ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

本実験の全体的な目的は、免疫組織化学を用いて目的のタンパク質を可視化することです。今回の例では、ミクログリア用のIBA1およびニューロン用のpan neuronalを使用します。まず、非特異的結合を防ぐために、調製した切片をブロッキング溶液に浸すことでこれを達成します。

第2ステップとして、目的の2種類のタンパク質を認識する抗体を切片に滴下し、一晩置きます。次に、切片を洗浄し、一次抗体に蛍光タグを付加するために二次抗体でインキュベートします。この二重染色により、ニューロンが存在する領域内のミクログリア染色の確認が可能になります。

一般的に、この手法に慣れていない人は、調整すべき変数が非常に多いため、最初は苦労することがあります。本日のデモンストレーションは、当研究室の学部生であるHazel Mayが行います。まず、付属のテキストプロトコルに従って、げっ歯類の脳を慎重に固定および切片化し、その後、使用するまで-80 °Cで慎重に保存してください。

プロトコルを続行する準備ができたら、スライドをフリーザーから取り出し、室温で解凍します。解凍後、スライドをラックに配置し、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。これ以降、切片を乾燥させないようにしてください。

スライドの端を乾燥させ、液体の均一な被覆を確保しエッジエフェクトを軽減するため、PAPペンでスライドの周囲に撥水境界線を描きます。次に、各スライドにPBSで希釈した血清を300 µL加え、切片をブロッキングします。血清は、二次抗体の作製に使用された動物種のものを使用してください。

本ケースでは、ドンキー血清を使用しました。ブロッキング溶液がスライドの端まで届き、組織を完全に覆っていることを確認してください。染色のムラを防ぐため、スライドを湿潤箱に入れ、室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション中に、一次抗体を準備します。IBA1抗体を1:5,000に、パンニューロナル抗体を1:500に、1%ドンキー血清を含むPBSで希釈します。ブロッキング溶液を除去し、目的の両方の抗体を含む抗体溶液を300 µL加えます。また、3枚のコントロールスライドも準備してください。

1枚目のスライドにIVAの希釈液を300 µL、2枚目のスライドに汎神経細胞抗体の希釈液を300 µL、そして3枚目のスライドにPBSで調製した1%ドンキー血清を300 µLずつ加えます。すべてのスライドを加湿チャンバーに入れ、4 °Cで一晩インキュベートし、翌朝に取り出します。PBSで5分間ずつ3回洗浄します。

1% ドンキー血清含有PBSを用いて、2種類の蛍光二次抗体をそれぞれ250倍に希釈し、蛍光二次抗体混合液を調製します。各スライドにこの混合液を300 µLずつ滴下し、遮光した湿潤チャンバーに入れ、室温で60分間静置します。その後、スライドをPBSで5分間ずつ3回洗浄し、最後に2回蒸留水でリンスします。

洗浄中はスライドを遮光してください。PBSを用いて、蛍光信号の強度を維持させるための水溶性封入剤を各スライドに数滴滴下します。次にカバーガラスを掛け、綿棒を用いて残っている気泡を取り除き、封入剤をスライドに密着させて切片の乾燥を防ぎます。

エッジをネイルポリッシュでコーティングします。スライドは遮光ボックスの中で1時間水平に置いて乾燥させた後、アルミホイルで包み、4 °Cの遮光容器で保存します。ネイルポリッシュが乾燥したら、スライドを顕微鏡室に運び、イメージングを行います。

天井照明を消し、その他の外部光源を遮断して、部屋を準備します。顕微鏡、蛍光光源、およびイメージング用コンピューターの電源を入れます。次に、スライドを顕微鏡ステージに載せ、焦点を合わせます。

付属のソフトウェアを使用して、各波長の露光時間を個別に設定します。サンプルの光退色を防ぐため、スライドを長時間光にさらして過剰露光することを避けてください。その後、切片を移動させたりフォーカスを調整したりせずに、各チャネルで画像を撮影します。

イメージングソフトウェアを使用して画像を結合し、後で画像解析を行うために保存します。先ほど説明した染色プロトコルを用いることで、ここに示したような蛍光画像が容易に得られます。赤色チャンネルではIBA1陽性のミクログリアが明確に現れ、緑色チャンネルではpan-neuronal陽性のニューロンが背景から際立って見えます。これら両方の抗体染色のコントロール画像も表示されています。

IBA1および汎ニューロンマーカーを用いた二重染色（ダークフィールド）の結果をここに示します。皮質層全体にわたって、長い微細な神経突起を持つ分枝状のミクログリアが主に見られます。ここで示されているような染色の結果は、組織の品質が低い場合にも起こり得ます。組織の品質が低いことは、細胞体が明確に定義されていないことや、ミクログリアおよびニューロンの突起が断片化していることで分かります。

ミクログリアの染色が不明瞭であり、ニューロンの染色は完全に欠如しているため、この手法を試みる際に重ね合わせ画像を作成しても意味をなしません。切片を均一に覆い、各工程の間で切片を乾燥させないようにすることが重要です。このビデオを視聴することで、免疫組織化学の入門的な手法について十分に理解できるはずです。