Name: マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ マウス背側列クラッシュ損傷におけるミクログリアとマクロファージの動態を、二光子生体内イメージングで観察する手法。この技術により、細胞間相互作用をリアルタイムで可視化し、神経炎症応答の理解を深める。

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次の機関がこの研究に重要な資金援助を提供しました：MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick's Foundation (A.Y.H.), Alex's Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle's Angel Foundation (A.Y.H.), Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). 著者は、背柱クラッシュ(DCC)の損傷を学ぶ上でのジェリー・シルバーとサラ・ブッシュの不可欠な助けに感謝しています。 また、ジェノタイピングの技術的支援を提供してくれたJingquang You氏、Elisabeth Hare氏、Hongmei Hu氏、脊椎安定化ユニットの取り付けを担当したRoss Anderson氏にも感謝しています。

注：すべての動物が飼育し、機関の動物管理使用委員会（IACUC）に従って利用されるべきである。ここで説明するすべての手順は、ケースウエスタンリザーブ大学IACUCによって承認されている。 1.トランスジェニック動物<ol><li>軸索（汝-1 YFP H）50及びミクログリア/単球（;材料のリストを参照してくださいCX3CR1 GFP / GFP 51）を標識するために市販の蛍光レポーターマウスを使用してください。これらのマウスは、交配や制度動物ケアポリシーに従って個々の繁殖コロニーとして維持されるべきである。 </li></ol> 2.骨髄キメラ<ol><li>レシピエント動物として使用するための年齢の少なくとも8週間である動物を同定する。 </li><li>でも、全身照射を確保する立場にマウスを保持するように設計された円形照射保持ケージに宿主動物を置きます。 </li><li>セシウムにタイマーを設定し（CS-137）全身放射線DOSを管理するための照射製造業者の指示に従って動物に800〜ラドの年齢（ここに示す例は980ラドである）。 </li><li> 4時間の最小値のために休むために彼らのケージに動物を返します。 </li><li>適切な遺伝子型のドナー動物を選択する骨髄前駆細胞の供給源として（ 図2A参照 ）。 注記：適切なドナーが異なる細胞集団、またはコントロールと同じ遺伝子型のいずれかを識別するために、ホストから別の系統特異的蛍光レポーターを表現する動物である。 </li><li> 1ペトリ70％アルコールとの皿、および10ミリリットルロズウェルパーク記念研究所（RPMI）メディアおよびメディアに浸し40μmのセルストレーナーを持つ第二の皿を埋める。 RPMI培地で15ミリリットルコニカルチューブを埋める。氷の上で料理やチューブを保管してください。 </li><li>施設のガイドラインに従ってCO 2窒息によりドナー動物を生け贄に捧げる。すべての毛皮が濡れになるまで70％エタノールで全体の動物を浸すことによって、皮膚や毛を清掃してください。 </li><li> SKの削除中央部分の周りにカットすると、完全に脚の筋肉を露出するように後ろ足の上に皮膚をプルダウンすることによって、動物の下半分からで。 </li><li> 、骨を脱臼その後滅菌ピンセットやハサミ、皮を使用し、脛骨の両端から離れて筋肉をカットして膝関節の前方過伸展による脛骨を削除します。メディアを含むペトリ皿の内側セルストレーナーに転送後、最大30秒間アルコールでペトリ皿に骨を置きます。 </li><li>股関節を脱臼し、大腿骨に付着した筋肉をはが​​し、アルコールで簡単に大腿骨を入れ、次いで、皿内部の同じセルストレーナーに入れてください。 </li><li>組織培養フード内で、骨の両端を切断し、骨の端部に1mlシリンジに21ゲージの針を挿入するために、滅菌ハサミを使用。メディアと15ミリリットルコニカルに骨髄をフラッシュします。残りの骨のための手順を繰り返します。 </li><li> 3ミリリットルの注射器からプランジャーのバックを使用して、クラッシュの骨は、セルで終わるより多くの細胞を抽出するためのペトリ皿にストレーナー。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブの上にフィルターを置き、15ミリリットルコニカルチューブから吸引細胞とメディアを転送。単一細胞懸濁液を得るために、骨髄を粉砕するプランジャの背部を使用する。 50ミリリットルコニカルチューブにメディアの30ミリリットルと15ミリリットルの円錐管、骨片とセルストレーナーを洗ってください。 </li><li>遠心ペレット細胞に500×gで5分間、細胞。 </li><li>アンモニウム、塩化物カリウム2分間（ACK）溶解緩衝液2 mlの溶解赤血球。 10％ウシ胎児血清を含む培地10mlの溶解緩衝液をクエンチする。ペレットに5〜10分間500×gで遠心し。 </li><li>各洗浄のためにペレット化する5〜10分間500×gで遠心分離し、生理食塩水で一度RPMI培地10ml中や細胞を2回洗浄する。 </li><li>生理食塩水200μl中3×10 6細胞の最終濃度になるように細胞を再懸濁する。 </li><li>滅菌済に尾静脈注射を介して転送3×10 6個の骨髄細胞adiatedレシピエントマウス。 </li><li>受信者のケージに酸性化した水（pHは3.0）を配置し、マウスが回復することができます。 注：移植は、処置後10〜14日以内に死亡するが失敗したマウス。 </li><li> 8週間後、フローサイトメトリー（ 図2B-C）を用いて末梢血免疫細胞を調べることにより、骨髄再構成を検証する。 </li></ol> 3.背列圧挫注：目的の実験に基づいて、適切なキメラ動物または手術のための二重トランスジェニック動物を選択してください。どちらラベル居住者または骨髄由来の細胞と動物は、前のステップで作成されました。 <ol><li>準備し、骨鉗子、デュモン＃4鉗子、アイリスはさみ、組織、針ドライバと創傷クリップを保持するための鉗子を含むオートクレーブ手術器具、。 </li><li>疼痛コントロールのためのマウスに投与するために薬を準備します。 Bupernexとマーカイン、一般的に疼痛管理のために使用される。必要に応じて、適切な薬を使用してくださいND施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認。 </li><li> 4％イソフルランで麻酔を誘導し、毎分60〜100回の呼吸呼吸速度を達成するために、1〜2％イソフルランで維持する。麻酔下での乾燥を防ぎ、足のピンチによる応答がないことを確認するために、動物の目に目の潤滑剤を適用します。加熱パッドを使用して温度を維持し、直腸プローブを用いて温度を監視する。 </li><li>目標と脊髄レベル以上の電気シェーバーでマウスの背中を剃る、その後2回70％アルコールに続いてポビドンヨードで面積を3回綿棒。無菌ドレープで動物を置き、手術部位を可視化するために適切な位置で切断穴を持つ別の滅菌ドレープで動物をカバーしています。手術を通して無菌ドレープ上のすべてのツールを維持します。 </li><li>動物の背中に筋肉を露出するようにアイリスハサミで希望の脊髄レベルでの正中線に沿って皮膚をカット。 </li><li>ディスの下で顕微鏡をecting、僧帽筋、彼らは背側脊髄のプロセスにアタッチし、脊柱を公開正中線に沿って広背筋の靭帯を含め、背中の筋肉をカット。 </li><li>特定の椎骨の椎弓板を明らかにするために椎骨の背側及び横突起間の回旋筋を除去すること（この場合、T11）が除去される。このプロセスへの最後の非浮動リブの挿入によりT11を特定します。 </li><li>削除するプロセスの上下にスペースに骨鉗子の先端を挿入し、彼らは、椎弓板の周りに所定の位置にしっかりしていることを確認しかし背骨を傷つけるには余りにも深くないように少し持ち上げます。ラミナを除去するための1回の移動で閉じる骨鉗子。 </li><li>残りの椎骨の小さな部分を除去する骨鉗子を使用して、必要に応じて椎弓切除術を拡大。 </li><li>定規に対してそれらを保持し、永久的なマーカーでマークすることで、＃4鉗子の先端から1ミリメートルを測定します。分離賭けで1ミリメートルを測定します定規に対する鉗子を保持することにより、2つの歯をWEENと鉗子のシャフトを介して、所定の位置にゴム製の鉗子リングをスライドさせて1ミリメートルの先端の最大幅を修正。 </li><li>脊髄にアクセスするために鉗子の歯のための2つの挿入箇所で硬膜を通して30ゲージの針を挿入することにより、小さな穴を作成します。 </li><li>マークは硬膜の上にあることを確認しながら、鉗子の側面にマークさ1ミリメートルの深さに穴を通して硬膜に90°の角度で、鉗子歯を挿入します。鉗子を閉じ、10秒間保持するピンチ。リリース、およびリピート鉗子は、3の合計を保持するためさらに2回を絞る。脊髄から鉗子を外します。 </li><li>損傷部位の上に生理食塩水、所定の位置に吸収性ゼラチン圧縮スポンジの一片を浸す。 </li><li>ランニングステッチを使用して、＃4、合成非吸収性のナイロン縫合糸で椎弓切除と浸したゼラチンスポンジの上に所定の位置に筋肉を縫合。 </li><li> 5ミリメートルの傷のCLIを使用して所定の位置に肌をクリップPS。 </li><li>臀筋に筋肉内切開部位を中心に生理食塩水を皮下の490μlの10μlのマーカイン（1.0ミリグラム/ kg）を注入し、5μlのBupernex（0.1 mg / kgを）。 </li><li>動物は暖かいパッド上で回復し、後肢のあらゆる動きの難しさや麻痺の兆候を監視することができます。完全に麻酔から回復するまで無人または他の動物の存在下で動物を放置しないでください。観測可能な運動障害を表示し、任意の動物を使用しないでください。 注：このクラッシュ病変は脊髄に沿った任意のレベルで実行することができますが、実際には、T10-L4は、呼吸に対するイメージングのためのより少ない技術的な課題を提起し、クランプを使用して体の動きを安定させる。クランプ配置は、胸部レベルで画像に胸郭の周りに変更する必要があります。 </li></ol> 4.生体内イメージング<ol><li>準備し、デュモン＃4鉗子、アイリスはさみ、組織を保持するための鉗子、針Dを含むオートクレーブ手術器具、河川や創傷クリップ。 </li><li>イソフルランで以前のようにマウスを麻酔。 4~5％で麻酔を誘導し、毎分60〜100回の呼吸の呼吸数と足のピンチに応答性の欠如を維持するために必要に応じて1~2％で維持する。加熱されたマウスを維持イメージングない呼吸数を監視し、連続的に、直腸プローブを用いて動物の温度を監視する。 </li><li>ベタジンで創傷クリップの周りの皮膚をきれいにした後、アルコール及び製造業者の指示に従って、創傷クリップを削除します。巻かれたクリップが削除されると、必要に応じてNairさんで髪を削除し、ポビドンヨードおよび70％アルコールで再びサイトをクリーニングします。 </li><li>ハサミで皮膚を再オープンします。筋肉から残りの縫合糸を外し、ピンセットで離れて筋肉を引っ張って、必要に応じてハサミでカットする。 </li><li>解剖顕微鏡下、脊髄つの椎骨レベルラミの上下の椎骨上の横突起の側にはさみで筋肉を切断してクランプするためのポケットを作成するnectomy。 </li><li>これらの椎骨の周囲クランプを取り付けて、締め。脊髄に到達するために顕微鏡の対物レンズのスペースを確保するために、必要に応じて調整します。脊髄は、イメージングプラットフォームに平行であることを確認し、イメージングのための組織の安定性を維持する。呼吸アーチファクトが見られた場合は、撮像視野の動きを最小限にするためにそれに応じてクランプを再調整する。 </li><li>パラフィルムでクランプをカバー。 </li><li>また、可能な髄膜上からできるだけ多く瘢痕組織を除去し、繊細に、できるだけ多くの作品をオフにピッキング、鉗子を用いて脊髄から吸収性ゼラチン圧縮スポンジを削除します。必要に応じてカバーは生理食塩水と新しいスポンジで脊髄を露呈した。 注：すべての出血はスポンジで忠実なことも、必要に応じて焼灼いずれか、周囲の筋肉から発生した場合。しかし、焼灼と脊髄に触れないように注意してください。焼灼時浸したティッシュペーパーまたはゼラチン圧縮スポンジの部分のいずれかと脊髄を覆う。 </li><li> WELを作成最初Vetbondで皮膚および組織をシールし、次によく脊髄ホルダー二クランプおよび動物の側の間を構築するために歯科用アクリルを使用して、液浸流体を保持するためのリットル。アクリルが硬化するまでお待ちください。 </li><li>人工脳脊髄液（aCSFの）とよくを記入し、手術部位周辺での出血のために再度確認してください。 </li><li>任意で、この時点で、撮像中の血管を強調するために尾静脈注射によって静脈内蛍光血管色素を注入。 注：量子ドット、蛍光標識されたレクチンはまたとして有用な血管染料を果たすが、70 kDaの上記蛍光デキストランは、多くの場合、使用されている。 15万WM TRITCデキストラン50μlのは、一般的に静脈内注射する。 </li><li>生理学的に関連する免疫細胞の運動性を得るために、マウスの温度を37℃に維持されなければならない。イメージングのために、顕微鏡下で温度制御された環境にマウスを移動し、正しいanesために動物を監視呼吸数と足のピンチによってthesiaレベル。毎分100回の呼吸 - 60の呼吸速度を目指し、麻酔の深さを決定するために、撮像中に頻繁に動物を監視する。 </li><li>顕微鏡の接眼レンズを通して撮影部位の位置を確認します。 </li><li>動的撮像データを取得する毎に30〜60秒のzスタック画像を撮影するために2光子レーザー走査顕微鏡を調整する。 </li><li>撮像セッションが完了すると、加熱された箱から動物を削除する。 </li><li>脊髄クランプを緩め、クランプからマウスを取り外します。クランプを除去しながらも肌からアクリルを引き出します。 </li><li>マウスを再度画像化する場合には、脊髄の上に生理食塩水に浸したゼラチン圧縮スポンジを置く。手術部位の上の筋肉と皮膚を閉じます。麻酔から回復しつつ無人または他の動物の存在下で動物を放置しないでください。動物は回復後に神経障害の兆候を示している場合は、動物を安楽死されるべきである。それ以外の場合は、安楽死させるCO 2チャンバー内のマウスは、それがIACUCが承認した安楽死プロトコルに従って麻酔から出てくる前に。 </li><li>製造業者の指示に従って、画像解析ソフトを用いた蛍光画像を解析する。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

リアルタイムで病理を次の中にそれらのネイティブ組織区画における異なる細胞型の撮像相互作用が大きな関心を生成しました。 CNSの密なネットワーク内では、隣接する細胞との細胞 - 細胞接触およびシグナル伝達は、正常な機能およびCNSの病理学を理解するために不可欠である。ここでは、脊髄の機械的な病変内の細胞運動の観察のための2光子レーザー走査顕微鏡の使用を記載している。手術および組織調製物の品質に加えて、組織の機械的安定性は、成功したタイムラプス顕微鏡検査、モーションアーチファクト呼吸から脊髄の特に単離するための最も重要である。安定性は、動物の心拍数や呼吸に対応する解剖顕微鏡下で、脊髄の動きを探すことによって評価することができる。安定性は、イメージングを開始する前に、すぐにも手術を実施している間の両方を評価すべきである。アニマの場合lは調整が脊髄クランプの配置と気密になされるべきである、安定していない。骨髄キメラのアプローチと結合され、細胞型特異的な蛍光レポーターマウスモデルは、小膠細胞および軸索対単球細胞の同定を可能にしている。以前の研究では、血由来単球およびませミクログリアは、ここ43記載の方法論を用いて、外傷後の二次軸索損傷の原因であることを明らかにした。デキストラン共役容器色素は、ランドマークを提供し、血管の完全性の侵害を識別するために、両方の血管の同定を可能にする。適切な蛍光レポーターマウスモデルの選択は、所望の細胞型の適切な識別を撮像できるようにすることが重要である。 実施されて研究に適した蛍光マウスモデルの開発も実験の成功に不可欠です。 CX3CR1 + / GFPの2食細胞集団の区別</sup&gt; CNS中の細胞は、従来、困難であった。ここに示されているように、一般的な免疫学的方法、照射キメラは、骨髄由来マクロファージからの放射線耐性、CNS常駐ミクログリアを区別するために利用することができる。照射手順は、血液脳関門を損傷し、細胞の表現型を変化させる可能性があるので、このモデルの使用は慎重に考慮されるべきである。これらの変化の程度は、照射線量ならびに回復期間の長さと異なり、異なる炎症モデルへの影響は十分に研究されていない。 CNS、血液脳関門への照射の効果は、照射中に頭部を遮蔽することにより最小限に抑えることができ、これは、脊髄を直接52に遮蔽されていない場合であっても、照射後の脊髄への細胞浸潤を減少させることが示されている。ここでは、キメラの生成の結果として、定常状態でCNSへの浸潤細胞の数は麻痺とは対照的に重要でないことを観察した病変に入る細胞の小胞体。薬物誘発性キメラ52または並体結合マウスモデル53を含んで考慮すべき他の代替モデル。 ここでは、2光子顕微鏡を用いて画像に容易である脊髄の背側の白質の病変をもたらす、特定の単純かつ再現可能な小さな損傷モデルを提示している。この方法はまた、文献に相補的な固定組織解析16,18,43,48,54と連結された後柱における軸索の枯死の程度をアッセイするための定量化可能な病変を提供する。このモデルでは、動物は最小限の赤字を表示し、損傷後の特別なケアを必要としません。ここで説明背列挫傷及びイメージング技術を利用して、将来の研究は、脊髄損傷の治療の有効性を評価するための強力なスクリーニングツールとすることができる。これらの治療は、小分子阻害剤、薬物、細胞産物、組織移植片および組み合わせ治療を含むことができS。マクロファージ、ミクログリアとニューロンとの間の相互作用はまた、多発性硬化症、腫瘍、髄膜炎および筋萎縮性側索硬化症などの脊髄の他の疾患モデルにおいて役割を果たす可能性があるが、この技術は、これらの疾患の研究に有用であり得る。

中枢神経系（CNS）の疾患または傷害に対する炎症反応が不十分に特に組織内の免疫常駐細胞間の相互作用に関して、理解される。脊髄におけるこれらの細胞の相互作用の研究は、生きている動物に特に重要である。唯一簡単にアクセスCNS白質管は実現可能な実験的なアプローチを改善することに努力を集中するには、この重要な分野を作り、脊髄の背側の列にある。これらの調査に起因アクセスおよび撮像のためCNSの安定化に技術的困難に限られていた。脊髄のライブイメージングは、以前に1-13について説明したが、しかし、いくつかの研究では、最初の傷害の後に数時間を超えた脊髄損傷における細胞運動に取り組んできた。外傷性脊髄損傷は、ニューロン、アストロサイト、線維芽細胞、NG2前駆細胞、およびincludi免疫細胞と、複雑な環境である小膠細胞、好中球、マクロファージ、T細胞、B細胞および樹状細胞14,15 ng の 。マクロファージは、循環から浸潤、病変における食作用を担当する免疫細胞のサブセットである。これらの食細胞の役割は、これらの細胞が損傷組織の両方の損傷や保護の役割を取ることができることを示すレポートで、議論されてきた。これらの役割は表現型の創傷治癒に取って、負傷した動物21,23,24における機能障害を減少させることを、損傷後の二次軸索の枯死が増加し、貪食方法16-22で行動する範囲である。 これまでは、主に健康な組織における形態学に依存してきたミクログリアからマクロファージを区別しようとします。しかし、活性化ミクログリアおよびマクロファージは、同一マーカーの多くの表現とBASを研究することは困難で、これらの細胞の異なる活動の分離を行う、傷害25-29後に区別できない形態を表示するこれらの要因だけでは30日にエド。このアプローチは、インビボでこれらの細胞型を区別はあまり有用であるが、これらの細胞は、33,34、フローサイトメトリーを用いて、CD45の発現差によって分離することができる。単球はマクロファージに分化するように、これらのマーカーの発現の動的変化は、正確な分析35,36を複雑にする可能性が、小膠細胞およびマクロファージにおいてCCR2およびCX3CR1の発現差異を利用することも検討されている。ミクログリアCNSにおける居住者の免疫細胞であり、マクロファージは、骨髄前駆細胞に由来している間に、胎児の発育中に卵黄嚢前駆細胞から生じ、侮辱31,32の後に負傷したCNSを入力してください。これら2つの細胞型を区別するための形態を使用する代わりのアプローチは、CNS常駐を維持しながら、ドナー前駆細胞から由来マクロファージで追跡可能なマーカーを発現するドナー動物から前駆細胞と骨髄を置換することで、レシプロient由来ミクログリア。これらの骨髄キメラモデルは、一般的に多くの他の用途に利用されている37-40。この方法は、それによって特定の用途での使用を制限し、宿主における骨髄前駆細胞を根絶するために使用される照射または細胞毒性薬物によって引き起こされる血液脳関門の完全性の損傷に関連付けられた固有の警告を有する。最近、CNSにおける小膠細胞およびマクロファージの間の機能的な違いは、フローサイトメトリー、遺伝子チップアレイ分析及び将来において非常に有用であることが分かるであろうキメリズム方法24,26,41-44を使用して識別され始めている。これら2つの細胞型を分離することは困難なままであるが、彼らの独自の機能を理解することは、CNS内の両方ミクログリアおよびマクロファージが関与する障害のよりターゲットを絞った治療法につながるのに重要である。 脊髄病変内の細胞の相互作用の記述は、主に細胞培養モデルを含む研究から来ている。これをd生きている動物に一緒に両方の脊髄病変と免疫細胞イメージングに関わる課題へのUE。様々なタイプと重症度の脊髄損傷の現在の齧歯類モデルは挫傷モデル45,46、ピン刺し負傷2、裂傷47、ここで16,18,48で説明脊柱挫滅傷害を含む。髄膜における炎症は、損傷の重症度とともに増加し、シリアルイメージング用の窓や手術の移植のための固有の課題を提起する。これらの課題のいくつかは、食細胞の浸潤など手術部位上線維性組織の生成を含む。後柱圧壊損傷を研究するために、ここで行われているように、これらの問題のいくつかは、より小さな病変を作成し、硬膜とその後の再開放手術を可能にするための傍脊椎筋の間に非免疫原性外科ドレッシングで​​露光脊髄を覆うことによって克服することができる。スピンの画像だけ背部分に能力挫傷モデルは、主に傷害45,49の後に特に初期の時点で、多くの場合、背側の列の中で最も背側部分を温存、中央のコードに損傷を引き起こすので、アルコードはまた、傷害の選択肢を制限します。したがって、我々は、病変内および病変への軸索の位置を簡単に定量化のための細胞運動の観察の両方に便利ですきれいな、繰り返し可能な、矩形状の病変を生み出すシンプルな損傷モデルを記述する。

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 GFPマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP Hマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>マウスパイケージ</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>MPC 2 セット</td><td></td></tr><tr><td>60 mm2 ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>430166</td><td>骨髄分離用</td></tr><tr><td>ファルコン 40 &mu;m細胞フィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-1</td><td>骨髄分離用</td></tr><tr><td>1 x 15 ml および 1 x 50 ml コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>骨髄分離用</td></tr><tr><td>21 ゲージ針</td><td>BD</td><td>305177</td><td>骨髄分離用</td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>骨髄分離用</td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>骨用骨髄分離</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>骨髄分離用</td></tr><tr><td>RPMI培地</td><td>シグマ</td><td>R8758</td><td>骨髄分離用</td></tr><tr><td>F4/80抗体</td><td>エバイオサイエンス</td><td>12-4801 PE</td><td>キメラのFACS検証用</td></tr><tr><td>30ゲージインスリン注射器</td><td>BD</td><td>328280</td><td>尾静脈注射用</td></tr><tr><td>脊髄クランプ</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>オルソジェットデンタル アクリルパウダー</td><td>ラングデンタル</td><td>REF1320</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>オルソジェットデンタル アクリル液</td><td>ラングデンタルREF1404</td><td></td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>ゲルフォームゼラチンスポンジ</td><td>ファイザー</td><td>9034201</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>4-0 エチロン縫合糸</td><td>エチロン</td><td>1667G</td><td>手術用</td></tr><tr><td>反射クリップ、7 mm</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>INS750344</td><td>手術用。使用前に滅菌してください</td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-09</td><td>手術用</td></tr><tr><td>45/5 鉗子、デュモクセル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td>手術用</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16021-14</td><td>手術用</td></tr><tr><td>30ゲージ針</td><td>BD</td><td>305106</td> 硬膜鉗子の<td>アクセス穴を作るため</td></tr><tr><td>デュモン #4 生物学のヒント</td><td>デュモン</td><td>11242-40</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ニードルドライバー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12002-12</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ミシェル創傷クリップ鉗子</td><td>ケント科学</td><td>INS700753</td><td>手術用</td></tr><tr><td>創傷クリップリムーバー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12033-00</td><td>手術用</td></tr><tr><td>鉗子用Oリング</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11200-00</td><td>手術用、多くの場合、#4 鉗子が付属し、別途注文する</td></tr><tr><td>手術用コードレス充電式アニマルトリマー</td><td>ウォール</td><td>シリーズ8900</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ベタジン溶液(10%プロビジン-ヨウ素局所溶液)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ナイール脱毛ローション</td><td>教会&用ドワイト株式会社</td><td>NRSL-22329-05</td><td>手術用</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バトラー シャイン</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>薬 &ndash; 手術用</td></tr><tr><td>マーカイン</td><td>ヘンリー シャイン</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>薬 &ndash; 手術用 1.0 mg/kg 皮下投与</td></tr><tr><td>ブペルネックス</td><td>ヘンリー シャイン</td><td>121-7793</td><td>薬 &ndash; 手術用 ブプレノルフィン 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>シグマ</td><td>からの化学物質119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM グルコース</td><td>手術用 コールドスプリングハーバープロトコルから</td></tr><tr><td>TRITC-デキストラン 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>血管系標識の静脈内投与用</td></tr></tbody></table>

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

外傷性脊髄損傷は、血液由来のマクロファージと中枢神経系(CNS)に常在するミクログリアを含む炎症反応を引き起こします。生体内2光子顕微鏡法は、生きている動物の脊髄病変におけるマクロファージとミクログリアの研究を可能にします。これは、背柱に外傷性損傷を負った成体動物で行うことができます。ここでは、中枢神経系のマクロファージとミクログリアを区別する方法について、骨髄キメラを照射して、マクロファージまたはミクログリアのみが遺伝的にコードされた緑色蛍光タンパク質で標識された動物を得る方法について説明します。 また、脊髄の背柱を粉砕し、それによって、椎弓切除術を通じて動物で容易に視覚化できる、単純でアクセスしやすい長方形の病変を生成する損傷モデルについても説明します。 さらに、損傷後の最初の数日から数週間の細胞相互作用の研究のために、損傷の解剖学的部位で動物を順番に画像化する手順を概説します。

後柱圧壊病変を示す模式図を図1Aに示されている。病変した後、動物は、脊髄クランプ（ 図1B）を使用して、生体内顕微鏡検査のために調製し、安定化される。後柱圧壊損傷直後に撮影した画像は明らかに識別可能な鉗子タイン挿入ポイントとはっきりと見える長方形の病変を示しています。損傷部位での軸索は全体の脊柱（ 図1C）のスパン間で切断されている。血管の完全性が無傷のままであり、容器の色素漏出の証拠は、蛍光によって検出されなかった。週間にわたって同じ病変の連続撮影を行うためには、筋肉と皮膚をその後の再暴露の椎弓切除を介して縫合することができる。同様の病変の形態は、後の時点（ 図1D、E）で見られる。 5日損傷後、鉗子挿入部位は、まだ表示されますが、病変がサイズdに増加し始めている炎症によって引き起こされる二次的損傷のUE。病変の尾末尾の軸索は「軸索の枯死」と呼ばれるプロセスを経由して傷害の初期のサイトから後退している。病変の吻側端の軸索はウォーラーのような変性（ 図1D、E）を示した。 5日目および損傷後22との間に、病変の大きさが安定している。 図1に示すように、これらの細胞（マクロファージに対するミクログリア）の同一性は、製剤中に区別することはできないが、同時に、CX3CR1 +細胞の大流入、およびこれらの時点の間に圧壊病変周囲に浸潤することが分かる。 クラッシュ病変の微小環境内ミクログリアおよびマクロファージの挙動を区別するために、放射線キメラモデル（ 図2Aに概説）を用いた。まず、CX3CR1 + / GFPマウスの骨髄前駆細胞は非蛍光ドナーセルに置き換えられLS、こうしてのみGFP + CNS常駐ミクログリアは、蛍光イメージングによって表示されます。骨髄再構成の効率は、8週間の骨髄移植（ 図2B、C）後の末梢血のフローサイトメトリー試験により確認することができる。 図2B、F4 / 80およびGFP陽性マクロファージでは、青で強調表示、その中でいくつかのGFP陰性であるが、F4 / 80陽性単球も存在する、CX3CR1 + / GFP→C57BL / 6キメラマウスで検出されている。 図2Cは 、無重陽性F4 / 80及びGFP陽性細胞は、野生型骨髄を有するCX3CR1 + / GFPレシピエントの骨髄の交換後に残される。怪我する前に、ミクログリアは均等に休息、分枝形態（ 図2D）を表示する、脊髄内に分布している。 8日後、損傷後、わずかミクログリアは、病変内および周囲に検出することができる。これらのミクログリアはアメーバ状の形態（ 図2E）を表示。第二に、骨非蛍光性マウスにおける骨髄前駆細胞は、従って、GFP蛍光（ 図2A）によって可視骨髄由来CX3CR1 +単球/マクロファージのレンダリング、CX3CR1 + / GFPマウスからの骨髄細胞によって置換される。怪我する前に、検出された唯一のGFP +細胞は骨髄が誘導されると報告され、継続的に定期的に28（ 図2F）に裏返しされている、主に血管周囲のです。圧潰損傷後、CX3CR1 + / GFP細胞が病変（ 図2H-J）を囲む血管の内側に沿って見ることができ、病変中心はCX3CR1 + / GFPマクロファージ （ 図2G）の浸潤が充填されている。 後柱のタイムラプスイメージングは​​、最大6時間行うことができる。 図3に、我々はすぐに、循環からの細胞を見ることが可能な損傷後の非キメラCX3CR1 + / GFPマウスを示すn個の病変コアに向けて血管の外に移動すると、損傷部位（ 図3A、B;補足作品1）内で移動する。マクロファージ（; 補足映画1、図3A、B）で撮影した経路を追跡することができる細胞を同定するために蛍光強度を利用した画像解析。画像解析から得られた統計は、病変におけるマクロファージの平均運動性は3.6ミクロン/分（ 図3D）であることを示している。けが、軸索、ミクログリアおよびマクロファージの後、22日がまだイメージングの領域を実証し、病変内で検出することが可能で最後に、時間（ 補足動画2）長期間にわたって安定している。 <img alt="図1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600"> 図1：作成と背側の列挫滅損傷の連続イメージング。 （A）背カラム挫傷、関心のレベルで脊椎の背側プロセスを除去することによって行われる。鉗子を1mm離れた脊髄の脊柱に挿入された後に紫色に示す病変を生成するために3回を閉じている。（B）次いで、動物を脊髄に位置している生体内イメージングのための安定性を得るためにクランプする。（C）直ちに損傷後、鉗子挿入部位（赤楕円形）と長方形挫滅傷害ボリューム（グレーのボックス）が明確に識別することができます。背側根の軸索は（白矢印）、ならびに病変（黒矢印の頭）の尾側の軸索負傷端を見ることができる。（D）5日損傷後、鉗子挿入部位（赤い円）、病変（グレーのボックス）の程度は、依然として容易に可視化することができる。病変は最初の傷害以来、サイズが増加している。ウォーラーのような変性を受けた軸索は、additiの病変（オープン矢頭）へ吻側見ることができます後根（白矢印）と負傷した軸索の先端（白矢印）。（E）22日損傷後における軸索の上、病変部位は、まだ5日後に傷害に同様の寸法と識別可能である。損傷部位とその周辺のCX3CR1 +細胞を大量に注意してください。標識された特徴は、（D）と同じである。 =200μmのすべてのスケールバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600"> 図2：キメラマウスの構築後柱圧壊病変におけるCNS常駐ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージに発現CX3CR1 + / GFPを追跡する。 （A）CX3CR1 + / GFPのいずれかがマイルを発現するキメラマウスの生成の模式図crogliaまたはマクロファージ。まず、のThy-1 YFP Hマウスが照射され、骨髄マクロファージがGFP +であるキメラマウスに生じる、CX3CR1 + / GFPマウスから単離した骨髄細胞で再構成されている。第二に、Thyの-1 YFP H / CX3CR1 + / GFPマウスが照射されると、骨髄が、そのミクログリアGFP +であるキメラマウスを産生する、非蛍光性のマウスから単離した骨髄細胞で再構成されている。（B）フローサイトメトリーデータの例照射されたC57BL / 6レシピエントに移植CX3CR1 + / GFP骨髄ドナーとのキメラ動物から血液中のF4 / 80 +とCX3CR1 GFP +細胞と。 C57BL6とキメラ動物におけるF4 / 80 +とCX3CR1 GFP +細胞を用いたフローサイトメトリーデータの青いエリアをハイライト表示の両方でGFPおよびF4 / 80陽性であるCX3CR1陽性ドナー由来の細胞を示している。（C）例ドナー骨髄は、IRに移植するCX3CR1 + / GFP受信者を放射。二重陽性CX3CR1 + / GFPの欠如に注意して、青色の内のF4 / 80細胞は地域性を強調した。（D）最初のキメラスキームからのマウスの生体2光子顕微鏡的スナップショット、背側内枝状形態を有するGFP +ミクログリアを示すコラム（矢じり）。これらの細胞は、後根と背側の列の軸索（黄色）の間に散在している。スケールバー=100μmである。（E）で同じマウスの生体内イメージング（B）8日後柱損傷はプロセス（矢頭）を欠いている大規模でアメーバ状の細胞体を持つ少数のCX3CR1 +ミクログリアを明らかにした後。 = 100ミクロンスケールバー。（A）における第二のキメラのスキームからのマウスの（F）スナップショット、CNS実質内、わずかなGFP +マクロファージを示した。脊柱損傷はアルを明らかに=100μmのスケールバー。（G）（F）で同じマウスの生体内イメージング8日後病変とその周辺のマクロファージのARGE流入。スケールバー=100μmである。（H）無傷の動物における血管に接触したCX3CR1 +血液由来細胞の高倍率写真。スケールバー=30μmである。血管の内側から見た容器と接触するCX3CR1細胞（I）A再建。スケールバー= 30ミクロン。（J）容器と接触するCX3CR1細胞の再構築、血管の外側から見た。スケールバー=20μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600"> 図3 :.すぐに後柱圧壊後の非キメラCX3CR1 + / GFPマウスにおける代表的な細胞追跡データけが。 （A）はすぐに後柱圧壊損傷後CX3CR1 +ミクログリアと補足作品1からのマクロファージの周りに損傷を受けた軸索（黄色）のスナップショット。（B）（グレー）のパス（A）にCX3CR1 +細胞が撮影した110の間に分生体内イメージングセッション（C）（B）内のトラックの時間符号化表現。タイムバーに示すようにトラックは、全体の110分の映画以内にその時間に基づいて着色されている。CX3CR1 +細胞の全体的な運動性の（D）ヒストグラム。すべてのスケールバーは30μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ムービー1：すぐにダブルヘテロ接合体における脊柱挫滅損傷後の代表生体映画のThy-1 YFP / + <st cx3cr1>GFP / +マウス。生体内脊椎イメージングはT11レベルでの脊柱挫滅損傷後すぐに実施された。右側のパネルには、CX3CR1 +ミクログリアおよびマクロファージの動きを示している。細胞運動の経路は、左パネルの白いトラックとして示されている。損傷は、左上隅に位置しています。 CX3CR1 +細胞は、これらのトラックに沿って損傷部位に移動することが分かる。軸索は黄色で示されている。 =40μmのスケールバー。合計時間：110分。再生速度：300X。 </st> 補足ムービー2：ダブルヘテロ接合体のThy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / +マウスにおける背側の列圧壊病変後の22日目での代表生体映画ここに示されているが、22日、最初の後柱圧壊後にマウスで撮影代表映画です脊髄レベルのT11で損傷。 INJユリィは、フレームの右上にあります。軸索（黄色）上昇が吻側右下に表示されます。背静脈血管がTRITCデキストラン（赤）で標識される。すぐに損傷後のものと比較して低速で病変の移動中に、CX3CR1 +細胞。 =50μmのスケールバー。合計時間：90分。再生速度：600X。

二光子生体内イメージングは、背柱外傷性脊髄挫傷を負った骨髄キメラ動物の天然組織環境における脊髄の異なる細胞タイプ間の相互作用を調査するために使用することができます。

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

この手順の全体的な目標は、損傷した脊髄内のミクログリア、単球、およびその他の細胞タイプ間の動きと相互作用を観察することです。これは、まず、蛍光マーカーで標識された常在性ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージのいずれかを持つ骨髄キメラマウスを作成することによって達成されます。2番目のステップは、脊髄に背柱挫傷を生じさせることです。その後、動物を再開し、脊髄を安定させます 多光子イメージングの場合、最後のステップは、病変内の単一画像またはタイムラプスムービーを撮影することです。最終的に、画像解析により、細胞の動きと周囲の基質との細胞の相互作用が示されています。この技術が従来の技術(細胞培養や固定組織など)と比較した場合の主な利点は、細胞を生きた動物の自然な複雑な環境でイメージングできることです。この手術には、キメラまたはダブルトランスジェニック動物を使用します。麻酔を誘発した後に常在細胞または骨髄由来細胞を標識する方法については、テキストプロトコルを参照してください。1〜2%ISOフッ素で維持し、1分間に約60〜100回の呼吸数を実現します。次に、目の軟膏を塗布し、つま先をつまんで麻酔の手術面を確認します。手術の準備として、まず目的の脊髄部分を剃り、次にポビドンヨードと70%アルコールスクラブで皮膚をきれいに拭き、動物をドレープして手術部位にアクセスするための穴を開けます。次に、オートクレーブツールを滅菌ドレープにレイアウトします。これには、尖叉の間に1ミリメートルに固定され、先端から1ミリメートルのマークがある番号4の鉗子が含まれます。今、虹彩はさみを使用して正中線で皮膚を開き、筋肉組織を露出させることができます。解剖顕微鏡で手術を進めます。正中線に沿って、背側の脊柱突起に付着する背中の筋肉を切断し、脊柱を露出させることを目標とします。これには、広背筋の僧帽筋と靭帯を切断することが含まれます。次に、横突起と背側突起の間の回旋筋を切除して、除去の対象となる特定の椎骨の椎弓板を明らかにします。ここでは T 10 が露出しています。プロセスの上下のスペースにRO陪審員のヒントを挿入して続行します。次に、少し持ち上げて、先端がしっかりと固定され、深すぎないことを確認します。次に、RO陪審員を閉じて椎弓板を取り外します。次に、残りの椎骨の小さな部分をすべて取り除き、開口部を拡大します。30ゲージの針を使用して、硬膜に1ミリメートル間隔で2つの穴を開けて、固定鉗子のアクセスポイントを作ります。次に、固定鉗子を硬膜を通して90度の角度で挿入し、硬膜の上の尖叉のマークを保持します。次に、鉗子を10秒間ピンチクローズします。10秒間のスクイーズをさらに2回行い、鉗子を取り外します。次に、吸収性ゼラチン、圧縮スポンジを生理食塩水に浸し、損傷部位を覆います。ゼラチンスポンジの上で筋肉を閉じます 4番の合成非ナイロンランニング縫合糸。次に、5mmの巻き付きクリップを使用して皮膚を固定します。1キログラムあたり1ミリグラムの生理食塩水490マイクロリットルに10マイクロリットルのブピバカインを皮下注射して手順を完了します。次に、5マイクロリットルのブプレノルフィンを1キログラムあたり100マイクログラムで臀筋に注入します。術後。動物を温め、意識を取り戻すまで監視します。イメージングのために動物を再開するには、以前と同様に麻酔を誘発し、その後、製造元と指示に従って創傷クリップを取り外します。必要に応じて、切開部の周辺に脱毛剤を塗布します。今回は、ポビドンヨードと70%アルコールで追加のスクラブを適用します。次に、前の切開部に沿って皮膚を再度開きます。残りの縫合糸を取り外し、必要に応じてハサミを使用して鉗子で筋肉を開きます。解剖顕微鏡下で、はさみを使用して、椎骨の横突起に沿って、椎弓切除術の1つ上と椎弓切除の1レベル下に脊髄クランプ用のポケットを作ります。脊髄スタビライザーのクランプを各椎骨の周りに挿入し、クランプを締めます。脊髄がイメージングプラットフォームと平行になり、組織が安定するようにクランプを調整します。呼吸のアーチファクトが見られる場合は、clを調整しますamps動きを最小限に抑えます。次に、クランプとパラフォームを覆います。次に、鉗子を使用してジェルフォームを繊細に取り除きます。できるだけ取り除きます。また、髄膜の上にある厚い瘢痕組織が存在する場合は、すべて取り除きます。すべてのジェルフォームを取り除いたら、脊髄を生理食塩水で覆います。出血が認められた場合は、ゼラチンスポンジを使用して出血を止めます。必要に応じて、焼灼中に焼灼を使用してください。脊髄に触れないように注意し、生理食塩水とジェルフォームで覆ってください。次に、浸漬液を保持するための井戸を作成し、シアノアクリレート接着剤で皮膚と組織を密封します。次に、2つのクランプの間に歯科用アクリルのウェルを構築します。井戸が硬化するのを待ちます。硬化したら、ウェルに人工CSFを充填します。これらのステップ中は、出血を監視し続けます。この時点で、オプションで蛍光ベッセルダイを尾静脈に注入します。イメージング中に血管を強調表示するには、70キロダルトン以上の蛍光DExT鎖または蛍光標識レクチンを使用します。イメージング中は、制御された環境でマウスを摂氏37度に保ちます 顕微鏡の段階では、準備を成功させるための最も重要なステップは、脊髄がきれいで、出血していないこと、および目に見える呼吸アーチファクトがないことを確認することです。イメージング中に定期的に、動物の呼吸を監視して麻酔のレベルを確認してください(毎分60〜100回の呼吸が必要です)。ISOフッ素レベルを調整して麻酔を矯正します。イメージング後、動物をそこで手術部位に戻し、脊椎クランプを取り外し、アクリルを皮膚から引き抜きます。その後、マウスは、最初の手術の終了時に、後で画像化するために閉じるか、損傷の5日後に安楽死させることができます。鉗子の挿入部位はまだ見えますが、炎症による二次損傷により病変のサイズが大きくなり始めています。病変の共同端にある軸索は、損傷の最初の部位から後退しています。同時に、CXの3つのC1陽性細胞の大規模な流入は、ミクログリアまたはマクロファージのいずれかが、病変微小環境内のこれらの細胞の挙動を識別するために、クラッシュ病変内および周囲に浸潤しているのを見ることができ、放射線キメラモデルを最初に使用した。CX three CR one 陽性の GFP マウスの骨髄前駆細胞を非蛍光ドナー細胞に置換したため、GFP 陽性の中枢神経系常在性ミクログリアのみが見えるようになりました。次に、非蛍光マウスの骨髄前駆細胞をCX 3 CR1陽性GFPマウスの骨髄細胞に置換して、骨髄由来細胞を観察した。損傷前に検出された骨髄由来のGFP陽性細胞は、主に傍血管であり、挫傷後に骨髄から絶えず置換されることが報告されています。CX three C one positive GFP細胞は、病変を囲む血管の内側に沿って増加します。さらに、病変中心は浸潤したCX 3 CR1陽性GFPマクロファージで満たされていました。この技術を使用すると、さまざまなトランスジェニック動物を使用して、他の蛍光細胞集団を標識し、脊髄内および他の疾患モデルの両方での相互作用を同定できます。

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Research

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Neuroscience

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