養う。 </li><li>必要に応じて、約3週間後に、手動で鋭いピンセットで塊の白い細胞のクラスターを削除します。それが必要でない限り、この手順を実行しないでください - それは、汚染物質を導入することは容易である。 〜するのは理想的です。ステップ1.6で、元の着色されたコロニーからRPEの最も純粋な集団を得ることを試みる。 </li></ol> 3.継代幹細胞由来のRPE <ol style="margin-left: 40px;"><li> 37℃で5-8分間（好ましくは、トリプシンの希釈を通して不活性化することができる試薬であることが好ましいていない）細胞解離溶液と200μlの持つ細胞を剥離し、DMで希釈し、それを不活性化する。すべてのセルを洗い流すためにと（2つの24ウェルから細胞をプールすることを検討、数個の細胞のみが含まれているだけでなく、選択している場合）、それらを再懸濁し、200μlのピペットを使用してください。 </li><li>遠心機（5分間800×gで）、上清を捨て、そして3ミリリットルDMのメディアで再懸濁します。 </li><li>再プレート細胞1つ（または2つ）ウェル当たりDM 3ml中の一つのマトリックスコートした6ウェルに24ウェルから（1：5の拡張）。 </li><li>細胞が約90％コンフルエントになるまで1〜2週間を展開。完全に分化した純粋培養の画像は、図3Cに示されている。 </li><li> 1ミリリットルの細胞dで細胞を剥がし37℃で約5-8分間issociation溶液は、DMで希釈し、それを不活性化する全ての細胞を洗い流す1,000μlのピペットを使用し、それらを再懸濁する。 </li><li>スピンダウン（5分間800×gで）、上清を捨て、そして18ミリリットルのDM培地で再懸濁します。 </li><li> （6展開1）又は1でコーティングされた75センチメートル2フラスコ（1：7.5の拡張）は、6マトリックスに1つの6ウェルの各々から再プレートの細胞をウェルあたりDM 3mlの6ウェルをコーティングした。 </li><li>十分な細胞が得られるまで繰り返して、必要に応じて3.4から3.8を繰り返します。 注：むしろ各通路はRPEの脱分化を誘導するので、継代を経由しての文化を増幅することを計画よりも拡大のための可能な限り多くのコロニーを収集してみてください。 </li></ol>

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著者の誰も、宣言すべき商業的開示を持っていません。

この原稿では、効率的に純粋なIPS-RPE培養を大量に生成するための手順の概要を説明します。私たちは強くトランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、および機能性に基づいてhRPEに似たiPS-RPEを生成することができますアクチビンAと、この指示分化プロトコルを使用して、以前に示されており、RCSラット12,31,32のに移植するとき、彼らは網膜変性を遅らせること。のiPS-RPEを生成するプロセスは、時間がかかり、面倒ではない（ 図1）である。のiPS培養物がコンフルエントに達すると、彼らは日常的に分化培地を供給する必要があります。私たちは、アクチビンAまたはより安価な低分子IDE-1のいずれかでメディアを補完し、一般的には5-7週間後（ 図2A-C）の後に表示される着色されたIPS-RPEコロニーのための文化を監視しながら、2週間の餌を続ける。一度十分な大きさに達した（ 図2D-Fおよび3A）、コローニESは手動で削除すると拡大のための新たなプレートに移す。これは8...

網膜を占める様々な細胞タイプは、機能的な構造で組織化されています。網膜の後ろにある光受容体は、光伝達を通じて光を電気インパルスに変換する役割を担っています。しかし、光伝達は、ミューラーグリア細胞や網膜色素上皮(RPE)細胞など、他の隣接する細胞タイプの協調的な努力なしには起こり得ません。RPE細胞の単層は、光受容体の主要な血液供給源である絨毛毛細血管から感覚網膜を分割し、光受容体の恒常性に重要な複数の機能を制御するのに理想的な位置にあります。実際、RPEと光受容体は非常に共依存的であるため、1つの機能ユニットであると広く考えられています。 (RPEのすべての多様な機能のレビューについては、Strauss、2005、1を参照してください。網膜色素上皮細胞の死滅または機能不全は、先進国における永久的な視力喪失の主な原因である加齢性黄斑変性症(AMD)を誘発する可能性があります2-4。
AMDは、RPE、光受容体、および脈絡膜血管系の多因子疾患であり、危険因子は多様であり、環境的および遺伝的影響の組み合わせが含まれます5,6。AMDの治療法は非常に限られていますが、有望な治療法の1つはRPE細胞置換術です7,8。結果はまちまちですが、AMD患者(および網膜変性症の他の患者)および網膜変性のげっ歯類モデルにおけるRPE細胞の移植は、重大な光受容体萎縮を一過性に防ぐ可能性があります9-23。 (これらの研究で一般的に使用される動物モデルは、MerTK遺伝子に変異を持つRoyal College of Surgeons(RCS)ラットです。この突然変異により、RPE細胞は光受容体の外側セグメントを貪食できなくなり、網膜変性を促進します24)。RCSラットおよびマウスの網膜下腔に埋め込まれたRPEの報告された生存率は大きく異なるが、それらが数ヶ月または数年生存する可能性がある9,10,12,20。
RPE細胞は、多能性幹細胞9-14,25-28からそれらを誘導することにより、移植に十分な数で得ることができます。いくつかの独立したグループは、これらの細胞が体細胞の対応物と同様に機能することを実証しており、長期的な研究では、ラットおよびマウスの疾患モデル9,10,12,14,19,20,25,29-32に移植すると安全であることが示唆されています。胚性幹細胞の代わりに人工多能性幹細胞を使用することは、同種RPEに関連する倫理的問題や免疫学的課題が回避される可能性があるため、有利である可能性がある33,34。iPS技術のもう一つのエキサイティングなアプリケーションは、疾患モデリング35です。RPE疾患の患者に由来する多数のRPE細胞を調査する能力は、その分子基盤を理解するために非常に貴重です。このタイプの研究は、最近、Best 疾患患者 RPE で実施されており、遺伝性黄斑症の同様の研究への道を開く可能性があります36。
幹細胞からのRPEの導出は比較的単純なプロセスであり、完全にゼノフリーの条件で行うことができます。最も単純な戦略は、RPE細胞の単層を自発的に誘導することですが、指向性分化技術を使用して収量を大幅に改善できます。しかし、これらの技術は、高価で、細菌や他の非ヒト源でしばしば生成される可能性のある外因性タンパク質因子の使用を含む10,12,37。私たちの研究では、ニコチンアミドとアクチビンAを利用する確立されたプロトコル10に従いました。これは、RPE仕様38に十分であることが示されているシグナル伝達因子です。ここでは、低分子IDE-1がアクチビンAを適切に置き換えることができることを実証し、したがって、組換えタンパク質の使用に関連するコストを削減し、懸念を軽減する39。また、ゼノフリー血清置換療法を利用し、合成ゼノフリー基質上で分化したRPE細胞を培養します。RPE細胞は、このアプローチを用いて非常に効果的に分化することが以前に示されている40。
単層として分化させると、RPE細胞を含む色素沈着コロニーを早くも5週間後に視覚化します12。十分なサイズに達したら、手動で切除し、別の皿に移して拡張することができます。RPE細胞は、継代ごとに脱分化することで有名であり、5継代より古いものの使用は避けるべきです(動物モデルでの特性評価と移植に十分な数の細胞は、2つまたは3つの継代後に簡単に生成できることがわかりました)。完全に分化した後は、複数の技術を用いて細胞を解剖学的および機能的に特徴付け、疾患のあるRPEの適切な代替品として機能するようにします。これらの技術の説明、およびげっ歯類の網膜下空間にiPS-RPEを移植するためのプロトコルは、この方法の論文の範囲を超えており、以前に発表されています12,32,41。
iPS-RPEの効果的な導出のための標準化されたプロトコルの開発が臨床にとって明らかに重要である一方で、動物モデルではまだ重要な前臨床研究が行われています。iPS細胞由来細胞の免疫原性が懸念されており、人工基質への細胞移植など、複数の異なる移植技術が検討されている42,43。これらの理由から、標準化されたプロトコルの公開は、臨床研究と前臨床研究の両方を促進するために有益であると感じています。特に、異なる研究グループによって異なる研究室で得られたiPS-RPE細胞を直接比較する場合。

<table><tbody><tr><td>角膜ナイフ&nbsp;</td><td>Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>ナイフx 1</td></tr><tr><td>DMEM / F-12、HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml x 4&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、1X w/out CaまたはMg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 ml x 6</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、レギュラー (熱不活性化)</td> <td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) 組換えヒトタンパク質</td><td>ライフテクノロジー</td><td>PHG0021</td><td>100 & マイクロ;g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>ステムジェント</td><td>04-0026</td><td>2 mg x 1</td></tr><tr><td>ノックアウト DMEM</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>ノックアウト セラム リプレイスメント</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>10828-028</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 100X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>100 g x 1</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 ml x 1</td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス/ラット アクチビン A&nbsp;</td><td>ペプロテック</td><td>120-14E</td><td>10 & マイクロ;g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T 表面 6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3877</td><td>ケース(12) x 1</td></tr><tr><td>TrypLE-Express 酵素 (1X)、フェノールレッドなし&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>12604-021</td><td>500ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>真空フィルター/保存ボトルシステム、0.1&micro;mポア、500ml&nbsp;</td><td>コーニング431475</td><td></td><td>ケース(12)×1&nbsp;</td></tr></tbody></table>

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

加齢黄斑変性症(AMD)の治療法は発見されていません。これは、55歳以上の人々の視力喪失の主な原因です。AMDは、病因が不明な複雑な多因子疾患ですが、網膜の根底にあり、光受容体の重要なサポートを提供する細胞の単層である網膜色素上皮(RPE)の死または機能不全が原因で発生すると主に考えられています。RPE細胞置換戦略は、AMD患者の大部分に治療的救済を提供する大きな可能性を秘めており、初代ヒト細胞(hRPE)に強く類似したRPE細胞は、私たち自身を含む複数の独立した研究所で生成されています。また、iPS-RPEの用途は細胞を用いた治療にとどまらず、RPE疾患のモデル化にも利用されています。このような研究は、疾患の分子基盤を解明するだけでなく、新薬の開発や試験にも役立つ可能性があります。ここでは、幹細胞からのRPEの指向性分化のための最適化されたプロトコルを紹介します。ニコチンアミドと、その効果を模倣する小分子であるアクチビンAまたはIDE-1を特定の時点で添加すると、RPE細胞の収量が大幅に向上します。この手法を使用すると、早ければ3か月で大量の低通過RPEを導き出すことができます。

図1に示すように、本 ​​稿で説明する手順は、以前に報告されているように10,12を容易に幹細胞からRPEを生成するために使用することができる。数週間のiPSラインを維持した後、着色されたコロニーが5-7週間後（7週齢の培養物は、図2A-Cに示されている）の後にコロニーに現れ始める。これらのコロニーは培養が維持されているように週間成長し続けることができます。 図3Aに示すように、 図2D-F（8週目の培養）に示すように、十分な大きさに達したら、それらを手動で切り出すことができる。非RPE細胞の混入を避けるために慎重な切除が大幅に十分に純粋RPE培養（ 図3B-C）の生成を促進する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52214/52214fig1highres.jpg"><br...

幹細胞由来の網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性のための細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物研究など、複数の用途に使用することができます。ここでは、幹細胞からRPEを再現性よく導出するための簡単なプロトコールを紹介します。

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

この手順の全体的な目標は、幹細胞から高品質の網膜色素上皮(RPE)を再現性よく導き出すことです。これは、最初に誘導性多能性幹細胞を増殖させることで達成されます。第2ステップでは、培地を交換して細胞をRPE運命に導きます。次に、RPE細胞を皿内の他の分化細胞から単離し、次に十分な数の細胞が得られるまで培養物を増殖させます。最終的には、培養物の暗い色素沈着と丸石の形態を使用して、RPE細胞が最終分化に達していることを確認できます。この手法が自然分化などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、定義された要素を追加することで分化と時間が加速され、RPEの収量が増加することです。そのため、これまでに何千ものげっ歯類が、IPSAのさまざまな網膜変性疾患に由来するRPE細胞を使用して治癒されてきました。しかし、もし私たちが効率的かつ効果的にこれらの病気の診療所で人間を治療するためにこれを翻訳する場合、それは絶対に私たちが高品質の、RPEの販売とIPSの高数を提供する確立された再現可能なプロトコルを開発することが絶対に不可欠ですこの方法の視覚的な表現は、1人だけが任意の時間にフードの下で顕微鏡で働くことができます、 分離ステップを視覚化するのが難しくなります。私の研究室の研究技術者であるミッチェル・プリンスは、幹細胞由来のRPE培養の分化を指示するために、マウス胚フィーダー細胞の層上の目的の幹細胞株を6ウェルプレートのウェルあたり6個の細胞に2回10回で指示するために、手順のデジタル培養の側面に関連するプロトコルを実証します。 コロニーがCOFの流暢さに達するのを待ってから、分化して毎日の摂食に切り替えます。ニコチンアミドを添加した培地。3週間後、RPEの分化を強化するために、活性剤またはIDEのものを給餌に追加し始めます。2週間後、分化培地とニコチンアミドのみに切り替えて、毎日の摂食を中止します。給餌の翌日に培地のpHインジケーターが黄色に変色しなくなったら、色素沈着した細胞のアイレットが切断して除去するのに十分な大きさになるまで、培養物をインキュベーターに戻します。次に、色素沈着したアイレットを単離するために、天然の細胞環境を模倣したゼノフリーマトリックスを備えた24ウェルプレートのウェルをコーティングします。次に、24ウェルプレートのウェルを必要な数だけ分化培地で充填します。また、細胞培養フードでは、解剖スコープとメスを使用して、元のプレートの底にある各色素沈着アイレットを2〜6個に切り刻み、鋭利な鉗子で色素部分をつかみ、次に1〜2個の色素沈着片をそれぞれに移します24。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で、細胞が付着するまで3〜5日間よくインキュベートします。その後、週に3回メディアを交換し始めます。分化培地で細胞を3〜4週間増殖させます。継代まで週に3回細胞に栄養を与え続けます。RPEは、細胞を剥離するために、摂氏37度で200マイクロリットルの予温非トリプシン細胞解離溶液を追加します。5〜8分後、新鮮な分化培地で反応を停止し、200マイクロリットルのピペットで培養物を単一細胞懸濁液に再懸濁し、細胞の少ないコロニーをプールします。次に、解離したコロニーを15ミリリットルのチューブに移し、細胞をスピンダウンします。Resusは、ペレットを3ミリリットルの分化培地に懸濁し、それぞれがコロニーをマトリックスの各ウェルに移し、ウェルごとに3ミリリットルの分化培地を追加で含む6ウェルプレートをコード化します。次に、細胞が約90%コンフルエントになるまで細胞を1〜2週間膨張させ、示したように1ミリリットルの解離溶液で細胞を再度剥離します。今度こそです。1000マイクロリットルのピペットを使用して細胞を再懸濁し、シングルセル溶液を50ミリリットルのコニカルチューブに移します。そして、細胞を再びスピンダウンした後、ペレットを懸濁します。分化の18ミリリットルで、培地は最終的にマトリックスコード培養容器内の細胞をリプリングし、さらなる下流分析のための継代の最小数で最大数の所望の細胞を得るため、色素沈着コロニーは誘導性多能性幹細胞株培養の5〜7週間後に現れ始める。これらのコロニーは、培養が維持されるにつれて数週間成長し続けることができます。十分なサイズに達したら、手動で切除することができます。非RPE細胞とのコンタミネーションを避けるための慎重な切除により、十分に純度の高いRPE培養物の生成が大幅に促進されます。一度習得すると、技術が適切に実行されれば、8〜12週間で多数のRPE細胞を導き出すことができます。この手順を試みる際には、培地の作成や細胞の供給中に培養物を汚染しないように注意することを覚えておくことが重要です。この動画をご覧になった方には、IPSから高品質なRPE細胞を大量に作製していただけることを願っています。これにより、ベンチからベッドサイドへのより迅速な移動が容易になり、現在治療不可能な網膜変性腫瘍性疾患に苦しむ患者に細胞ベースの治療が提供されることを願っています。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

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