高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

次の実験の目標は、透過型電子顕微鏡で高分子を凍結した状態の画像化できるようにすることです。これは、サンプルを含むグリッドを極低温物質にフラッシュ突っ込み、薄いガラス化試料を得ることによって達成されます。第2のステップとして、サンプルを電子ビームにさらし、マクロ分子の投影画像を形成します。

次に、高分子の3D再構成を得るために、画像をコンピュータ上で処理します。その結果、高分子の非常に詳細な3次元構造、その確認、およびその分子パートナーの3次元位置が示されました。この技術には、電気顕微鏡用のサンプル調製の他の方法の主な利点があります。

クライオでは、画像は高分子内の電子によって直接形成されます。これは、より忠実に、その近くのネイティブ構造を反映しています。この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

クライオグリッドの準備と電子顕微鏡に転送されるものは、極低温で作業する場合の追加の複雑さのために習得するのが困難です、ウォームアップサイクルは、ポンピングシーケンスの開始時とクライオEMセッションの後に使用されます。この手順を開始するには、クライオホルダーをポンプステーションのポンプポートの1つに挿入します。ウォームアップサイクルオプションを開始します。

コールドステージコントローラーで、バタフライバルブV 2を開き、ターボポンプステーションの真空が安定してマイナス3ツアーに10を読み取るか、バタフライバルブV 1を開く方がよいでしょう。ホルダー内の温度が室温以上で安定し、ウォームアップサイクルが完了すると、ウォームアップサイクルが完了します。Vを1つ下げてサイクルを停止します。

次に、ze light cycleオプションを開始し、10の1〜2倍からマイナス4の範囲で良好な真空度を達成するために必要な時間を選択します。真空度が10からマイナス3に達したら、DU排気バルブB 3とクライオホルダー上のバルブを開きます。サイクルが完了したら、バルブを開いた順序と逆の順序でバルブを上昇させます。

ピンセットを使用して、MICAの一部を残して2つの新しい表面を露出させます。新しく露出した雲母の表面を上にして、ペトリ皿の白い紙の上に置きます。ペトリ皿をカーボンエバポレーターのBEジャーに入れた後、真空度がマイナス6になるまでポンプダウンシーケンスを実行し、カーボンの薄層でマイカをコーティングします。

次に、薄い炭素をグリッドに移します。0.5 x 1センチメートルのコーティングされたマイカ片を、ろ過された脱イオン水の平らな表面にカーボンを浮かべます。ピンセットを使用して、グリッドの聖なる炭素側を浮遊炭素層の上面に接触させて

カーボン面を上にして、パワーフィルムで覆われた7.5 x 2.5cmのスライドガラスにグリッドを置きます。次に、スライドガラスをグロー放電装置のチャンバーに入れ、チャンバーを閉じます。ベルジャーをポンピングして光らせます。

25ミリアンペアで20秒間放電し、マイナス2ミリバールまで10の7倍で放電します。この時点で、プランジ凍結装置の電源を入れます。リザーバーに液体窒素を充填して、イーサン容器を引き下げます。

液体窒素の沸騰が止まったら、イーサンタンクからのチューブの先端を内部チャンバーに置き、バルブを非常にゆっくりと開きます。内部チャンバーでエタンを液化し、上から1ミリメートルまで充填します。湿度をオンにします。

次に、ピンセットにグリッドをロードし、3〜5マイクロリットルのサンプルをホーリーグリッドのカーボン表面にロードします。サンプルがグリッドに吸収されるのを待った後、ブロッティングを行います 薄い液体層を赤面させるには、グリッドを液体エタンに突っ込んで凍結します。ピンセットグリッドアセンブリを液体エタンから慎重に取り外し、液体窒素を含む外側のチャンバーに移します。

次に、グリッドを液体窒素に浸した小さなグリッドボックスに移します。この時点で、クライオホルダーをクライオトランスファーワークステーションに挿入します。クライオホルダーとワークステーション容器の実行者に液体窒素を入れます。

凍結した水和グリッドが入ったクライオグリッドボックスをワークステーションの液体窒素にすばやく移します。クライオグリッドボックスを開けた後、凍結した水和グリッドを取り出し、サンプルホルダースロットに入れます。次に、クリップリングをグリッドの上に置き、クリップリングツールの鈍い端で、所定の位置にしっかりと固定されるまでそっと押します。

次に、クライオシャッターを閉じます。TEMの抗汚染剤を液体窒素で補充します。顕微鏡ステージをマイナス60度に再度傾けます。

これに続いて、顕微鏡でPrepUエアロックサイクルを開始します。ポンプのエアロックシーケンスが終了したら、合唱団のホルダーをエアロックに挿入し、コールドステージ制御コードをホルダーに接続して温度を監視します。赤色のライトが消えたら、ホルダーをゼロ度の位置に回転させて、T EMの高真空カラムに挿入します。

クライオシャッターを引っ込めて、カラムバルブを開きます。検索モードで低線量プログラムをアクティブにします。ステージを中央に配置し、アルファウォブラーを使用してステージを±15度揺らし、適切な穴を選択してXYステージコントローラーでフィールドの中央に配置します。

フォーカスモードに切り替えて、画像にピントを合わせます。次に、0.5〜4.5ミクロンの画像に焦点が合っています。露出モードに切り替えて、画像を録画します。

最後に、検索モードに戻って次の穴を選択し、シーケンスを繰り返します。ここでは、構造特性の異なる4つの代表的な標本について、ネガティブ染色とクライオ電子顕微鏡の方法によって得られた顕微鏡画像を比較し、陰性染色したアデノ随伴ウイルスカプシドはウイルス様粒子を明らかにし、クライオ電子顕微鏡はそれらが空であることを示しています。タバコモザイクウイルスの画像は、ネガティブ染色では中央チャネルが汚れで満たされ、クライオEM画像では空になったらせん状の棒を示しています。

KLHは、ネガティブ染色とクライオEM画像の両方で6つの縞模様を示す特徴的なバレルに集合します。長方形の側面図と円形および図では、オジン受容体のクライオEMによる構造で空であることが明らかになります。中央の十字や中央のくぼみなどの複雑な表面の特徴は、ネガティブ染色による汚れの蓄積として、クライオ電子顕微鏡による低密度領域として現れます。

クライオ電子顕微鏡アーティファクトの典型的な例は、結晶性氷、氷汚染、乱視、およびウェブ状構造です。凍結水和イオン受容体1の単粒子解析と3D再構成により、その4重対称構造が明らかになりました。細胞質ドメインは正方形のプリズムを形成し、いくつかの再現性のある眼球ドメインを含み、足場のような構造を形成します。

10オングストロームの分解能では、α HELOCを3Dで可視化することができ、差分マッピングにより重要なリガンドの位置を明らかにすることができます。確認による変化により、高分子のダイナミックなビューが得られます。

このビデオを見れば、高品質のクライオEMサンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。クライオ電子顕微鏡と画像処理を組み合わせることで、研究者は高分子マシンの構造サブユニット組織とコンフォメーションダイナミクスを探求することができました。