Name: 孤立の方法エクスビボ肺灌流：ラットEVLPプログラムの開発の教訓 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶラットエクスビボ肺灌流モデルの構築法。気管・肺動脈・左心房のカニューレ挿入とリアルタイムモニタリングにより、肺移植研究における再現性のある実験プラットフォームを確立します。

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著者は、回路組立、変更及び灌流回路とXVIVO灌流（ダニエル·マルティネリ、CCP、CTP）のためのトラブルシューティングに彼らの支援のためにハーバード装置、特にステファニーPazniokas、MS（ 生理学システム＆再生医療）の支援を感謝したい非臨床使用肺plegiaを提供する。

注：すべての手順は、動物実験と実験動物の愛護管理と使用に関する米国学術研究会議·ガイド（IACUC）のガイドラインに従って行ったとオハイオ州立大学IACUC委員会による承認を受けた。 1.初期セットアップ<ol><li> EVLP回路を設定し、温かい（37℃）灌流前に外植肺（ 図1）を内蔵し、システム内を循環している。 </li><li> 37℃に、ジャケットに灌流液リザーバー、熱交換器、および人工的な胸部を使用温水浴を、設定します（ 図1）を循環させる。 </li><li>灌流液は実験のために〜6％溶存酸素が ​​あることを確認するために、現在、ガスフィルター内灌流液を通して（ 例えば 6％のO 2、8％CO 2、84％N 2）カウンタの脱酸素化ソリューションを実行します。 注：この脱酸素灌流液は、アセスメントOを可能に灌流液、ポスト器官に導入された酸素を測定することにより、肺機能F。 </li><li> （EVLP回路およびデータ収集/アナログ - デジタルコンバータボックスにデータ取得プログラムを開き、肺動脈圧変換器に接続し、気管差圧変換器、呼吸流量の差圧変換器、肺重量変換器、及びポンプ速度トランスデューサ図2）。 </li><li> EVLP回路（ 図3）で、手術台と操作ツールをセットアップします。 </li><li>サンプルが得られる場合にはEVLP回路の近くに液体窒素の小さな容器を設定します。 注：著者のシステムは、潜在的に肺に損傷を与える場合が圧力流体力学を中断することなく予め臓器およびポスト臓器灌流液を収集するように改変されている。 </li></ol>麻酔薬およびヘパリン、ラットの麻酔の調製<ol><li>以下の個人用保護具を使用すること外科手術用マスク、手術用手袋、使い捨てガウン：ラット及びラット組織を取り扱う前（PPE）。 </li><li>ラットを計量し、体重を記録する。 </li><li> 1200 U / kgのヘパリンを準備します。 </li><li>最初のケタミンを準備、同じ注射器では60mg / kgのケタミン及び5mg / kgのキシラジンの両方を準備します。 </li><li>腹腔内ラットにケタミンおよびキシラジンの混合物を注入したラットのための5分が意識不明になることを許可。 </li><li>つま先ピンチ反射をチェックすることで、適切な麻酔を確認してください。ラットがその足指を撤回しない場合、それは痛みを感じていません。 </li><li>仰臥位で固定し、手術台にラットを移動し、殺菌のためにアルコールでスプレー。 </li></ol> 3.抽出とラット肺の初期換気<ol><li> 4〜20センチメートル長い絹縫合糸（十分です3-0または4-0）を準備します。 </li><li>データ収集プログラムを使用してデータの記録を開始する。 </li><li>外科用ハサミを使用して、麻酔の適切な深さを確認する腹膜CAを入力してください正中開腹によるVITYと下大静脈にヘパリンを注入する。 </li><li>気管が露出するまで首に胸骨柄を過ぎて頭側切開を運ぶ。胸腔（ 図4A）破裂しないでください。 </li><li>正中線で気管に後部を解剖し、気管（ 図4B）に絹縫合糸の後方にスライドさせます。 </li><li>気管の前方部分を持ち上げ、気管に高い軟骨リング、間の横切開する。この時点（ 図4C）での気管の後部膜様部を切断しないでください。 </li><li>気管カニューレを気管にカニューレを挿入し、絹縫合糸（ 図4D）で固定します。縫合結紮がカニューレの移行を緩和するために、ノッチに固定されていることを確認。 </li><li>換気回路に気管カニューレを接続します。 </li><li> LUを換気機械的に開始するために人工呼吸器の電源をオンにしNGS。 注：初期設定は2 CMH 2 O 4ミリリットル/ kg及び呼気終末陽圧（PEEP）の一回換気量となるように選択されたこれらの設定は、初期設定であり、臓器がエクスビボ灌流システムにしたら、実験条件に応じて調節することができる。 </li><li>胸骨/剣状突起を通して胸腔に入り、胸骨上切痕に向けて頭側続ける。肺に触れないように注意してください。 注：ラット肺が脆弱であるように、任意の不注意操作がトラウマと肺水腫（ 図5A）につながることができます。 </li><li> 2開創器を使用して、適切に解剖（ 図5A）を露出するために胸腔を後退させる。もう一度、肺に触れないように注意してください。 </li><li>わずかな上昇と鈍的切開と胸腺を削除します。 </li><li>下大静脈（IVC）または腸間膜静脈（MV）のいずれかを公開する側に腹部の内容をシフトします。 </li><li> IVのどちらかを切開CまたはMVは安楽死を提供し、ラットを放血する。 </li><li>肺動脈カニューレ（ 図5B）を固定するための準備として、肺動脈と大動脈の絹縫合糸の後方に配置します。 </li><li>右室流出路の前面2-3 mmの切開を作成し、切開および主肺動脈にカニューレを配置し、絹縫合糸（ 図5C）で固定します。 </li><li> （左心室へのアクセスを可能にする心尖を離断し、肺動脈を通って出胸腔に心尖〜を流すことによって、低K +電解質溶液15mlを肺血管系内の任意の塊をフラッシュ図5D）。 </li><li>肺動脈（PA）カニューレはEVLP回路に接続します。 PAカニューレの回路からの流入ラインは、心臓や肺に入る空気を避けるために、灌流液でプライミングされていることを確認してください。 </li><li>オンにするメイン蠕動ポンプと低い（〜2ミリリットル/分）に設定し灌流液が胸腔に肺動脈を通って、左心室から実行できるように高速化する。**重要なステップ** PA圧のようにスパイクしないことを確認これは、閉塞または貧しいカニューレ挿入します（ 図6）のいずれかのサインです。 </li><li>蠕動ポンプの電源を切ります。 </li><li>心室（ 図7）を中心に、心臓の後ろの絹縫合糸を配置します。 </li><li>僧帽弁を通って、頂部に外科鉗子の小さな対を挿入して左心房カニューレ挿入プロセスを開始し、左心房へ。 注：これは、僧帽弁を拡張し、挿管を容易にするであろう。積極的な拡張、または深すぎる拡張は、不注意に無効な調達をレンダリング左心房をlacerateすることができます。 </li><li>心臓から鉗子を外します。 </li><li>僧帽弁を通してと、少なくとも左に頂点に左心房カニューレを挿入しますバクテ。 </li><li>心臓（ 図8）の背後にある絹縫合糸で左心房カニューレを固定します。 注：この縫合糸はカニューレ挿入を容易にするための「プレ結ば」することができます。 </li><li> ex vivoでの肺灌流回路（ 図9A）に肺動脈カニューレを接続します。心肺ブロックが完全に体内から除去されるまでEVLP回路に左心房カニューレを接続しないでください。 </li><li>止血剤と食道をクランプし、食道が心肺構造の頭を上げるために使用することができるように（クランプと横隔膜の間）クランプの下にカット。 </li><li>ぶっきらぼうに周囲の組織を解剖し、それが食道（ 図9B）を介して提起されているように心肺ブロックを解放するために下行大動脈と補助血管をカット。 </li><li>気管カニューレに完全に無料心肺ブロックに頭側気管を横断する。 </li><li>指名打者で心肺ブロックと場所を削除するEVLP回路（ 図9C）上の位置をgnated。 </li><li>流出ラインに左心房カニューレを接続し、メイン蠕動ポンプ（ 図9D）を起動します 。 </li></ol>肺の4. 生体外灌流<ol><li>すばやくEVLP装置の上にハウジングの上部の通気ラインを挿入した後、EVLP装置の上部からベントラインを削除し、圧力センサとハウジングを取り付けます。 注：これは、換気データを記録し、圧力を監視することを可能にする。 </li><li>気泡（ すなわち 、空気塞栓）が肺に導入されないように、気泡トラップは灌流液の十分な量で満たされていることを確認してください。 </li><li>ゆっくりと、最初の15分の間に所望の実験のレベルに換気と灌流の設定を変更する。また、この最初のランプアップ段階中に、所望の速度および/または圧力の灌流の流量を増加させる。 注：プログラミング？肺の空間から流体の移動を容易に断続的なため息呼吸を、生産、したがって、浮腫の発症を遅延させるための人工呼吸器をる、推奨されます。これらは、ため息機能を備えた換気装置により製造することができる。 </li><li>換気パラメータは、2cmのH 2 Oで4ミリリットル/ kgで、PEEPの換気量であるときの時間として「時間0」を定義し、灌流パラメータは、彼らの期待レベルにあると一定のまま。 </li><li>必要に応じて、液体窒素中でサンプルポート、フラッシュ凍結から灌流液のサンプルを取り、サンプルの時間に注意してください。 </li><li>実験が完了すると、さらなる研究のためのソリューションを固定する際、液体窒素や場所に収集し、いずれかのフラッシュ凍結のために必要な解剖学的部分を分離する。 </li></ol>

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システム監視どのような事は、実験がうまく動作しているときのようになります。 カニューレは、回路内に配置されており、肺が換気されると、システムが正常に動作していることを確認するために、複数の方法があります。ラインを通じて灌流液の漏れがあってはならない。肺血管抵抗（PVR）は、（一定の流れを仮定して）比較的一定のままにしてください。酸素交換は、人工呼吸器が正常に動作し、ガス交換のためのより多くの肺胞を募集する肺を拡大されれば増加するはずである。 図12Aは、人工的な胸部内側EVLP回路に接続換気灌流肺を示しています。 実験がうまく実行されていないときは何の事は次のようになります。 EVLP実験の初期段階の間に発生率が最高であったいくつかの一般的な問題があります。最初と最も簡単なトンO救済策は肺から出たラインの漏れがある。これにより、回路の一部の下で灌流液をプールのプールサイドで顕著でかつリザーバ内のレベルが継続的に減少する。確認し、漏出区域周辺でチューブコネクタを締め、漏れのために管自体を検査。このリークが肺の前に発生した場合、それはまた、肺に気泡を導入することができる。灌流液中の気泡が組織の損傷をもたらし、PVRの顕著な増加の原因となるので、これは可能な限り迅速に改善されるべきである。また、肺またはカニューレの一つからの漏れがあってもよい。これは、カニューレのいずれかの滑りまたは圧力上昇を引き起こす出ラインの閉塞によって引き起こされる可能性がある。滑っていないか、ねじれもしていないことを確認するには、両方のカニューレのための位置を点検します。 PA圧力の瞬間的な増加が何らかの障害物が最近発生したことを明らかな兆候であるため、PAの圧力は、このプロセス中に監視されるべきである。 図12B高い圧力による破裂破裂肺を示しています。肺自体からの漏れはまた、組織における涙によって引き起こされ得る。この問題は、または修復可能であることが、カニューレを再配置し、増し締めすると、このシナリオでは最良の選択肢でない場合があります。 キーの学習ポイント/機会： 体験版とex vivoで肺灌流システムのエラーの開発は、私たちは私たちがEVLPシステムの効率的な実施を促進するため、ここで概説し、いくつかの重要な問題を特定することができました。まず、調達に関しては、それが（十分な麻酔薬、腹膜への注入）は、標準的な麻酔技術が適切に動物を麻酔するために従うことが重要であり、すべての動物実験委員会の方針の遵守が必要です。 （ 図13 A、B、およびCに示す）カ ​​ニューレ繰り返し肺vasculat内の任意の凝塊および/ ​​または破片を除去するためにフラッシュされるべきであるURE。動物の選択に関しては、我々は250〜350グラムの重さのSprague Dawleyまたはルイスラットを用いて提案する。 250グラムに近い体重ラットカニューレを挿入する際血管が小さくなるため、はるかに困難血管系を傷つけることなく、カニューレを挿入するのになるため、特別な注意が必要です。小さいラット、またはマウスモデルが使用される場合、より小さいカニューレを使用する必要がある。 気管挿管は、一般的に限り、縫合糸が最初に周囲の筋膜と前にカニューレ挿入に解剖した後に気管に絹縫合後方を通過させることによって、適切に確保されるように挑戦されていません。カニューレを渡すために1-2気管輪縫合上記前方切開でこれに従ってください。より良いセキュリティ（ 図4C）のための溝内にそれを確保するために気管輪の間に正方形の結び目を。肺動脈（PA）の挿管は、気管カニューレに比べてより困難である。以下の手順は、この研究で使用したこの手順のために。まず、ピンセットで心臓頂点を把握する。横静脈洞に鉗子の別のペアをパスし、近PAカニューレを固定するために縫合糸を通します。右室流出路（RVOT）（ 図14A）の直前に右心室を切開。 RVOTに切開した後、カニューレを肺動脈流出路に向かって導かれる。右ventriculotomy前に肺動脈/大動脈の後ろの位置に縫合糸を有する効率（ 図5C）が増加する。カニューレは、抜けを防止するために、縫合糸で所定の位置に固定する必要があります。 PAカニューレが正しい解剖学的向きではない場合主な合併症が発生する可能性があります。カニューレすぎ挿入され、一つだけの枝を灌流または胸腔から除去時に心肺標本のねじれでMAL-配置になることができる。これは、簡単にanatomiの適切な角度を維持するために元の位置に戻って配向させることができるCAL位置。最後に、左心房（LA）カニュレーションは、手続きの中で最も困難な部分です。 LAカニューレを左心房内に配置される必要がある。組織は非常にもろいもので、その後の実験はunsalvageableになるだろう肺静脈＆左心房内の涙を防ぐために、かなりの力やねじれを使用しないように留意する。 PAカニューレを最高のLAカニューレの前に配置されます。頂点の除去左ventriculotomyはcordaeの腱索を乱し、僧帽弁尖を通ってより容易なアクセスを可能にすることが示されている。また、ventriculotomyは、簡単に拡張し、僧帽弁を視覚化し、僧帽弁を通ってカニューレを養うためにすることができます。小平滑末端ピックアップ一対の僧帽弁輪の拡張をLA（ 図14B）に管を可視化するために行うことができる。縫合糸は、挿管の前に心臓の後ろに配置する必要があります。これはSmalの対を用いて心臓を持ち上げて簡単に行うことができますL個の平滑末端のピックアップと下に、心臓全体に縫合糸を配置する。 LAは現在、カニューレを挿入する準備ができました。適切に左心房カニューレの配置を可視化するためにピックアップを介してLAカニューレを供給する。バック左心室へのカニューレを剥がれないよう特に注意してください。縫合糸は、その後しっかりと左心室の心筋に沿って固定する必要があります。左心房に縫合糸の確保は全体またはカニューレの一部を閉塞する可能性があります。 手順の間、それは空気が装置の流入部に残っていないことが重要です。でも重要な空気が空気塞栓症は、与えられた圧力のためにはるかに低い灌流液の流れになりますPVR（効果的に「エアロック」）を増やす生成することができます。様々なポイントは、システム内の空気を除去するために用いることができる。流出部内の空​​気が予想され、肺に有害な影響を持つべきではない。肺高血圧症のための豚のモデルがされている8週間の期間にわたって連続的に空気を少量の病理を再現するために示す。周囲の組織19に炎症を引き起こすながら増加した空気は、灌流の存在量を減少させる。 灌流の開始は、カニューレ挿入が完了すると発生することができ、チューブがLAから来る前にEVLP線に接続されている。灌流液は、どの血の塊をクリアするために通過実行する必要がありますし、この灌流液は何の問題もなく胸壁に空にすることができます。マニュアルモードに灌流ポンプを切り替え、ゆっくり〜2mlまで流量を増加/分PA圧力の綿密なモニタリングを可能にする。 20〜30 CMH 2 O以上の圧力が障害物を示し、LAを終了する灌流液を監視することも指標であるが、これは見ることは非常に難しいことができます。圧力がO 2 CMH 20-30上に増加しない場合、ポンプを停止し、両方のカニューレ挿入を再チェック。圧力は約10〜20 CMH 2 O許す番目の定数になったらEの灌流液を2分間​​通し​​、胸腔に実行します。この時、LAからのラインはEVLP回路に接続することができる。灌流ポンプ速度5-10 ml /分まで増加させることができる。流体頭が回路を介して進行すると、流体による頭部の高さの増加、したがって、静圧にPA圧力の上昇があるでしょう。流体ライン内の最高点を越えて流れることができない場合は、ラインの反対側の端部に吸引力を適用したり、行の最も高い部分を低くしようとするいずれかの必要があるかもしれない。この問題が克服されると、灌流液は問題なく循環させる必要があります。 いくつかの問題は、人工呼吸器に関連して監視する必要があります。肺がより浮腫状になり、体重が増加するとまず、気管支/気管と心肺位置のねじれが発生することがあります。カニューレは、比較的近い解剖学的位置に維持することが、したがっていずれかまたは両方のカニューレを変更すること、が重要であるeが必要であり得る。圧力または体積制御ベンチレータならびに正または負の換気はこのEVLPシステムと共に使用することができる。ラットモデルでは、我々は正の圧力を使用して発見した、ボリューム制御換気はミリリットル/ kgの4-10間と2-8 CMH 2 Oとの間に正の呼気終末圧（PEEP）で一回換気量に適していますしかし、8 CMH 2 OのPEEPは、気管の分岐部に可能な破裂を引き起こす可能性があります。各実験（またはバックツーバックを行った場合の実験のセット）した後、気管に通じる換気ラインが気管を旅している可能性の気管支肺胞洗浄（BAL）液のクリーニングする必要があります。この流体はそのまま放置しておくと硬くなり、完全に換気ラインをブロックすることができます。 潅流液組成物は、成功したEVLP実験に重要です。 5％デキストラン混合物は、生理的条件に近い肺灌流が可能に流体Bを駆動するために安定した膠質浸透圧を維持浮腫を防ぐために血管系にACKおよび肺血管内の血栓症を防ぐことができます。これは、ラットのいくつかの種は、肺水腫20が発生する可能性がありデキストランにアレルギーがあることに留意することが重要です。灌流液の内容は、したがって、デキストランコンテンツは交絡因子であってはならない、この研究では、すべての実験グループ全体で一貫していた。浸透圧は、組織浮腫を改善するか、または発生する可能性がある重要な変数である。コー​​ルド静的記憶または正常体温灌流用に最適化された市販の灌流液、肺生存時間を増加させるために、このシステムで使用されている。当社は、これらのソリューションのいくつかは、アルブミンが含まれており、1懸念がげっ歯類肺における炎症反応の引き金ウシアルブミンの可能性があることに注意してください。最適な灌流液組成物は、調査の継続的な主題ですが、灌流液は、考慮に浸透圧と緩衝能を膠質浸透圧を取る必要がある。 Weは、溶液が変更されたクレブス - ヘンゼライト溶液または細胞培養培地に基づいてすることをお勧めします。浸透圧は、用途に応じて、デキストランまたはアルブミンによって維持されるべきである。灌流圧と流量は、臓器と前出·生理的な灌流パラメータは、機械的外傷に臓器が発生しやすいことができます影響を与えます。 実験中のビジュアルインジケータ： 多くの視覚的な手がかりと同様EVLP実験がうまく実行されているかどうかを決定するために使用することができ、リアルタイム·データからの指示がある。肺のサイズは同じままになり、すべての息の後に同じボリュームに収縮します。また、肺自体からの漏れはありません。 PVR、肺重量、およびコンプライアンスは比較的一定のままである。酸素の生産は一定のまま、またはわずかに増加します。 肺が実験中に侵害され、多くの視覚的な指標があります。肺は浮腫AになるNDは、サイズと重量で急速に成長する。液体の肺（黄褐色ピンクから白へ）変化やポケットの色が組織内で識別することができる。気圧障害から、または膨満上気管や肺が破裂した場合、傷害のポイント（ 図12B）からそこにバブリングされます。酸素の生産は減少し、PVRとコンプライアンスが劇的にも増加します。 そのようなげっ歯類などの小動物にEVLPモデルを使用しての可能性は、肺移植の治療を改善する将来の研究のための扉を開きます。しかし、小型の動物モデルは、本当に肺移植を模倣するためのより良い理解が必要です。このモデルは、医学的治療を改善し、将来の肺移植研究のためのベースラインパラメータを定義するために、将来的に使用することができる。

臨床的関連移植1を待っている瀕死の長期待機リストの時間につながる全国的に利用することができるという肺や患者のわずか19％と移植のために利用可能な適切な肺の不足は現在あり。不足が古いドナー、外傷、感染、マルチシステム臓器不全と収穫2時に時々負傷したドナーの肺に起因することができます。さらに、肺は胸腔と標準輸送や保存技術の外側の虚弱な器官が悪化し、非生存肺につながる可能性がある。したがって、肺の生存エキソビボを維持し、改善することは、最近肺移植医療における主要な焦点となっている。 ex vivoでの肺灌流（EVLP） ex vivoでの肺灌流（EVLP）を連続的に移植のために評価されている臓器を灌流するために進化し、そのすべての評価期間を可能にしています肺蘇生または再調整の可能性のためのOWS。 EVLPは身体器官虚血時間外に合計を延長し、寄贈し器官はさらに距離3を移動できるようにすることができます。一般的に、肺を30％から4〜50の吸入酸素（のFiO 2）の割合とピーク気道内圧の総肺容量の50％または20 CMH 2 Oで換気されている。保存溶液は、ヒトと大型動物5,6 40〜60ミリリットル/ kgで（100ミリリットル/ kgを予測心拍出量の約40％）で灌流されていますが、ラット7用の心拍出量の約20％で灌流されている。スティーン·ソリューションを含めることは、人間の肺は肺水腫9の開発することなく、RT環境で移動することができました。この先駆的な仕事は、トロント大学の肺移植プログラム10-13によって洗練されており、移植の14,15のための限界ドナー肺の改善された評価のために評価されている。しかし、最適ventilatio移植のための限界​​および/またはサブ標準肺を再生するために必要なnおよび灌流条件は公知であり、現在活発に研究されていません。 単離された肺の潅流システムは、肺損傷の原因の呼吸器疾患を再作成し、そして虚血性損傷を防止するために、異なる溶液で肺を灌流する小動物に使用されてきた。研究者らは、ヒトおよび大型動物16-18で使用することができるEVLPプロトコルを模倣する、単離された肺灌流システムを使用して、肺移植の小動物モデルを作成した。しかし、この実験モデルは、ヒトの生理機能を模倣するために使用される様々な技術およびパラメータに関して有する多くの課題を有している。特に、EVLP中に肺の生存能力を維持するには多くの微妙な点がある。これらの微妙な点が原因収穫技術、陽圧換気の設定、潅流液組成や流動条件と肺のカニュレーションの違いに発生する可能性があります。 THERお使いになる前、ここでの目標は、我々は齧歯類モデルでEVLPを実装するための堅牢な方法とリードを発見したトラブルシューティングと実装のヒントの数と研究コミュニティを提供することです。

<table><tbody><tr><td>IPL-2基本的な肺灌流システム</td><td>ハーバード装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット#5ステンレス鋼、湾曲11&nbsp;cm</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>IND500232</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット #5 Dumostar, 11&nbsp;cm</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS500085-A</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット #7 チタン、12&nbsp;cmチップ湾曲</td>ケン<td>トサイエンティフィックコーポレーション</td><td>INS600187</td><td></td></tr><tr><td>マクファーソン-バンナスハサミ8&nbsp;cm、Str 5&nbsp;mm</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS14124</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors 8&nbsp;cm Str 5&nbsp;mm</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS14003</td><td></td></tr><tr><td>インスツルメント滅菌トレイ 5インチ x 7インチ</td> <td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS800101</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン 30,000 ユニット/30 ml</td><td>APP 医薬品</td><td>OSU 薬局</td><td></td>から供給</tr><tr><td>ケタミン 500&nbsp;5&nbspあたりのmgml</td><td>JHPファーマシューティカル</td>ズ <td>OSU薬局</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 100から供給&nbsp;1&nbspあたりのmgml</td><td>Akorn</td><td>OSU Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>10&nbsp;CCインスリン注射器 29&nbsp;G x 1/2 "針</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Hyflex NBR</td><td>Ansell</td><td>S-17310M</td><td>Bite proof gloves</td></tr><tr><td>BL1500</td><td>Sartarius</td><td>Practum 1102-1S</td><td>Scale</td></tr><tr><td>Large Flat Bottom Restrainer</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat&nbsp;</td><td>注射用ラットトンネル</td></tr><tr><td>スターリングニトリルパウダーフリー検査用手袋、大型</td><td>Kiberly-Clark</td><td>50708</td><td></td></tr><tr><td>Rapidpoint 405</td><td>Siemens</td><td></td><td>血液ガス分析装置</td></tr><tr><td>Fiberoxygenator D150</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>PY2 73-3762</td><td></td></tr><tr><td>LabChart v7.3.7</td><td>ADInstruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>気管カニューレ</td><td>ハーバード 733557</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肺動脈カニューレ</td><td>ハーバード装置</td><td>730710</td><td></td></tr><tr><td>左心房カニューレ</td><td>ハーバード装置</td><td>730712</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ&nbsp;</td><td>Ismatec</td><td>ISM 827B</td><td></td></tr><tr><td>小動物用ベンチレーター モデル 683</td><td>ハーバード 装置</td><td>55-000</td><td></td></tr><tr><td>Ecoline Star Edition 003, E100</td><td>Lauda</td><td>LCK 1879</td><td>ウォーターヒーター</td></tr><tr><td>チューブ カセット</td><td>Cole-Parmer</td><td>IS 0649</td><td></td></tr><tr><td>コネクトキット D150</td><td>Cole-Parmer</td><td>VK 73-3763</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>ADInstruments</td><td>730045</td><td></td></tr><tr><td>TAM-A トランスデューサ増幅器モジュール タイプ 705/1</td><td>ヒューゴ・サックス - ハーバード装置</td><td>73-0065</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D トランスデューサ増幅器 タイプ705/2</td><td>ヒューゴ・サックス - ハーバード装置</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>灌流用SCPサーボコントローラ タイプ704</td><td>ヒューゴ・サックス - ハーバード装置732806</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFBAキャリア周波数ブリッジアンプ タイプ672</td><td>ヒューゴ・サックス - ハーバード装置</td><td></td><td></td>731747</tr><tr><td>VCMベンチレーター制御モジュールタイプ681</td><td>ヒューゴ・サックス-ハーバード装置</td><td>731741</td><td></td></tr><tr><td>TCM時間制御モジュールタイプ686</td><td>ヒューゴ・サックス-ハーバード装置</td><td>731750</td><td></td></tr><tr><td>IL2 灌流用チューブセット</td><td>ハーバード装置</td><td>733842</td><td></td></tr><tr><td>モイストチャンバー用チューブセット</td><td>ハーバード装置</td><td>73V83157</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンE-3603チューブ2.4&nbsp;mm ID</td><td>ハーバード装置</td><td>721017</td><td>灌流液ライン 肺に入る</td></tr><tr><td>タイゴン E-3603 チューブ 3.2&nbsp;mm ID</td><td>ハーバード装置</td><td>721019</td><td>灌流液ラインは、肺を</td></tr><tr><td>洗い流す</td><td>低カリウムデキストラングルコース溶液</td><td></td><td></td>を残します</tr></tbody></table>

孤立の方法<em&gt;エクスビボ</emラットモデルにおける&gt;肺灌流：ラットevlpプログラムの開発の教訓

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

肺移植のために利用可能な許容可能なドナー肺の数厳しく不良による品質に制限されています。 元ビボ肺灌流（EVLP）は、ヒトの肺移植は、臓器を評価し、ドナープールを拡張する機能を有効にすることで、より容易に利用できるようになることができました。この技術は、膨張して、潜在的に評価し、移植前に標準以下の肺の品質を改善する能力を向上させるように、重要な必要性がある。より厳密にこれらのアプローチを評価するために、再現可能な動物モデルは、寄贈肺の改善された技術のテストおよび管理のため、ならびに肺移植レシピエントを可能にするように確立される必要がある。また、関連する病状のEVLP動物モデル、 例えば、通気性肺損傷（VILI）では、これらの病態の治療を評価するための新規な方法を提供する。ここでは、この私にはラットEVLP肺プログラムと改良の開発を記述する将来の拡張のための再現可能なモデルを可能にTHOD。また、このEVLPシステムの適用は、ラットの肺でVILIをモデル化するために記載する。目標は、キー情報と「知恵の真珠 &quot;試行錯誤から生まれた、堅牢で再現性のあるEVLPシステムを構築に不可欠な/技術と研究コミュニティを提供することです。

データ取得プログラムを介して収集されたリアルタイムの機械データを容易に仮説の任意の数をテストするために分析することができる。例えば、 図10Aは、動物4ミリリットル/ kgおよび2の低換気量/低いPEEP CMH 2 Oで換気した60分10からのラット実験を通じて平均肺重量を示している実験を通して肺重量は非常に軽微な増加があるものの、この増加は統計的に有意ではない（ANOVA、pは= 0.92）。 図10Bは、12ラット実験から60分通る平均肺動脈圧（PAP）を示す。 0分の時点は、全ての実験の開始時に使用される低流量と換気設定の結果であり、tはランクで10分（ANOVAを=後PAPは、統計学的に有意な変化を、この時点の後のp一定のままで下側PAP = 0.89）。 図10Cは、12ラットから60分を通じて肺血管抵抗（PVR）を示している実験は、tは20分後にPVR =わずかな減少があるが、PVRは、統計的に有意な差は、この実験中に存在しなかった（ランクに関するANOVAのp = 0.65）。ここに示したPVRデータと比較して、野田ら 。 4時間時間をかけて少し増加するPVRを示している。しかし、それらの著者は、実験の開始の代わりに1時間から始まるPVR内のデータを報告し、標準偏差値が7を提供されません。野田ら 。また、そのように全く比較は、図10Aにここに提示されたデータで作成することができない4時間の実験のための肺水腫のデータが表示されません。野田らの主な違い。本論文で示されたものに比べて手順が含まれます：EVLP前LPS溶液中で1時間低温保存は、ラットが最初に彼らは無意識レンダリングするイソフルランを含むガス混合物で換気した、灌流液はメチルプレドニゾロン50mgのおよび50mgを添加したセファロスポリンの、合計フロリダ州フローが算出心拍出量の20％として定義された、灌流液試料を、肺を5分間、100％O 2の前に換気された実験が4時間実行された後でのみ採取した。 灌流液から実験中に採取されたサンプルは、多くの目的のために分析することができる。例として、 図11に、我々は60分で、炎症誘発性応答を誘導することができる方法高い一回換気量/高PEEP換気実証する。これらの実験のために、有害な条件下で換気4匹のラットからの灌流液を10ml / kgおよび8 CMH 2 Oの高いPEEP すなわち、高い一回換気量は、標準を使用してプロ-および抗炎症性サイトカインIL-1β、TNFαおよびIL4について分析したELISA法。サイトカインレベル換気前（0分）に比べて、 図11に示されるように、有害な換気の60分は、IL-1βおよびTNFα（炎症性サイトカイン）は、Aの統計学的に有意な増加をもたらした<html> ND IL-4の変化なし（抗炎症性サイトカイン）濃度。したがって、このEVLPシステムは一般に、機械的換気中に観察肺損傷プロファイルを生成することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig1highres.jpg" /> 図1.図と小動物ex vivoでの肺灌流（EVLP）回路の写真を。図中の文字は、写真に写っている文字と一致。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig2highres.jpg" /> 図2.すべてのトランスデューサは、しっかりとコントロールボックスに接続されている。&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig3highres.jpg" /> 図3.ラットの手術台は、しっかりとex vivoで肺灌流（EVLP）回路に隣接して設定されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig4highres.jpg" /> 図4（A）は、気管切開を露出させるために頭蓋になる。胸腔を露出していない。 （B）絹縫合糸は気管の後ろに配置されている。 （C）は、部分的に気管カニューレ挿入の準備のために切断される。 （D）気管カニューレをpositio内に配置される<html> Nと絹縫合糸で固定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig5highres.jpg" /> 図5（A）胸腔心臓および肺へのアクセスを許可するように引き戻される。 （B）肺動脈の背後に縫合糸を配置するための準備。 （C）肺動脈はカニューレを挿入し、以前に配置された絹縫合糸で結ばれている。（D）低K +電解質溶液は、どの血の塊を除去するために肺動脈を通って、左心房からフラッシュされます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig5large.jpg" target="_blank">拡大表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のバージョン。</a> &gt; &quot;lways <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig6highres.jpg" /> 肺をフラッシュすることは劇的に増加する肺動脈圧を引き起こす可能性がある場合は、図6は、肺動脈流を増加させる。カニュレーションが正しく実行され、大きな閉塞が存在していなかった場合、圧力は減少するはずである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig7highres.jpg" /> 図7.シルク縫合糸は、左心房のカニューレ挿入の準備のために心臓全体の周囲に配置されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> Nページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig8highres.jpg" /> 左心房カニューレ8図は、絹縫合糸で所定の位置に固定されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig9highres.jpg" /> 図9（A）肺動脈カニューレをエクスビボ肺灌流回路に接続されている。 （B）食道はクランプされ、結合組織を鈍的心肺ブロックを除去するために解剖される。 （C）心肺ブロックは、胸腔から取り出し、 エクスビボ肺灌流回路内に配置される。 （D）左心房エクスビボ肺灌流回路に接続されている。<html> HREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig10highres.jpg" /> 図10：ex vivoでの肺灌流た（n = 10）の60分を通して雄のSprague Dawleyラットの（A）肺重量。 （B） エクスビボで肺灌流た（n = 12）の60分を通して雄のSprague Dawleyラットの肺動脈圧。 （C） のex vivo肺灌流（N = 12）の60分を通して雄のSprague Dawleyラットの肺血管抵抗、NSは統計的に有意な差を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="&lt;/ HTML"><html> 「図11」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg&quot; /&gt; 灌流液中のプロと抗炎症性サイトカインの濃度に1時間のハイ回換気量（10ミリリットル/ kg）の時換気および高PEEP（8 CMH 2 O）の図11に及ぼす影響。N = 4、*で統計的に有意な差を示す0 hrサンプル（P &lt;0.05）に対して。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図12" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig12highres.jpg" /> 図12（A）EVLP回路に接続され、適切に換気と潅流肺。 （B）高い正呼気終末圧（PEEP）が負傷で形成し、人工的な胸部を埋めるために、気泡の原因と気管分岐部での涙の原因となる。<html> ES / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図13" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig13highres.jpg" /> 図13（A）肺動脈カニューレ。このカニューレを左心房のカニューレよりも小さい。 （B）アトリウムカニューレを残しました。このカニューレは、肺動脈カニューレよりもはるかに大きい。 （C）気管カニューレ。このカニューレは、絹縫合糸と気管の確保を支援するためのリブを有している。気管に挿入された端も少し気管にカニューレを挿入するのを助けるために指摘されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 09fig14highres.jpg &quot;/&gt; 図14（A）は、心臓の尖部は、右心室は肺動脈にカニューレを挿入するために切開されようとしているように、一対の鉗子によって保持されている。 （B）が小さい平滑末端のピックアップ一対の僧帽弁輪の膨張は、それが簡単に左心房への管を可視化することになる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig14large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ex vivoでの肺灌流（EVLP）臓器を評価し、ドナープールを拡張する機能を有効にすることで、より容易に利用できるようになるためにヒトでの肺移植を可能にした。ここでは、ラットのEVLPプログラムと将来の拡張のための再現可能なモデルを可能に改良の開発について説明します。

孤立の方法<em&gt;エクスビボ</emラットモデルにおける&gt;肺灌流：ラットEVLPプログラムの開発の教訓

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

本手順の目的は、再現性のある結果を得るための、一貫したラットex vivo肺灌流モデルを構築することである。まず、気管をカニュレーションし、人工呼吸を開始する。次に、肺動脈と左心房をカニュレーションする。最終ステップは、胸腔から心肺ブロックを取り出し、体外肺灌流回路に配置することです。最終的に、圧力センサー、重量トランスデューサー、および血液ガス分析装置を用いて、肺動脈圧などのパラメータを測定し、肺の状態をリアルタイムで示します。体外肺灌流は、肺移植のドナープールを拡大することを可能にした画期的な技術です。本技術を臓器評価のプラットフォームとして活用することで、移植に供される臓器の質を向上させ、移植成績全体を改善できると考えています。Copper研究室では、「臓器への武装（arming the organ）」という言葉を掲げており、これは臓器を評価・再構築・修復し、さらに改変を加えることで質を高め、それによって移植成績を向上させることを意味しています。私たちは、頑健で再現性の高いラットを用いたex vivo肺灌流の小動物モデルを開発しました。このビデオでは、灌流および移植研究のプラットフォームとして活用可能な、このex vivo肺灌流モデルを構築するための主要かつ重要なステップを実演します。まず、EVLP回路をセットアップし、システム全体に温めた灌流液を循環させます。温水バス、熱交換器、および人工胸腔を37 °Cに設定してください。実験において約6%の溶存酸素量を確保するため、ガスフィルターを介してPERFUSE 8に脱酸素ガスを流します。データ収集プログラムを起動した後、肺動脈圧トランスデューサー、気管差圧トランスデューサー、呼吸流量差圧トランスデューサー、肺重量トランスデューサー、およびポンプ速度トランスデューサーをA/Dコンバータボックスに接続します。最後に、手術台を設置し、処置に必要なすべての手術器具および消耗品を準備します。足指のピンチテストで鎮静を確認した後、麻酔をかけた動物を手術台の上に仰臥位で配置します。データ収集プログラムを使用してデータの記録を開始します。準備が整ったら、腹腔内に進入し、下大静脈にヘパリンを注入します。標準的な手順に従って気管にカニューレを挿入し、カニューレを人工呼吸回路に接続します。人工呼吸器を起動し、肺の機械換気を開始します。次に、肺に触れないよう注意しながら、胸腔を開いて肺を露出させます。胸腺を除去し、腹腔内容物を片側に寄せて、下大静脈または腸間膜静脈を露出させます。安楽死させた後、肺動脈と大動脈の後方に絹糸で結紮します。肺動脈カニューレを固定する準備として、右室流出路の前面に2〜3 mmの切開を加え、主肺動脈にカニューレを挿入します。絹糸で固定し、約15 mLの低カリウム正電解質溶液を肺動脈から注入し、心尖部から流出させることで、肺血管内の血栓を除去します。次に、心臓の後方および心室周囲に絹糸を配置します。僧帽弁を拡張させてカニューレ挿入を容易にするため、心尖部から僧帽弁を通り左心房へと小型の外科用鉗子を挿入します。準備が整ったら、僧帽弁を介して心尖部にカニューレを挿入し、左心房まで到達させます。シルク縫合糸で左心房カニューレを固定します。次に、肺動脈カニューレをEVLP回路に接続します。回路からの流入ラインにPerfuse 8が充填されていることを確認してください。心臓や肺に空気が混入するのを防ぐため、メインのペリスタルティックポンプを起動し、低速に設定します。これにより、Perfuse 8が肺動脈を通り、左心室から胸腔内へと流出します。肺動脈圧をモニタリングし、閉塞やカニュレーションの不良を示す急激な圧力上昇が起きないことを確認します。準備が整ったら、ペリスタポンプを停止させます。肺動脈カニューレを体外肺灌流回路に接続します。心肺ブロックを体から取り出すまで、左心房カニューレを回路に接続しないでください。止血鉗子で食道をクランプし、その下方を切断します。これにより、食道を用いて心肺構造物を鈍的に挙上させ、周囲の組織を剥離し、下行大動脈および分枝血管を切断して、食道経由で心肺ブロックを挙上しながら取り出すことができます。気管を切断して心肺ブロックを完全に分離し、EVLP回路の指定の位置に配置します。次に、左心房カニューレを流出ラインに接続し、ペリスタルティックポンプを始動させます。換気データの記録および圧力モニタリングを行うため、EVLP装置上部から換気ラインを速やかに取り外し、圧力センサー付きのハウジングを取り付けます。その後、換気ラインを再びEVLP装置の上部に戻します。バブルトラップに灌流液が十分に満たされていることを確認してください。開始後の15分間に肺へ気泡が混入するのを防ぐため、換気および灌流の設定を目的の実験レベルまでゆっくりと変更します。また、この初期のランプアップ段階において、灌流流量と圧力を目的の値まで上昇させてください。肺腔外への体液の移動を促進し、浮腫の発症を遅らせるために、人工呼吸器で間欠的な側臥位での呼吸を行うよう設定することが推奨されます。換気パラメータが、1 kgあたり4 mLの正圧タイダルボリューム、呼気終末陽圧2 cmのときを0時と定義します。H₂Oおよび灌流パラメータが期待されるレベルにあり、一定に保たれていることを確認します。必要に応じて、サンプルポートから灌流サンプルを8つ採取し、液体窒素で急速凍結させ、サンプルの採取時間を記録します。実験終了後、回収に必要な解剖学的部位を分離し、液体窒素で急速凍結させるか、さらなる解析のために固定液に浸します。雄のSprague Dawleyラットの肺重量は、ex vivo肺灌流開始後10分が経過した後は、60分間にわたり有意な変化を示しませんでした。また、肺動脈圧にも変化は見られませんでした。同様に、肺血管抵抗も試験期間を通じて変化しませんでした。高回量の一回換気量および高PEEPでの1時間の換気後、PERFUSE 8において前炎症性サイトカイン濃度は上昇しましたが、抗炎症性サイトカイン濃度に変化は見られませんでした。このビデオを視聴することで、研究室でラットを用いた小動物体外肺灌流モデルを確立するために必要な主要な手順を十分に理解できるはずです。

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このビデオは、孤立した肺灌流のためのex...

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