Name: 生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぼう、DHFR-PCAを用いた生細胞内タンパク質間相互作用のゲノムワイドスクリーニング法。高密度コロニーアレイと酵母適性アッセイで、タンパク質複合体の相互作用を定量的に解析し、疾患治療標的の探索に応用できます。

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この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）のカナダの研究所によってサポートされていました自然科学とカナダのディスカバリーの助成金とCRLへのヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムの助成金の工学研究評議会、191597、299432と324265を付与します。 CRLはCIHR新しい研究者である。ギヨームディスはテオのフェローシップでサポートされています。サミュエル·ロシェットはNSERCとFRQNTフェローシップでサポートされています。

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我々は、高スループットでの任意のベイトタンパク質のための物理的な相互作用因子の系統的な同定を可能にするDHFR-PCAアッセイに基づくプロトコルを記載している。このプロトコルは、より多くの餌をスクリーニングすることによって適合され、この複製の任意の所望のレベルにすることができる。 Nup82：私たちは、核膜孔複合体に関与ベイトタンパク質のための物理的な相互作用パートナーの同定により、このプロトコルの信頼性を実証する。我々の分析は、酵母タンパク質のインタラクトームを研究する方法の能力を強調し、5以前に報告されたインターアクターと1以前に報告されていない相互作用因子（ 図3F＆3G）を見つけることができました。 ここで説明するプロトコルは、実験者が注意を払う必要があります先のいくつかの重要なステップを含む。私たちは、餌DHFR Fは[1,2]融合が（ 図1B）が正しいことを確認してください）1にお勧めします。これは、建設およびmeasurを配列決定することによって達成することができる抗DHFR F [1,2]または抗DHFR F [3]抗体を用いて、適切なタンパク質発現をる。 2）画面を開始する前に、それが関心のある任意の餌は、PCAの画面で無差別な相互作用を発揮するかどうかを確認することをお勧めします。これは、適切なL-DHFR制御または手動で適切なL-DHFRコントロールで餌を交配し、MTXの培地中での増殖アッセイを実行することによって交差餌とコントロール画面を実行することによって行うことができる。水分が印刷プロセス中に寒天表面上の細胞接着のために最適であるように、それらが使用される前に3）プレート日注がれるべきである。 4）ソースプレートは、先プレートに十分な細胞を転送するための4倍以上を使用すべきではない。目的プレートのコピー数の増加は、膨張の連続工程（ - &gt; 16コピー- &gt; 64コピー、例えば 4コピー）することによって行うことができる。あるいは、細胞は、芝生または複製の異なるラウンド間コロニーの異なる位置に撮像す​​ることができる。 5）もし、いくつかのpositionsは二倍体の選択（複数可）の後に不足している、ソースプレートは（4.5〜4.7ステップ）嵌合段階で何度も使用されなかったことを確認してください。 6）MTX媒体は右の濃度ですべての必須成分が含まれていることを確認。全く成長がMTX培地上で観察されていない場合には相互作用は、目的のタンパク質についてPCAによって検出されないため、またはMTX媒体が適切に準備されなかったため、実際には、のいずれかであり得る。媒体はDHFRが相補性断片を示す株の増殖を可能にすることを保証するために、構成的な相互作用は、コレクションの空の位置に追加され、そのようなロイシンジッパー部分33（ 図1C）に融合DHFR断片陽性対照として使用することができる。リンカ-DHFR断片またはジッパー - リンカー - DHFR断片を用いた並列テストがDESCRとして、偽陽性の相互作用をする傾向があるすべての細胞が成長することを可能にする条件（低MTX濃度またはベイトタンパク質を区別できるようになります全ての株（培地中に欠けているMTX濃度が高すぎるか、または本質的な成分）の増殖を防止するための条件は、以下アイベッド）;および例えば、ピンツールは、複製ラウンドおよび/または最後の水との間で適切に滅菌されていない、場合7）PCAを別の媒体から複製の連続ラウンドを介して行われることを考えると、異なるプレート間の株の間で交差汚染が発生することが滅菌手順のバス（ すなわちウェットステーション）は、前回の複製ラウンドのコロニーによって汚染されている。アレイ上のいくつかの位置は空であり、従って、全く成長が交差汚染を検出するために観察されないはずである制御位置として使用することができる。 画像解析は、いくつかの公開されたソフトウェア（プロトコルのセクション5を参照）、または任意のカスタムスクリプトを使用して行うことができる。本研究では、カスタムスクリプトは、次の手順を実行します。1）スクリプトが共存するために、各プレートの値をピクセルに空のプレートの画素値を減算し、照明バイアスを修正してください。 2）スクリプトがエッジコロニー上の矩形を重ねることによって決定された各プレートの各1536位置については、）10. 3の画素値のしきい値を使用してバイナリに各バックグラウンド補正画像に変換し、スクリプトはImageJのが「粒子を分析し実行します...円形の選択で」機能。円形の選択は、2つの位置の±10画素間の間隔に等しい半径が設定される。 4）スクリプトは、選択範囲の中心から最も近い粒子を選択し、その場所が離れて選択範囲の中心から2コロニー間の半分以上の間隔でない場合は植民地としてそれを確認する。 5）スクリプトは、バックグラウンド補正画像上の選択された粒子の画素値を測定する。 6）さらに、残りの背景照明の偏りを修正するには、スクリプトがコロニーの画素値に対する粒子の一部ではない円形選択からすべての画素の平均値を減算する。これらの補正画素値の和補足表1の欄「IntDenBackSub」に格納されているのは、コロニーの大きさの尺度として使用される。 解析部内の重要なステップは、有意性の閾値の選択である。ここでは、負のL-DHFR F [3]のコントロールの分布に基づいて閾値を選択したが、画面の目的に応じて、そのような閾値は、厳しすぎるかもしれない。相補的な断片は、自然発生的に互いに補完してもよく、これらは、このようにほとんどのタンパク質の発現を代表するものではないことを確かに、L-DHFR F [3]コントロールが過剰発現される（強いTEFプロモーター）など。これは、L-DHFR Fの分布は、[3]のコントロールは、バックグラウンド増殖（図3D）の平均値よりも高いという事実によって強調される。したがって、バックグラウンド増殖分布の外側に明確に定められているいくつかのこの厳しい閾値を下回るスコアを有する相互作用が、は、例えば、一過性または弱間を表すことが、推定ヒットとして考えることができるアクション。例えば、二つのタンパク質をL-DHFRのコントロールのようなDHFR断片の自発的な相補性を可能にすることができるレベルで発現されていない、場合は、これらをさらに研究し、クロス検証できます。別の方法として、1は偽陽性上の真陽性の割合を最大化するために、バイオグリッド35のようなデータベースで報告された物理的な相互作用因子との重複の割合に基づいて、有意性の閾値を設定することができます。例えば、既知の物理的な相互作用物質の数が十分に高くない場合は、L-DHFR分布の使用とは異なり、この代替は必ずしも可能でないかもしれません。また、有意な閾値の選択は、最終的なデータセットで偽陽性と偽陰性の割合に影響を与える。前述のように、例えば、タンパク質が非常に豊富である場合には確かに、他のPPI検出アッセイのように、偽陽性がDHFR融合タンパク質とのタンパク質の非特異的相互作用から生じ得る。このいくつかのプレイ体系PCA画面内のすべてのベイトタンパク質と相互作用し、従って、分析11（ 例えば、TEF2とAde17及び補足表2）から除去する必要があるという事実が挙げられる。 （[3] F [1,2]またはF）自発的なDHFRを呈する餌と獲物を識別するために、この問題は、適切なL-DHFRコントロールに対して2コレクションの制御PCA画面を回避するには、相補性は、特定の条件で行うことができ断片各画面の。与えられた餌の機能が分かっている場合、また、遺伝子オントロジー濃縮解析を行うことは、データの信頼性を高めることができる。一方、DHFR-PCAは、いくつかの理由のために偽陰性を生じさせることができる：1）全てのタンパク質は、これらのタンパク質を不安定化させる場合、または、例えば、それらの局在を変更することができるようにDHFR断片に融合させることができない、とDHFR融合C末端は、局在化シグナルと干渉する。いくつかの細胞区画メートルで2）DHFR再構成例えば、葉酸合成に必須の前駆体が利用できない場合などのy葉酸を生成しない。 DHFR相補11を発生するための8nmの距離内にあるように3）C末端の必要性。それらのC末端は、空間に十分近くに配置されていないこのように、よく知られた相互作用が検出されないことがある。これは、間接的であるほとんどがデータベースに報告Nup82物理的相互作用の大部分は、我々のアッセイでは検出されなかったという事実によってここで例示されている。同様に、C末端が膜に対してトランスであるための膜タンパク質間の相互作用は、DHFRにはつながらない相補性を断片化し、11が検出されることはありません。制限は、1）と3）は、タンパク質のN末端にDHFR断片を融合することにより、比較的簡単に回避することができる。そうするC末端の近くに局在化シグナルを妨害することが防止でき、NおよびC末端のシス相対している膜タンパク質の間の相互作用を検出することを可能にする膜へ。 いくつかの課題は、（2,3で検討）ピンの調査に残る。これまでに製造されたPINのマップは、主にそれぞれの種のための単一の実験条件に記載されて、したがって、タンパク質ネットワークが組織されることがありますどのように単一のスナップショットを提供しています。開発または以下の突然変異を横切って、PINが環境の変化に応じて再編成することができる方法を特定の刺激を見るために、他の実験条件の探索が必要とされている。これらの課題は、生細胞中で、彼らは研究室の大きなコミュニティによって使用できるように現在の技術を適合させることにより、リアルタイムでのPPIを問い合わせるための新しい技術の開発によって克服される。 DHFR相補複合体27の量の変化を検出することができる定量的な技術として、DHFR-PCAは、これらの課題を克服するために適合させることができるとのPPIは、DNA損傷剤22によってどのように影響されるかを研究するために使用されている</sup&gt;、化学剤25、遺伝子欠失23,26または他の酵母種およびそれらの混成33。これらの新しい次元を探るPINの動的を明らかにすることがますます重要になるであろう。

タンパク質相互作用ネットワーク（ピン）は、タンパク質が機能的にセル1に編成されている方法の低解像度マップを提供します。各物理的な2つのタンパク質間の接続、またはタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）は、そのようなタンパク質複合体の中に見られるように、時間的に安定して関連付けを表すことができ、それは細胞の構造的組織化に寄与する。これらの接続には、活性、安定性、局在化および2のパートナーの相互作用を調節する過渡関連を表すことができる。与えられたタンパク質の物理的相互作用パートナーを識別すること、したがってそのタンパク質2,3の機能と規制に関する豊富な情報を提供しています。これらの理由から、大きな努力が大腸菌 4-6、 シロイヌナズナ7、サッカロマイセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）8-12、キイロショウジョウバエ&lt;などのモデル生物でのPINのマッピングに向けて置かれている/ em&gt;の13、線虫は、14と15 サピエンスホモエレガンス 。これらの研究は、タンパク質が細胞内で編成されているかを重要な洞察および未知の機能を有するタンパク質上のため、重要な情報を提供してきた。 いくつかの戦略は、ピンを研究するために長年にわたって開発されてきた。これらの技術は広く（16-18に概説）はPPIの上に提供する情報の種類に基づいて、三つのカテゴリーに分類することができる。最初の1は、酵母ツーハイブリッドおよびその誘導体19に基づいています。これらの技術は、バイナリのネットワークを構築することができ、タンパク質のペアの間の直接的な関連、上の情報を提供します。第二のファミリーは、ベイトタンパク質のアフィニティー精製および質量分析20に続くアフィニティー精製などのそれらの関連パートナーの同定に基づく。これらのアプローチは、直接であるタンパク質のグループを識別するまたは間接的に、一般的に安定した方法で、関連する、およびタンパク質複合体を同定するために非常に強力である。第三のアプローチは、タンパク質断片相補アッセイ（PCAは）11,21に基づいています。それは、タンパク質間の直接および近位の関連付けを検出することができますように、このアプローチは、二人の元のアプローチの解像度の中間レベルを提供します。最近18を見直しとして各技術は、独自の長所と短所があります。 そのプロテオームは、他のモデル真核生物のものよりも比較的複雑であるため、とのPPIを検出するためのハイスループットアッセイは、最初にアッセイされ、より効率的であるたために最善のような真核生物のPINは、部分的には、これまでで出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの一つですこのモデル生物9-12で実装。酵母系に特に強力な方法は、ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質断片相補アッセイ（DHFR-PCA）、されているアッセイである標準と摂動条件11,22-26における酵母PINを研究するために別のコンテキストで使用。この方法は、定量的に27で内因性発現レベルにおける所与のベイトタンパク質と相互作用パートナー11,21の天然の細胞内の局在化のための直接近直接PPIの検出を可能にする生存アッセイに依存している。このアッセイ（高密度コロニーアレイ上すなわちコロニーサイズ）を使用して得られた信号は、このように、野生型細胞のいずれかとほぼ同等の細胞環境におけるベイトとプレイとの間に形成されるタンパク質複合体の量を反映する。アッセイは、その2つのタンパク質が相互作用するときに目的の2つのタンパク質に融合されるDHFRの2つの相補断片が接近することにより、葉酸代謝に関与するレポーター酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の再構成に基づいている今度は酵素活性1の可逆的再構成につながる1とメトトレキサート（MTX; 図1）を含む培地上で株の増殖。この化合物は、内因性DHFR酵素ではなく、アッセイ28で使用される突然変異したものを阻害する。 PCA株の二つのコレクションを含む1 マタで株〜4300 ORFはDHFR Fに融合した[1,2]フラグメントおよびORFはDHFR [3]断片に融合、に購入することができた株α〜4800 MATを含む1すべての実験室での小規模または大規模にDHFR-PCAを実装する。ここでは、1ベイトタンパク質と、このアッセイを用いて〜4800獲物タンパク質との間のPPIをスクリーニングするための一般的なが、詳細なプロトコルを記述します。

<table><tbody><tr><td>BioMatrixロボット、ベンチトップ構成</td><td>S&ピーロボティクス株式会社</td><td>BM5-BC</td><td></td></tr><tr><td>96フォーマット ピンツール</td><td>S&ピーロボティクス株式会社</td><td>PH-96-10</td><td>標準 96フォーマット ピンツール 96本 高精度フローティングピン</td></tr><tr><td>384フォーマット ピンツール</td><td>S&ピーロボティクス株式会社</td><td>PH-384-10</td><td>標準 384 フォーマット ピン (384 高精度フローティング ピン付き)</td></tr><tr><td>1536 フォーマット ピン ツール</td><td>S&ピーロボティクス株式会社</td><td>PH-1536-05</td><td>カスタム1536フォーマット 0.5mm高精度フローティングピン付きピンツール</td></tr><tr><td>自動イメージングモジュール&nbsp;</td><td>S&ピーロボティクス株式会社</td><td>IMG-02</td><td></td></tr><tr><td>メトトレキサート&nbsp;</td><td>バイオショップ・カナダ・インク</td><td>MTX440型機&nbsp;</td><td>注意:有毒化合物</td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B&nbsp;</td><td>バイオショップ・カナダ・インク</td><td>HYG003</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricin 二水素硫酸塩</td><td>Werner BioAgents</td><td>5010000</td><td></td></tr><tr><td>酵母-インタラクトームコレクション&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>YSC5849</td><td></td></tr><tr><td>Omni Tray (蓋付き) 滅菌済み&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>の242811</td><td></td></tr><tr><td>抗DHFR F[1,2]抗体&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1067</td><td></td></tr><tr><td>抗DHFR F[3]抗体&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D0942</td><td></td></tr></tbody></table>

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（pca）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

タンパク質は、細胞プロセスのビルディングブロック、エフェクター、シグナルメディエーターです。タンパク質の機能、調節、局在は、多くの場合、他のタンパク質との相互作用に依存します。ここでは、生細胞内のタンパク質間の直接的および近位の関連を検出する強力な方法である酵母タンパク質フラグメント相補アッセイ(PCA)のプロトコルについて説明します。2つのタンパク質間の相互作用は、それぞれがジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)タンパク質断片に融合しており、メトトレキサート(MTX)の存在下での酵母株の増殖につながります。再構成されたDHFR酵素の量が異なることに起因する適応度の違いは、高密度コロニーアレイで定量化できるため、相互作用する餌と被食者のペアと相互作用する餌と被食者のペアを区別することができます。ここで紹介するハイスループットプロトコルは、相補的なDHFRフラグメント融合タンパク質を保有する餌株と獲物株の交配を並列化するロボットプラットフォームとMTXでの生存アッセイを使用して実行されます。このプロトコルは、目的のベイトタンパク質が関与する数千のタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)を体系的に試験することを可能にし、タンパク質局在を変更することなく、複雑なレポーターコンストラクトの組み立てを必要とせずに、その内因性プロモーターから発現されるタンパク質の研究を含む、他のPPI検出アッセイに比べていくつかの利点を提供します。

補足表2は、Nup82はDHFR F餌として[1,2]断片に融合した酵母タンパク質を用いて得られた代表的な結果の一例である。 L-DHFR Fで定義されたしきい値は、[3]のコントロールは、高い信頼ヒット（ 図3Dおよび3E）を決定するために経験的な閾値として使用することができる。代替的に、スコアランキングは、遺伝子オントロジー濃縮度を実行するために使用することができ、または他の機能は、金基準37に基づいて、36を解析する。餌の既知の物理的相互作用因子はバイオグリッド35のようなデータベースから検索したデータ（ 図3E＆3F）に重ね合わせることができる。この例では、5つの8のうち、高い信頼のヒットは、以前にNup82の相互作用因子として報告されていると2はNup82の複体、Nup116とNup159（ 図3F＆3G）の一部である。複雑な、NSP1の他のメンバーは、すべてのインタラックが表示されない我々の実験でる。二つの餌食、Ade17とTEF2（ 図3Fには示されていない）が、ハード閾値以上のスコアが適用されていたが、これらは、彼らが我々は（未発表の結果）を行っているPCAの画面のほぼすべての餌タンパク質と相互作用するように偽陽性である可能性が高い。一方、Pex30はNup82の新規物理的相互作用因子を表すことができ、我々は、低スループット（ 図3G）でのDHFR-PCAを使用して、この相互作用を確認することができました。 Pex30はペルオキシソーム膜タンパク質であり、数の直接的な相互作用は、核膜孔複合体（NPC）とこの細胞小器官の間で報告されている。ツーハイブリッドスクリーンはPex30 38の物理的な相互作用因子として、他の二つのNPCタンパク質、Nup53とAsm4（Nup59）を同定し、そしてPex30とNup170間の遺伝的相互作用は、39を報告されている。他の二つの相互作用パートナーは、検出されNup120とNup85（ 図3F＆3G）、能力を示す、Nup82サブ複合体の一部ではありませんDHFR-PCAの中で、より大きな複合体11でsubcomplexes間の相互作用を検出する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig1highres.jpg" /> 図1：半数体のMATaマットα株のハイスループットDHFR-PCAのためのエンジニアリング酵母株（。Leducqらから適応図2012 33）（A）建設は、DHFRとGene1（G1）とGene2（G2）を融合させF [1,2] -NatMXおよびDHFR F [3] -HPHカセット 、それぞれ。カセットは、その後、[3]の順方向でG1-5」とG2-5を&#39;プライマープラスミドpAG25-DHFR F [1,2]とpAG32-DHFR Fから増幅、およびリバースプライマーG1-3&#39;とG2-3」、とされている相同組換えにより標的遺伝子の3 &#39;末端のゲノムに挿入する。得られたタンパク質は、P1及びP2は、それぞれDに融合されるHFR F [1,2]断片（ のMATa）と柔軟なリンカーを介してDHFR F [3]断片（MATα）。（B）構造の検証中（A）はGene1のとGene2者のORFとの間の接合部を配列決定することにより行われるDHFRカセット。接合型の対向構築PCA株はその後、二倍体を形成するために交配させる。二つの相補的DHFR断片がDHFR酵素の活性を再構成P1とP2との間の相互作用によって近接させている場合、二倍体株は、MTX培地上で成長する。（C）建設管理の二倍体PCAは、DHFR-PCAスクリーニングのため株。陰性対照（L-DHFR）は、プラスミドP41リンカーDHFR F [1,2]およびP41リンカーDHFR F [3] 11のそれぞれに別々に半数体のMATa及びMATα株を形質転換することによって構築される。 2株はDHFR断片ができないもので、陰性対照二倍体株ではその結果交配するお互いに（上）を補完する。ポジティブコントロールは、ネガティブコントロールの場合と同じアプローチを使用して構築されているが、プラスミドは、一倍体株（P41-ジッパー-リンカー-DHFR F [1,2]（P41-ZL-DHFR F [1,2]）とP41で変換リンカー-DHFR--zipper F [3]（P41-ZL-DHFR F [3]））、底部（DHFR活性の再構成に強力かつ構成的な相互作用をもたらす、相補的DHFR断片に融合した2 GCN4平行ロイシンジッパーフラグメントを含む）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig2highres.jpg" /> 図2：ハイスループットDHFR-PCA手順（Leducq らから適応図33。）（A）MATαDHFR F [3]コレクション。<html>結露の2つの連続ラウンドを1536形式で凝縮されている。まず、グリセロールストックプレート96、ピンツールを使用して、384フォーマットで選択的YPD + HygB媒体上の4つの基によって結合される。第二に、384のアレイ384のピンツールを使用して、1536形式の選択YPD + HygB媒体上の4つの基によって結合される。 のMATa PCAベイト株（B）細胞芝生はベイト株の飽和培養物を増殖させることによって調製されるYPD +ナットomnitray。（C）これらの芝生で培養めっき選択YPD +ナット媒体とは、YPD培地上DHFR F [3]コレクションとベイト株を交配するために使用される。細胞は、連続して二倍体を選択し、二回MTX媒体にPCAを実行するためにYPD + HygB +ナット媒体に二回転送されます。 DHFR断片をベイトおよびプレイタンパク質との間の相互作用の後、お互いを補完した場合、成長は、MTX媒体上に観察される。e.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig3highres.jpg" /> 図3：各画像の中央値によるデータは、正規化の工程を経て正の相互作用の有意性閾値と識別の決定を分析する（A）は 、各プレート上のコロニーの大きさの密度分布（2ログ）（B）正規化は、バイアスを補正するプレート間の副作用を伴う。（C）ヒートマップは、手順の再現性を確認し、プレート間のスピアマンの相関係数を示す。テストのPPIのスコアの（D）の分布とL-DHFR F [3]を制御する。ハード閾値は点線の垂直表される（[3]の分布の高い信頼性のPPIを識別するためにL-DHFR Fの95 パーセンタイル値に設定することができ各獲物の平均スコアの行）。（E）順位分布。バイオグリッド35 Nup82pの以前に報告され、物理的相互作用パートナーは、円によって識別され、この研究で報告されたものは赤い点で識別されます。 （D）で定義された閾値は点線で示されている。この研究で同定高い組み合わせのPPIを示した（F）ネットワーク。ブルーエッジが以前に報告されたショーの物理的相互作用因子（バイオグリッド35）、イエローエッジがPex30と以前に報告されていない相互作用を示す。（G）Nup82-DHFR F [1,2]と獲物-DHFR F [3を含むPCA二倍体株のスポット希釈アッセイ]ペアは、本研究におけるNup82pの物理的な相互作用因子として同定した。増殖アッセイは、DMSO媒体（MTX溶媒、左パネル）およびMTX培地（右パネル）で行った。 [3]とリンカ-DHFR F [1,2]リンカ-DHFR F - - [1,2] Nup82-DHFR Fからなる負の対照リンカ-DHFR F [3]及びTからなるポジティブコントロール2ロイシンジッパー部分間の彼の強力な相互作用（ジッパー-DHFR F [1,2] - ジッパー-DHFR F [3]）が含まれていた。 MTX培地でネガティブコントロールに優れた細胞増殖を、物理的相互作用として解釈されるべきである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> アミノ酸 </td><td> 量（g）に </td></tr><tr><td>アデニン硫酸塩* </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-トリプトファン</td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> L-チロシン</td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-フェニルアラニン</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Lグルタミン酸（ナトリウム塩） </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-アスパラギン</td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Lバリン</td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> L-スレオニン</td><td> 2.0 </tD&gt; </tr><tr><td> Lセリン</td><td> 3.75 </td></tr><tr><td>ウラシル</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-ヒスチジン塩酸</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-アルギニン塩酸</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-メチオニン* </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-リジン* </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-ロイシン</td><td> 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> *（このプロトコルのように）標準的なPCAを実行する際に廃止が、他の目的のために添加することができる。 </td></tr></tbody></table> 表1：MTX培地で10倍-Lys / MET / ADEドロップアウトの構成数量は10倍、ドロップアウトの1リットル用です。アスタリスクは、標準的なMTX媒体として引き出されるべき化合物を示すが、それは、他の目的のために添加することができる。 補足表1：12試験板から合成されたデータは、表1に連結されたDAが含まれていますImageJの解析からのTAは、各行がそれぞれ1536アレイ上の単一の位置に対応するカスタムImageJのスクリプトを使用して実行。また、各行は、画像ファイル、DHFR収集プレート、複製、ORFおよびタンパク質名に関する情報で注釈されている。 補足表2：菌株ごとの平均正規化された成長表2は、標準偏差と一緒に、コレクションの各株についての平均対数2正規化された成長が含まれています。フィルタ処理餌食、ヒットと既知の物理的相互作用因子は、別の列で識別されている。

タンパク質は互いに相互作用し、これらの相互作用が彼らの機能の大部分を決定します。タンパク質相互作用パートナーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼタンパク質フラグメント相補アッセイ(DHFR-PCA)に基づく酵母適応度アッセイを使用して、in vivoでハイスループットで同定できます。

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

この手順の全体的な目標は、DIヒドロ葉酸レダクターゼタンパク質フラグメントCOMPLEMENTATIONアッセイ、またはD-H-F-R-P-C-Aを使用して、目的のタンパク質のタンパク質相互作用パートナーを特定することです。これは、最初にDH FFR F 3コレクションを凝縮するか、高密度コロニーアレイに賞賛することによって達成されます。次に、餌株は、リッチな媒体に賞賛の配列で作られています。最後のステップでは、これらの嵌合から生じる二倍体が選択されます。最終的に、DHFRの再構成は、選択的PCA培地でコロニーサイズを測定することによって定量化され、細胞内で再構成された餌獲物複合体の量に比例したシグナルが得られます。この技術の意味は、タンパク質相互作用ネットワークの再配線によるように、癌などの疾患の治療にも及びます。突然変異がそのような病気につながる可能性があるということです。処置当日の朝、まずPINツールをウォーターバスステーションに5回、10秒間浸してロボットプラットフォームを滅菌し、残留した細胞塊を取り除きます。次に、PINツールをブラシステーションで前後に2回、ケータリングステーションで2回、PINツールをクリーニングしている間に残りのセルを削除するために各20秒間浸します。UVランプを5分間点灯させて、ロボットを滅菌します。エンクロージャーは、最後の洗浄後、エアドライヤーステーションでPINツールを25秒間乾燥させます。ここでは、A-D-H-F-Rコレクションを384株の16アレイに凝縮します。384 配列は、等間隔の 4 つの等間隔の象限に細分化でき、それぞれが 2 x 2 の行列レイアウトの 96 の位置で構成され、合計 4 つの象限になります。これを行うには、各 384 アレイに対して、YPD と 250 マイクログラム/ミリリットルを含む Omni トレイの 4 つの象限に 4 つのグリセロールプレートを印刷します。ハイグロマイシンBは、これを行うために96ピンツールを使用して、DHFR 3コレクションからの60グリセロールプレートの間にLDH FFR F 3ネガティブコントロールを含む4 96ウェルプレートを挿入し、4つの1, 536アレイを正確に満たす64プレートの最終セットを有する。次に、LDH FFR F 3ネガティブコントロールを含む4 96ウェルプレートを他の60枚のプレートの間に挿入して、4 15 36アレイを正確に満たす64枚のプレートの最終セットを作成し、ソースプレートに細胞を追加する前に、滅菌されたピンを35ミリリットルの滅菌水で濡らしますウェットステーションのオムニトレイで滅菌したピン。アレイを摂氏37度で2日間インキュベートし、次いでコレクションを1,536株の4つのアレイに凝縮する。4つのデスティネーションプレートのそれぞれに384株の4つの配列を印刷します。384ピンツールを使用します。各複製サイクルの間にPINツールを滅菌する(例:さらに2日間のインキュベーション後)。選択したYPD培地上の4つのアレイを1, 536ピンツールで複製することにより、コロニーサイズを標準化し、プレートをさらに48時間インキュベートします。高スループットを実現します。D-H-F-R-P-C-Aは、まず、50ミリリットルのチューブに20ミリリットルの液体YPDとCIOリシンの餌株の培養物を接種し、250RPMで振とうしながら摂氏30度で2日間細胞をインキュベートします。文化が飽和状態に達したとき。細胞懸濁液の5ミリリットルをYPD plus gnat omniトレイにプレートし、5〜10分後に細胞を表面に吸収させ、余分な液体を取り除き、2日後に30°Cで培養物をインキュベートします。1, 536ピンツールを使用して、各セル芝生を4回以内で12枚のYPDプレートに餌のひずみを印刷します。次に、1, 536ピンツールを使用して、再度、餌セルの上にDHFR F 3コレクションの適切な配列を印刷します。さらに2日間のインキュベーション中に系統を交配させ、その後、YPDとヒドロマイシンBおよびノルチンを含むオムニトレイにコロニーを印刷して二倍体細胞を選択します。二倍体を摂氏30度でさらに2日間インキュベートし、その後、インキュベーションの1日後に示したように選択を繰り返します。翌日、メトトレキセートを含む培地をプレートに注ぎます。1, 536ピンツールを使用して、二倍体細胞をメトトレキサート培地に印刷し、プレートをビニール袋でさらに4日間インキュベートして、培養物が乾燥するのを防ぎます。インキュベーションの3日目に。翌日に示したように、MTX培地を含むオムニトレイの2番目のバッチを注ぎ、ロボットライトをオンにし、ロボットプラットフォームを使用してプレートを画像化し、PCA株の背景成長を減らし、定量的分解能を向上させ、MTX培地の2番目のバッチで細胞を複製して、今示したようにMTX選択の2回目のラウンドを実行します。最後に、第2セットのプレートから画像を取得した後、適切なソフトウェアでコロニーアレイを分析し、各アレイの各位置のコロニーサイズ情報を収集します。LDH FFR F の 3 つのコントロールで定義されたしきい値は、高い信頼度ヒットを決定するための経験的しきい値として使用できます。その後、ベイトの既知の物理的インタラクターをBiogridなどのデータベースから取得し、データにオーバーレイすることができます。例えば、ここでは、8つの高信頼性ヒットのうち5つが以前にNUP 82インタラクターとして報告されており、その中で他のNUP one 16とNUP 1 59はNUP 82サブコンプレックスの一部であると判断されました。また、このデータは、PEX 30近似膜タンパク質が、検出された他の2つの相互作用パートナーのうちの2つが低スループットでD-H-F-R-P-C-Aを使用して確認されたNup 82の新規な物理的相互作用を表している可能性があることも示しています。新しいもの20と新しい85は、新しい82サブ複合体の一部ではないと判断され、D-H-F-R-P-C-Aがより大きな複合体のサブ複合体内およびサブ複合体間の相互作用を検出する能力を示しています。この手順を試行する際には、Freshly Reportメディアを使用して、印刷手順のトラブルシューティングを回避し、最終的なPCAメディアがDHFR補完を示す細胞のみの増殖を可能にすることを確認するために必要な制御を含めることを忘れないでください。

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生物学

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生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

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