生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

この手順の全体的な目標は、DIヒドロ葉酸レダクターゼタンパク質フラグメントCOMPLEMENTATIONアッセイ、またはD-H-F-R-P-C-Aを使用して、目的のタンパク質のタンパク質相互作用パートナーを特定することです。これは、最初にDH FFR F 3コレクションを凝縮するか、高密度コロニーアレイに賞賛することによって達成されます。次に、餌株は、リッチな媒体に賞賛の配列で作られています。

最後のステップでは、これらの嵌合から生じる二倍体が選択されます。最終的に、DHFRの再構成は、選択的PCA培地でコロニーサイズを測定することによって定量化され、細胞内で再構成された餌獲物複合体の量に比例したシグナルが得られます。この技術の意味は、タンパク質相互作用ネットワークの再配線によるように、癌などの疾患の治療にも及びます。

突然変異がそのような病気につながる可能性があるということです。処置当日の朝、まずPINツールをウォーターバスステーションに5回、10秒間浸してロボットプラットフォームを滅菌し、残留した細胞塊を取り除きます。次に、PINツールをブラシステーションで前後に2回、ケータリングステーションで2回、PINツールをクリーニングしている間に残りのセルを削除するために各20秒間

UVランプを5分間点灯させて、ロボットを滅菌します。エンクロージャーは、最後の洗浄後、エアドライヤーステーションでPINツールを25秒間乾燥させます。ここでは、A-D-H-F-Rコレクションを384株の16アレイに凝縮します。

384 配列は、等間隔の 4 つの等間隔の象限に細分化でき、それぞれが 2 x 2 の行列レイアウトの 96 の位置で構成され、合計 4 つの象限になります。これを行うには、各 384 アレイに対して、YPD と 250 マイクログラム/ミリリットルを含む Omni トレイの 4 つの象限に 4 つのグリセロールプレートを印刷します。ハイグロマイシンBは、これを行うために96ピンツールを使用して、DHFR 3コレクションからの60グリセロールプレートの間にLDH FFR F 3ネガティブコントロールを含む4 96ウェルプレートを挿入し、4つの1, 536アレイを正確に満たす64プレートの最終セットを有する。

次に、LDH FFR F 3ネガティブコントロールを含む4 96ウェルプレートを他の60枚のプレートの間に挿入して、4 15 36アレイを正確に満たす64枚のプレートの最終セットを作成し、ソースプレートに細胞を追加する前に、滅菌されたピンを35ミリリットルの滅菌水で濡らしますウェットステーションのオムニトレイで滅菌したピン。アレイを摂氏37度で2日間インキュベートし、次いでコレクションを1,536株の4つのアレイに凝縮する。4つのデスティネーションプレートのそれぞれに384株の4つの配列を印刷します。

384ピンツールを使用します。各複製サイクルの間にPINツールを滅菌する(例:さらに2日間のインキュベーション後)。選択したYPD培地上の4つのアレイを1, 536ピンツールで複製することにより、コロニーサイズを標準化し、プレートをさらに48時間インキュベートします。

高スループットを実現します。D-H-F-R-P-C-Aは、まず、50ミリリットルのチューブに20ミリリットルの液体YPDとCIOリシンの餌株の培養物を接種し、250RPMで振とうしながら摂氏30度で2日間細胞をインキュベートします。文化が飽和状態に達したとき。

細胞懸濁液の5ミリリットルをYPD plus gnat omniトレイにプレートし、5〜10分後に細胞を表面に吸収させ、余分な液体を取り除き、2日後に30°Cで培養物をインキュベートします。1, 536ピンツールを使用して、各セル芝生を4回以内で12枚のYPDプレートに餌のひずみを印刷します。次に、1, 536ピンツールを使用して、再度、餌セルの上にDHFR F 3コレクションの適切な配列を印刷します。

さらに2日間のインキュベーション中に系統を交配させ、その後、YPDとヒドロマイシンBおよびノルチンを含むオムニトレイにコロニーを印刷して二倍体細胞を選択します。二倍体を摂氏30度でさらに2日間インキュベートし、その後、インキュベーションの1日後に示したように選択を繰り返します。翌日、メトトレキセートを含む培地をプレートに注ぎます。

1, 536ピンツールを使用して、二倍体細胞をメトトレキサート培地に印刷し、プレートをビニール袋でさらに4日間インキュベートして、培養物が乾燥するのを防ぎます。インキュベーションの3日目に。翌日に示したように、MTX培地を含むオムニトレイの2番目のバッチを注ぎ、ロボットライトをオンにし、ロボットプラットフォームを使用してプレートを画像化し、PCA株の背景成長を減らし、定量的分解能を向上させ、MTX培地の2番目のバッチで細胞を複製して、今示したようにMTX選択の2回目のラウンドを実行します。

最後に、第2セットのプレートから画像を取得した後、適切なソフトウェアでコロニーアレイを分析し、各アレイの各位置のコロニーサイズ情報を収集します。LDH FFR F の 3 つのコントロールで定義されたしきい値は、高い信頼度ヒットを決定するための経験的しきい値として使用できます。その後、ベイトの既知の物理的インタラクターをBiogridなどのデータベースから取得し、データにオーバーレイすることができます。

例えば、ここでは、8つの高信頼性ヒットのうち5つが以前にNUP 82インタラクターとして報告されており、その中で他のNUP one 16とNUP 1 59はNUP 82サブコンプレックスの一部であると判断されました。また、このデータは、PEX 30近似膜タンパク質が、検出された他の2つの相互作用パートナーのうちの2つが低スループットでD-H-F-R-P-C-Aを使用して確認されたNup 82の新規な物理的相互作用を表している可能性があることも示しています。新しいもの20と新しい85は、新しい82サブ複合体の一部ではないと判断され、D-H-F-R-P-C-Aがより大きな複合体のサブ複合体内およびサブ複合体間の相互作用を検出する能力を示しています。

この手順を試行する際には、Freshly Reportメディアを使用して、印刷手順のトラブルシューティングを回避し、最終的なPCAメディアがDHFR補完を示す細胞のみの増殖を可能にすることを確認するために必要な制御を含めることを忘れないでください。