マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

この手順の全体的な目標は、損傷した脊髄内のミクログリア、単球、およびその他の細胞タイプ間の動きと相互作用を観察することです。これは、まず、蛍光マーカーで標識された常在性ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージのいずれかを持つ骨髄キメラマウスを作成することによって達成されます。2番目のステップは、脊髄に背柱挫傷を生じさせることです。

その後、動物を再開し、脊髄を安定させます 多光子イメージングの場合、最後のステップは、病変内の単一画像またはタイムラプスムービーを撮影することです。最終的に、画像解析により、細胞の動きと周囲の基質との細胞の相互作用が示されています。この技術が従来の技術(細胞培養や固定組織など)と比較した場合の主な利点は、細胞を生きた動物の自然な複雑な環境でイメージングできることです。

この手術には、キメラまたはダブルトランスジェニック動物を使用します。麻酔を誘発した後に常在細胞または骨髄由来細胞を標識する方法については、テキストプロトコルを参照してください。1〜2%ISOフッ素で維持し、1分間に約60〜100回の呼吸数を実現します。次に、目の軟膏を塗布し、つま先をつまんで麻酔の手術面を確認します。

手術の準備として、まず目的の脊髄部分を剃り、次にポビドンヨードと70%アルコールスクラブで皮膚をきれいに拭き、動物をドレープして手術部位にアクセスするための穴を開けます。次に、オートクレーブツールを滅菌ドレープにレイアウトします。これには、尖叉の間に1ミリメートルに固定され、先端から1ミリメートルのマークがある番号4の鉗子が含まれます。

今、虹彩はさみを使用して正中線で皮膚を開き、筋肉組織を露出させることができます。解剖顕微鏡で手術を進めます。正中線に沿って、背側の脊柱突起に付着する背中の筋肉を切断し、脊柱を露出させることを目標とします。

これには、広背筋の僧帽筋と靭帯を切断することが含まれます。次に、横突起と背側突起の間の回旋筋を切除して、除去の対象となる特定の椎骨の椎弓板を明らかにします。ここでは T 10 が露出しています。

プロセスの上下のスペースにRO陪審員のヒントを挿入して続行します。次に、少し持ち上げて、先端がしっかりと固定され、深すぎないことを確認します。次に、RO陪審員を閉じて椎弓板を取り外します。

次に、残りの椎骨の小さな部分をすべて取り除き、開口部を拡大します。30ゲージの針を使用して、硬膜に1ミリメートル間隔で2つの穴を開けて、固定鉗子のアクセスポイントを作ります。次に、固定鉗子を硬膜を通して90度の角度で挿入し、硬膜の上の尖叉のマークを保持します。

次に、鉗子を10秒間ピンチクローズします。10秒間のスクイーズをさらに2回行い、鉗子を取り外します。次に、吸収性ゼラチン、圧縮スポンジを生理食塩水に浸し、損傷部位を覆います。

ゼラチンスポンジの上で筋肉を閉じます 4番の合成非ナイロンランニング縫合糸。次に、5mmの巻き付きクリップを使用して皮膚を固定します。1キログラムあたり1ミリグラムの生理食塩水490マイクロリットルに10マイクロリットルのブピバカインを皮下注射して手順を完了します。

次に、5マイクロリットルのブプレノルフィンを1キログラムあたり100マイクログラムで臀筋に注入します。術後。動物を温め、意識を取り戻すまで監視します。イメージングのために動物を再開するには、以前と同様に麻酔を誘発し、その後、製造元と指示に従って創傷クリップを取り外します。

必要に応じて、切開部の周辺に脱毛剤を塗布します。今回は、ポビドンヨードと70%アルコールで追加のスクラブを適用します。次に、前の切開部に沿って皮膚を再度開きます。

残りの縫合糸を取り外し、必要に応じてハサミを使用して鉗子で筋肉を開きます。解剖顕微鏡下で、はさみを使用して、椎骨の横突起に沿って、椎弓切除術の1つ上と椎弓切除の1レベル下に脊髄クランプ用のポケットを作ります。脊髄スタビライザーのクランプを各椎骨の周りに挿入し、クランプを締めます。

脊髄がイメージングプラットフォームと平行になり、組織が安定するようにクランプを調整します。呼吸のアーチファクトが見られる場合は、clを調整しますamps動きを最小限に抑えます。次に、クランプとパラフォームを覆います。

次に、鉗子を使用してジェルフォームを繊細に取り除きます。できるだけ取り除きます。また、髄膜の上にある厚い瘢痕組織が存在する場合は、すべて取り除きます。

すべてのジェルフォームを取り除いたら、脊髄を生理食塩水で覆います。出血が認められた場合は、ゼラチンスポンジを使用して出血を止めます。必要に応じて、焼灼中に焼灼を使用してください。

脊髄に触れないように注意し、生理食塩水とジェルフォームで覆ってください。次に、浸漬液を保持するための井戸を作成し、シアノアクリレート接着剤で皮膚と組織を密封します。次に、2つのクランプの間に歯科用アクリルのウェルを構築します。

井戸が硬化するのを待ちます。硬化したら、ウェルに人工CSFを充填します。これらのステップ中は、出血を監視し続けます。

この時点で、オプションで蛍光ベッセルダイを尾静脈に注入します。イメージング中に血管を強調表示するには、70キロダルトン以上の蛍光DExT鎖または蛍光標識レクチンを使用します。イメージング中は、制御された環境でマウスを摂氏37度に保ちます 顕微鏡の段階では、準備を成功させるための最も重要なステップは、脊髄がきれいで、出血していないこと、および目に見える呼吸アーチファクトがないことを確認することです。

イメージング中に定期的に、動物の呼吸を監視して麻酔のレベルを確認してください(毎分60〜100回の呼吸が必要です)。ISOフッ素レベルを調整して麻酔を矯正します。イメージング後、動物をそこで手術部位に戻し、脊椎クランプを取り外し、アクリルを皮膚から引き抜きます。

その後、マウスは、最初の手術の終了時に、後で画像化するために閉じるか、損傷の5日後に安楽死させることができます。鉗子の挿入部位はまだ見えますが、炎症による二次損傷により病変のサイズが大きくなり始めています。病変の共同端にある軸索は、損傷の最初の部位から後退しています。

同時に、CXの3つのC1陽性細胞の大規模な流入は、ミクログリアまたはマクロファージのいずれかが、病変微小環境内のこれらの細胞の挙動を識別するために、クラッシュ病変内および周囲に浸潤しているのを見ることができ、放射線キメラモデルを最初に使用した。CX three CR one 陽性の GFP マウスの骨髄前駆細胞を非蛍光ドナー細胞に置換したため、GFP 陽性の中枢神経系常在性ミクログリアのみが見えるようになりました。次に、非蛍光マウスの骨髄前駆細胞をCX 3 CR1陽性GFPマウスの骨髄細胞に置換して、骨髄由来細胞を観察した。

損傷前に検出された骨髄由来のGFP陽性細胞は、主に傍血管であり、挫傷後に骨髄から絶えず置換されることが報告されています。CX three C one positive GFP細胞は、病変を囲む血管の内側に沿って増加します。さらに、病変中心は浸潤したCX 3 CR1陽性GFPマクロファージで満たされていました。

この技術を使用すると、さまざまなトランスジェニック動物を使用して、他の蛍光細胞集団を標識し、脊髄内および他の疾患モデルの両方での相互作用を同定できます。