Name: ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶ凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学法によるミクログリアとニューロンの二重染色技術。一次抗体と蛍光標識二次抗体を用いて、細胞間相互作用を可視化する再現性の高い神経科学研究手法です。

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著者は、このコミュニケーションに対する貴重なフィードバックを提供してくださったRyan Hart氏とArriz Lucas氏に感謝したいと思います。この研究は、NIH NINDS R01 NS065052 と Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds の支援を受けました。

注：すべての手順は、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に準拠して実施しました。推奨される材料および機器のリストを 、 表1に見ることができます。 1.組織標本<ol><li>かん流<ol><li>ペントバルビタールナトリウム（25mgの/ kgのIP）の過剰摂取と齧歯類を安楽死させる、8 ml /分の流速で完全に放血（3-5分）まで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で経灌流。徹底的灌流手順については、ゲージら2012 9を参照してください。 </li><li>即時/分で8ミリリットルの流速で15〜20分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで灌流することにより、組織を固定する、PBSフラッシュを以下。 </li><li> （順番に、15％、30％、30％と、生理食塩水緩衝トリスで調製した）傾斜スクロース溶液、続いて、24時間、4％パラホルムアルデヒド中で脳と場所を削除4℃。その後のスクロース溶液Oに脳を転送NLY脳の後、各溶液中に沈めました。注：通常、各溶液中の5日は、シンクする組織のために十分な時間です​​。 </li></ol></li><li>組織の凍結および凍結切片化<ol><li>このようなOCT化合物として、メディアを埋め込むには、脳を置き、-35℃の温度でイソペンタンに沈めます。脳は最低10分間凍結し、次いで-80℃で保存することができます。温度に勤勉が取られていない問題が発生する場合があります。トラブルシューティング情報を説明を参照してください。 </li><li> 20μmの厚さ、-20℃の温度で連続冠状断面をカットします。正に荷電したスライド上に組織を収集します。脳切片を-80℃でジップトップバッグと格納されている長期的に箔に包まれたスライドボックス内に配置することができます。ストレージのこの方法は、空気や霜への暴露を防止するために、二重の境界線を作成します。 </li></ol></li></ol> 2.組織処理注：例の機器や材料R染色のためにequiredは、図3に示されている。代替が利用可能である、しかしながら、これらの画像は、免疫組織化学的染色に新しいものの前に適切な購買アイテムを可視化するために役立ちます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> 図3：スライドは、箔のボックスをラップする必要がなく、光から保護されているように、免疫組織化学染色のために必要な例の項目（A）に示したブラックボックスは、免疫蛍光のための理想的な湿度室です。切片化後、スライドは、（B）に示すように黄色のボックスのボックスに保存することができます。ホイルでしっかり箱を包む前冷凍庫にジップトップバッグに配置すると、冷凍焼けから組織サンプルを保護するのに役立ちます。スライドの例は、E（異なる染色皿（D）に示されていると、（C）に示され</strong&gt;）。カバーガラスの厚さが1.2カバースリップは、ほとんど直立共焦点顕微鏡で撮影素晴らしい結果を提供する、大きさ及び厚さ（F）に変化することができます。このような（G）に示すような鉛筆スライドを標識するために使用することができます。インクを実行できるように恒久的なマーカーは、染色およびサンプルが何であるかを決定する能力の両方に影響を与え、避けるべきです。それは（H）に示すようなミニPAPペンは撥境界がスライド上に描画することが可能になります。 <ol><li>スライドの準備<ol><li>室温で冷凍庫と解凍からスライドを削除します。 <ol><li>オプション：セクションは、以前はスライドから浮いている場合は、スライドをオフに浮遊からの組織切片を防ぐためにこれ以上の4以上時間60℃のオーブン中で解凍したスライドを配置します。 </li></ol></li><li>スライドラックとそれに対応する皿にスライドを配置します。 </li><li>洗浄は、洗浄の間に溶液を変え、5分ごとに、PBSで3回スライドします。前進このステップから、sectiを回避長期間のための液体を取り付けずにONS。注意：セクションが乾燥した場合、バックグラウンド染色が増加し、意味のあるデータを確実に得ることができません。 </li></ol></li><li>組織染色<ol><li>光を通さない染色ボックスで、脱イオン水で浸したリントフリー組織と「湿度室」を作成。 </li><li>離れた組織切片から、スライドの非常にエッジに撥液性の境界線を作るためのミニPAPペンを使用し、糸くずの出ない組織とスライドの端を乾燥させます。この境界線は、液体のメニスカスと、その表面張力は染色に影響を与えないように、組織の縁部との間に十分なスペースを確保する必要があります。 注：目的の抗体は、マイクロ波抗原検索を必要としない場合は、PAPペン撥ボーダー前2.1.3に適用することができます。 PAPペンをPBS中で洗浄する前に適用されている場合は、撥液性の境界の整合性は、この段階でチェックする必要があります。国境のギャップを埋めるためにミニPAPペンを使用してください。 </li><liスライドを水平に配置して&gt;、ブロック非特異的抗原は、PBS（ブロッキング溶液）中の4％（v / v）の血清中でインキュベートすることにより結合します。室温で1時間のために、スライド当たりブロック溶液をピペットを300μl。ブロック·ソリューションは、スライドの端のPAPのペンに延びており、完全に組織の近くに表面張力によって引き起こされる不均一な染色を避けるために、組織をカバーしていることを確認します。 <ol><li>二次抗体が作られているのと同じ種からの血清を使用してください。注：この手順では、二次抗体は、ロバで行われ、したがって、ロバ血清が使用されます。二つ以上の異なる種に由来する二次抗体を使用する場合は、それぞれの種からの血清を含みます。 </li></ol></li><li>スライド上に一次抗体をピペット。注：この染色のための抗体の濃度が1で最適化されています：5000および1：それぞれIBA1とパン神経500、。これらの濃度は、バックグラウンド染色が存在しないと意味のある染色を示すことが見出されています。 <ol><li>にブロック溶液を希釈1％のPBS中の血清および一次抗体を追加します。スライドごとに1％の血清中の一次抗体溶液を300μlをピペット。ここでも、流体は、PAPペンの端にあることを確認してください。 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> IBA1も汎神経も抗体を含有するもの、汎神経抗体なしIBA1と1、およびIBA1なしの汎神経抗体と1：3つの制御スライドを含めます。しかし、二次抗体の非特異的結合をテストするために、一次抗体を省略し、同じソリューションと同じ実行中にこれらのスライドを染色します。 </li></ol></li><li>翌朝、洗浄は洗浄の間に溶液を変更し、5分ごとに、PBSで3回スライドさせます。 </li><li>蛍光抗体は前進このステップから、黒や暗所でインキュベートされているか、洗浄容器が箔とのハイブリダイゼーションボックスに包まれて保証することにより、露光量を最小限に抑えるため、光に敏感です。すべてのスライドに適切な二次抗体をピペットインキュベート光を通さない「湿度室」のブロック溶液中の250（ステップ2.2.3を参照）（ステップ2.2.1を参照してください）​​：1の濃度で室温で60分。 <ol><li>波長の異なる二次抗体を使用してください。ここでは、一次抗体ウサギ抗IBA1ために、適切な二次抗体としてロバ抗ウサギ594を使用しています。一次抗体マウス抗パン神経については、適切な二次抗体としてロバ抗マウス488を使用しています。あるいは、抗ウサギ488及び抗マウス594を使用しています。 </li></ol></li><li>洗浄は、5分ごとに、PBSで3回スライドします。 </li><li>オプション：核染色を行います。 <ol><li>正確に60秒間の二重蒸留H 2 0で0.03μg/ mlの濃度でヘキストに入れ（または他の核染色）。 </li><li>洗浄は、5分ごとに、PBSで3回スライドします。 </li></ol></li><li>のddH 2 0で洗浄します。 </li></ol></li><li>カバースリップ<ol><li>このようなフルーア水性マウント媒体とカバーガラススライド、omount-GまたはProlongGold。綿棒を使用して、すべての気泡を除去するように注意してください。 注：他の取り付け剤を使用することができた、しかし高ブリードスルー色素間は、カバースリップの日以内に、いくつかのことで注目されています。 </li><li>蒸発による乾燥からセクションを防止、エッジをシールするために透明なマニキュアを使用してください。スライドは平坦では室温に放置し、その後、4℃でホイルで包み遮光容器に保管しながらマニキュアは遮光容器に乾燥することができます。 </li></ol></li></ol> 3.ステンド組織を画像<ol><li>顕微鏡検査<ol><li>暗い部屋で行われるべき、マニキュアは、顕微鏡検査を開始する前に少なくとも1時間乾燥することができます。 </li><li>蛍光光源とデジタルカメラアタッチメントと共焦点や研究顕微鏡を用いて顕微鏡写真を取得します。付属のソフトウェアを使用して、各波長の露光設定 - 405、488、594 - 別途。注：徹底的イメージング命令は顕微鏡メーカーからオンラインで利用可能であるべきです。 </li><li>セクションを移動したり、フォーカスを調整することなく、各チャネルの顕微鏡写真を取得します。カラーの画像を取るか、または交互にグレースケールで、その後色に変換します。 注意：色または各チャンネルからグレースケール画像を後処理にまとめることができます。 </li><li>セクションの光退色が発生するように、組織切片を長時間、周囲光や顕微鏡の光にさらされないことを確認してください。これを避けるために、増大する光/レーザー強度ではなく、露光時間を増加させます。 </li><li>オンされてから30分以内に蛍光光源をオフにしないでください。 注：立て続けにオンとオフのソースを切り替えるには、蛍光灯の寿命が低下することがあります。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この通信の全体的な目標は、読者に、免疫組織化学の手順を導入することでした。このため、IBA1とパン神経抗原と二重標識の例は、ミクログリアおよび灌流パラホルムアルデヒド中でニューロンを観察するために、スクロース凍結保護、凍結切片ラットの脳を使用しました。 この技術は、無限の目的を果たすように構成することができます。脳、肺、肝臓、腎臓および腸に限定さなどではなく、組織型の様々な異なる抗原の配列は、プロトコルを微調整して免疫組織化学的に可視化することができます。免疫組織化学は、複数のマーカーの直接比較を可能にし、単一のサンプル内の4つの異なる抗体まで包含することができます。一つのサンプルで使用される抗体の数は、ブリードスルー、蛍光波長の重複説明によって制限されます。その結果として内染色の組み合わせを制限する制限された蛍光の光スペクトルは、ありますイングルサンプル（ 図6を参照）。 <img alt="図6" src="/fi...

<html>免疫組織化学は、目的の抗原に特異的に結合する一次抗体を用いて、組織切片中の抗原（ すなわち、タンパク質）を検出するための処理です。免疫組織化学は、彼は抗体が大きな特異性1と抗原を局所化できることを決定し1934年にJR Marrackによって開拓されました。 1942年に始まって、免疫組織化学を可視化する蛍光抗体を用いた研究in vitroでの最初の一部は、 生体組織化学的研究では 、まず、4を発表した後の2,3を 、発表されました。 1960年代の間に、三十年免疫組織化学的方法の開始後に、酵素標識抗体を二次試薬として使用されるようになりました。これらの方法は、同時に独立し、フランスと米国の5,6に開発されました。今日では、抗体の広い配列は、免疫組織化学研究の7のための無限の可能性を提供します。 &quot;&gt;この対応の全体的な目標は、免疫組織染色への簡単な紹介を提供することにある。それは、この技術の包括的かつ徹底的な見直しとなるものではありません概説した方法では、2つの抗原のための免疫組織化学的技術は、ミクログリアのために（マーカーを提示しています。パラホルムアルデヒド灌流、スクロース凍結保護、凍結切片ラットの脳の染色のためのニューロン）。免疫組織化学染色は、バックグラウンド染色を低減するために非特異的抗原を遮断することから始まる。次に、一次抗体とのインキュベーションは、組織内の特定の抗原に結合することができます。一次抗体に続いて、別の抗体、二次抗体と呼ばれる、共役可視化信号8に一次抗体をリンクするために適用される。二次抗体は、一次抗体が発生された種に特異的な免疫グロブリンG（IgG）ドメインを標的とする。二次抗体は、シグナルを増幅します一次抗体のTののFab領域のため、彼一次抗体のIgGのドメイン上の複数のサイトへの二次抗体に結合します。二次抗体のF C領域に結合させ、酵素または蛍光分子は、可視化を可能にします。例えば、ウサギ抗IBA1一次抗体はIBA1に特異的なウサギIgG分子です。ロバ抗ウサギIgGを二次抗体として適用した場合、それを認識し、ウサギ抗IBA1 IgGの複数の領域（ 図1参照）に結合します。ロバ抗体は、種々の方法によって可視化することができます。この対応は、蛍光顕微鏡により可視化するために、一次抗体を認識する二次抗体にコンジュゲート蛍光団の検出に焦点を当てています。蛍光免疫組織化学では、例えば、ヘキスト又はDAPIなどの核染色はすべての核を可視化するために使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> 図1：のSch直接対間接的な抗体の標識技術のematic表現抗体は、目的の抗原に結合し、一次抗体の種に対して惹起二次抗体によって増幅することができます。この技術は、増幅およびDAB可視化のための（A）、または直接結合蛍光二次抗体（B）は、アビジン-ビオチン複合体（ABC）を用いて行うことができます。あるいは、一次抗体を直接ビオチンまたは蛍光団（C）を含む多くの異なるタグを用いて結合させることができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 免疫組織化学的染色を視覚化するための別の方法は、（DAB、 図1および図2を参照）3,3&#39;-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドを使用しています。これは、ビオチン化を用いて、蛍光とは異なる、または明視野顕微鏡下に表示されている沈殿物にDABを変換する酵素を提供するホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体。単一の抗原に関心があるか、染色が長く持続することが要求される事例では、DABは、蛍光染色よりも適切な場合があります。しかし、DAB染色は、2つの核抗原が注目されている場合は特に、複数のマーカーの間の区別には適していません。 DAB材料およびプロトコルの変更については、 表1を参照してください。代わりに、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（NBT / BCIP）は、アルカリホスファターゼ（AP）を可視化するために用いることができる共役二抗体。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> 図2：ニッケル強化DAB単一標識ラット脳組織切片の代表的な画像ラット脳SEIBA1用ニッケル強化DAB（A）で標識し、汎神経されctions（B）は、単独でミクログリアまたは神経細胞の長期的な分析を可能にします。スケールバーは20μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 一つは、分析されている組織内の目的の抗原の推定豊かさを考慮する必要があります。間接的な方法には​​、（上記のように）低量と目標のために有用です。目的の抗原が多量である場合、直接法を適用することができます。直接法は、直接可視化信号に結合している一次抗体を伴う、したがって、二次抗体は必要ありません。この方法は、染色プロセスを簡略化するが、間接的な方法によって達成増幅を排除します。直接結合一次抗体を使用すると、二次抗体の交差反応性を排除しますときに二重標識。 この通信は、IBA1とパンニューロン（ 表1の詳細）で二重標識のためのプロトコルの詳細について説明します。 IBA1は分岐し、ハイパー分岐し、活性化され、アメーバ状、及びロッドを含む多くの活性化状態において、ミクログリアを染色します。汎神経汚れ神経の軸索、樹状突起、およびソーマ。 IBA1が最もミクログリアとパン神経標的ニューロンを染色するので、汚れのこの組み合わせは、ミクログリア - ニューロン相互作用の広範な理解を得るのに有用です。 要するに、免疫組織化学染色は、抗体の慎重な選択に依存しています。調査の質問は、より具体的になるように、代替の抗原に対して惹起された抗体が所望され得ます。特定のミクログリアの活性化状態をターゲットとするためには、むしろIBA1よりも、CD45またはCD68抗体を使用することを選択することができます。また、マウスでの作業中に、F4 / 80は、必要な結果を提供することができます。同様に、神経細胞の要素は、具体的には、抗体のRAで標的とすることができます核に対するised、シナプス（前または後）、軸索と成長円錐。さらに、ニューロン（ダブルコルチン、のNeuN）の年齢を区別する他のマーカー、および神経再生（GAP-43）があります。

<table><tbody><tr><td>フィッシャーブランド スーパーフロスト プラス スライド ガラス&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-034-979</td><td>ティッシュの取り付けに使用 (1.2.2)</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>51028112</td><td>ティッシュ乾燥に使用 (2.1.1)</td></tr><tr><td>ミニパップペン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>00-8877</td><td>ステップで使用 2.2.2</td></tr><tr><td>アンドウィンサイエンティフィック ティッシュテックスライド染色ディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-149-429</td><td>染色中のすべての洗浄に使用 (2.2)、およびヘキストステップ (2.2.8)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>スライドの乾燥に使用 (2.2)</td></tr><tr><td>Black Staining Box</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>ブロッキングおよび染色ステップに使用 (2.2)</td></tr><tr><td>ノーマル ロバ血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>ブロックおよび抗体インキュベーションに使用 (2.2)</td></tr><tr><td>マウス &α;-汎ニューロン</td><td>ミリポア</td><td>MAB2300</td><td>一次抗体に使用 (2.2.4)</td></tr><tr><td>ウサギ &-Iba1</td><td>和光化学</td><td>019-19741</td><td>一次抗体使用 (2.2.4)</td></tr><tr><td>ロバ &-ウサギ 594</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>711-585-152</td><td>二次抗体使用 (2.2.6)</td></tr><tr><td>ロバ &-マウス 488</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>715-545-150</td><td>二次抗体使用 (2.2.6)</td></tr><tr><td>ケータリングホイル</td><td>任意</td><td>該当なし</td><td>ステップ1.2.2および2.3.2で使用</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>カバースリップに使用 (2.2.8)</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12544E</td><td>カバースリップに使用 (2.2.8)</td></tr><tr><td>クリアネイルポリッシュ&nbsp;</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>カバースリッピングに使用 (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>イメージングに使用 (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>イメージングに使用 (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>DABプロトコル</td></tr><tr><td></td><td>ABCベクターラボラトリーズ</td><td>PK-6100</td><td>DABプロトコルDAB</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼキット</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>SK-4100</td><td>DABプロトコル</td></tr><tr><td>ビオチン化馬 &α;-ウサギIgG</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>BA-1100</td><td>DABプロトコルビ</td></tr><tr><td>オチン化馬 &α;-マウスIgG</td><td>ベクターラボラトリー</td><td>BA-2001</td><td>DABプロトコル</td></tr><tr><td>用30%過酸化水素</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>DABプロトコル用</td></tr><tr><td>ウィートンスライドラックと染色皿</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>DABプロトコル用</td></tr><tr><td>Masterflex灌流ポンプとチューブ</td>コール<td>パーマー</td><td></td><td>灌流に使用(1.1.1および1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT化合物(12の場合)</td><td>フィッシャーScientific</td><td>14-373-65</td><td>組織凍結に使用 (1.2.1)</td></tr><tr><td>温度計 (-50 to 50 C)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>組織凍結に使用 (1.2.1)</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>組織切片作成に使用 (1.2.2)</td></tr><tr><td>染色皿、2つの蓋付きプラスチック</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>抗原再利用可能</td></tr>用 <tr><td>20 場所染色ラック、スライド 水平</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>抗原再利用可能</td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>任意</td> N<td>/A</td><td>抗原再利用可能</td></tr></tbody></table>

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

免疫組織化学は、 その場での抗原の存在、位置、および相対的な存在量を検出するために広く用いられている技術です。この入門レベルのプロトコルは、試薬、装置、一例として、ミクログリアおよび神経要素のためのマーカーを用いて、げっ歯類の脳組織の免疫組織化学的染色を完了するために必要な技術を記載しています。具体的には、本論文では、それぞれIBA1と汎神経、免疫組織化学のために介してミクログリアと神経細胞の蛍光可視化するためのステップバイステップのプロトコルです。蛍光二重標識は、正確な細胞型、受容体、リガンドの間の相互作用を観察する機会を提供し、同じ試料中の複数のタンパク質の局在化のために特に有用であり、及び/又は互いにならびにタンパク質共に関連する細胞外マトリックス単一細胞内の局在。他の可視化技術とは異なり、蛍光免疫組織化学染色の強度が低下することがで適切な予防措置が取られない限り、染色後数週間​​から数ヶ月。蛍光はより多くの時間が効率的であり、2つ以上の間でより正確な区別を可能にするように、この制限にもかかわらず、多くの用途において蛍光二重標識は、3,3&#39;-ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）またはアルカリホスファターゼ（AP）などの選択肢よりも好ましいですマーカー。議論は成功を促進するために、トラブルシューティングのヒントやアドバイスが含まれています。

この染色プロトコルミクログリア蛍光594チャネル（赤）で標識されているラット脳組織切片をもたらし、488チャンネルで標識されたニューロン（緑は、 図4を参照します）。核染色が行われた場合には、チャネル405（青）で表示されます。画像は、異なるチャネルに取り、3つのチャネルの直接比較のために重ね、または2つのチャンネル間ことができます。多くのデジタル取得ソフトウェアスイートは、この機能が含まれます。 IBA1とここに示されている汎神経マーカーで二重標識は、皮質層全体で明らかに長い細かい神経突起を、主に分岐したミクログリアを示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig4highres.jpg" /> 図4：伊庭-1 /パン神経二重標識柱1 の代表的な共焦点蛍光画像は IBA1（赤）で染色したミクログリアを示しています。ニューロ...

この入門レベルのプロトコルは、ミクログリアとニューロン要素のマーカーを例に、げっ歯類の脳の免疫組織化学的染色を完了するために必要な試薬、機器、および技術を説明しています。

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

本実験の全体的な目的は、免疫組織化学を用いて目的のタンパク質を可視化することです。今回の例では、ミクログリア用のIBA1およびニューロン用のpan neuronalを使用します。まず、非特異的結合を防ぐために、調製した切片をブロッキング溶液に浸すことでこれを達成します。第2ステップとして、目的の2種類のタンパク質を認識する抗体を切片に滴下し、一晩置きます。次に、切片を洗浄し、一次抗体に蛍光タグを付加するために二次抗体でインキュベートします。この二重染色により、ニューロンが存在する領域内のミクログリア染色の確認が可能になります。一般的に、この手法に慣れていない人は、調整すべき変数が非常に多いため、最初は苦労することがあります。本日のデモンストレーションは、当研究室の学部生であるHazel Mayが行います。まず、付属のテキストプロトコルに従って、げっ歯類の脳を慎重に固定および切片化し、その後、使用するまで-80 °Cで慎重に保存してください。プロトコルを続行する準備ができたら、スライドをフリーザーから取り出し、室温で解凍します。解凍後、スライドをラックに配置し、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。これ以降、切片を乾燥させないようにしてください。スライドの端を乾燥させ、液体の均一な被覆を確保しエッジエフェクトを軽減するため、PAPペンでスライドの周囲に撥水境界線を描きます。次に、各スライドにPBSで希釈した血清を300 µL加え、切片をブロッキングします。血清は、二次抗体の作製に使用された動物種のものを使用してください。本ケースでは、ドンキー血清を使用しました。ブロッキング溶液がスライドの端まで届き、組織を完全に覆っていることを確認してください。染色のムラを防ぐため、スライドを湿潤箱に入れ、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション中に、一次抗体を準備します。IBA1抗体を1:5,000に、パンニューロナル抗体を1:500に、1%ドンキー血清を含むPBSで希釈します。ブロッキング溶液を除去し、目的の両方の抗体を含む抗体溶液を300 µL加えます。また、3枚のコントロールスライドも準備してください。1枚目のスライドにIVAの希釈液を300 µL、2枚目のスライドに汎神経細胞抗体の希釈液を300 µL、そして3枚目のスライドにPBSで調製した1%ドンキー血清を300 µLずつ加えます。すべてのスライドを加湿チャンバーに入れ、4 °Cで一晩インキュベートし、翌朝に取り出します。PBSで5分間ずつ3回洗浄します。1% ドンキー血清含有PBSを用いて、2種類の蛍光二次抗体をそれぞれ250倍に希釈し、蛍光二次抗体混合液を調製します。各スライドにこの混合液を300 µLずつ滴下し、遮光した湿潤チャンバーに入れ、室温で60分間静置します。その後、スライドをPBSで5分間ずつ3回洗浄し、最後に2回蒸留水でリンスします。洗浄中はスライドを遮光してください。PBSを用いて、蛍光信号の強度を維持させるための水溶性封入剤を各スライドに数滴滴下します。次にカバーガラスを掛け、綿棒を用いて残っている気泡を取り除き、封入剤をスライドに密着させて切片の乾燥を防ぎます。エッジをネイルポリッシュでコーティングします。スライドは遮光ボックスの中で1時間水平に置いて乾燥させた後、アルミホイルで包み、4 °Cの遮光容器で保存します。ネイルポリッシュが乾燥したら、スライドを顕微鏡室に運び、イメージングを行います。天井照明を消し、その他の外部光源を遮断して、部屋を準備します。顕微鏡、蛍光光源、およびイメージング用コンピューターの電源を入れます。次に、スライドを顕微鏡ステージに載せ、焦点を合わせます。付属のソフトウェアを使用して、各波長の露光時間を個別に設定します。サンプルの光退色を防ぐため、スライドを長時間光にさらして過剰露光することを避けてください。その後、切片を移動させたりフォーカスを調整したりせずに、各チャネルで画像を撮影します。イメージングソフトウェアを使用して画像を結合し、後で画像解析を行うために保存します。先ほど説明した染色プロトコルを用いることで、ここに示したような蛍光画像が容易に得られます。赤色チャンネルではIBA1陽性のミクログリアが明確に現れ、緑色チャンネルではpan-neuronal陽性のニューロンが背景から際立って見えます。これら両方の抗体染色のコントロール画像も表示されています。IBA1および汎ニューロンマーカーを用いた二重染色（ダークフィールド）の結果をここに示します。皮質層全体にわたって、長い微細な神経突起を持つ分枝状のミクログリアが主に見られます。ここで示されているような染色の結果は、組織の品質が低い場合にも起こり得ます。組織の品質が低いことは、細胞体が明確に定義されていないことや、ミクログリアおよびニューロンの突起が断片化していることで分かります。ミクログリアの染色が不明瞭であり、ニューロンの染色は完全に欠如しているため、この手法を試みる際に重ね合わせ画像を作成しても意味をなしません。切片を均一に覆い、各工程の間で切片を乾燥させないようにすることが重要です。このビデオを視聴することで、免疫組織化学の入門的な手法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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出典:Evilsizor, M. N., et al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons.J. Vis.

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