Name: 薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ組織浴槽を用いた単離平滑筋の等尺性収縮測定法。ラット大動脈リングを用いて受容体機能と薬理学的応答を評価し、平滑筋の動態と創薬研究への応用を解明します。

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ワッツ研究所、そして20年以上前にこのアッセイを教えてくれたマーリーン・コーエン博士とキャシー・シェンク博士。 NIGMS R25GM074119、2005年から2013年までMSUのキャンパスで開催された統合およびシステム薬理学の短期コースのこの教育モジュールの開発を支援しました。

注：この論文で説明されているすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって確立されたガイドラインに従って実施されている。 1.システム準備とセットアップ<ol><li> 50ミリリットル組織浴に使い切る組織浴収縮実験に必要な量である生理食塩水（PSS）の5 Lを作る。 PSSレシピについては、表2を参照してください。組織浴時間風呂のボリュームの数を乗じた後、必要な組織洗浄の回数を掛けることによって、総必要容量を計算します。 <ol><li> PSSを作るためのガイドとして、表2を使用してください。水の約4リットルに塩を溶解。注：HPLC - タイプIの水が推奨されます</li><li>エンド·ソリューションは、1.6 mMのカルシウムであるので、この溶液に（二水塩を使用している場合147グラム/ L）1 M CaCl 2溶液の8ミリリットルを追加します。 </li><li> 5 Lに量子sufficit PSS溶液</li></OL&gt; </li><li>再循環加熱した水浴をオンにして37℃に組織浴システムを予熱する。重要なステップ：システムの各構成要素は、それらが互いに直列に接続されていることを確認し、水ジャケットである。流れの方向は非常に重要です - 水が最高有刺鉄線接続で最低の有刺鉄線の接続に出入り各コンポーネントに流れ込むことを確認してください。 </li><li>データ収集システムの電源をオンにします。温度を平衡化するための実験の前に少なくとも力変換器の電源をオンにし、15分。 注：ほとんどの力変換器は、温度の変化に敏感である歪みゲージを採用し、電源投入後、最初に熱ドリフトを示す。 </li><li>発射データ収集ソフトウェアおよびデータ収集システムとの接続を確保する。データの記録を可能にするための製造指示に従ってください。 </li><li>力変換器は、組織が組織浴中に、データ記録が開始されたの前に配置される前に校正されていることを確認してください。 FOキャリブレーションのための製造業者の指示LLOW。 </li><li> 95％O 2/5％CO 2医療グレードのガスボンベに組織浴システムを接続し、ガス漏れをチェックしてから、システムを加圧する。 </li><li> PSSで組織浴のリザーバを記入し、解析時間が最適な温度に到達することができます。プライムシステムとシステムとチューブ内の気泡を除去する。 </li><li> PSSバッファを含酸素化合物と実験中に組織浴中に導入される薬を配布するためにブラウン運動を提供一貫性のあるソリューションの通気を確保するために組織浴エアレーターを確認してください。曝気/気泡がデータの記録が中断され、組織の動きを、発生しないことを確認してください。必要に応じてガス流を減少させる。 注：組織浴とデータ収集システムは現在、実験を開始する準備が整いました。 </li></ol> 2.組織の準備<ol><li>理想的には、私を使用して直接配置する直前に動物からの組織を解剖PSS Ntoを。 注：一部の組織は、4℃で一晩PSSに保存することができますが、適切なコントロールは、長期保存後の組織機能を検証するために行われなければならない。第6節を参照してください。 </li><li>この演習で組織として胸部大動脈を使用してください。 </li><li>施設のガイドラインに従って、ラットを麻酔し、ラットの背側を下に置きます。つま先ピンチとこの痛みを伴う刺激に対する反射応答の損失を経由して麻酔を確認してください。 注：このプロトコルは、腹腔内注射によって送達ペントバルビタールの70 mg / kgをを使用しています。齧歯類麻酔のための制度のガイドラインが異なる場合があります。 </li><li>胸郭の下部にダイアフラムに沿ってハサミで切開を作成することにより、気胸を作成します。次に、胸骨に胸郭の底部から切開を継続し、二分。 </li><li>離れて解剖や脊柱の上にあるそれらの臓器を脇に置き、脊柱に沿って直接位置する大動脈を、見つける。 注：このは、STEPは、大動脈を切開する明確な作業スペースを提供しています。 </li><li>大動脈へのすべての接続を切断。食道、肺、などから、振動板のレベルで脊椎に垂直な大動脈を切った。 </li><li>静かに鉗子で大動脈を保持し、背骨から大動脈を切開するはさみを使用しています。心臓に向かって背骨と仕事に隣接する下部振動板面積で解剖を開始します。組織が損傷することがあり大動脈組織、引っ張ったり綱引きしないように余分な予防策を取るようにしてください。 </li><li>すぐにPSSを含む準備された解剖皿に大動脈を置く。 注：リングに大動脈の解剖が最高の黒シラスティック基盤を持って、解剖皿に行われます。これは、解剖皿内ながら安定性を提供し、大動脈にカニューレを挿入するために用いることができ、皿に固定されるワイヤの使用を可能にする。黒の背景には、解剖を補助するコントラストを提供します。ケアは、内皮としてカニュレーションのワイヤの使用に注意が必要ですIAL細胞層は血管の内腔に対するワイヤの過剰なラビングを用いて除去することができる。 </li><li>ワイヤーを取り、一方の端に小さな90°の角度を作り、ガイドワイヤを固定するシラスティック基盤に角度付きの端を押してください。解剖皿に全体の大動脈を置きます。 </li><li>ピンセットで、ガイドワイヤの端を持ち、ゆっくり大動脈の内腔にワイヤーを通します。 </li><li>鉗子を使用して、ワイヤ上に大動脈をスライドさせます。ガイドワイヤの自由端を穏やかに湾曲ワイヤ、表示され、組織を安定化するために皿のシラスティックファンデーションに自由端を配置する。 </li><li>胸部大動脈は、白とやや繊維質表示されるまで、小さなvannasハサミやピンセットを使用して、血管周囲脂肪組織および他のすべての余分な組織、血の塊などを削除します。 </li><li>ワイヤからきれいに大動脈を取り出し、幅約3〜5ミリメ​​ートルである環中の大動脈をカットするはさみを使用しています。 </li><li> tiの対の一方に大動脈輪を配置フックを保持し、静かにフックの上にリングをスライドさせる鉗子を使用して、ssueフック。第2フックと、このプロセスを繰り返します。フックがもつれないように注意してください。 図3を参照してください。 </li><li>各フックは付属の異なる絹縫合糸を持っていることを確認してください。他は手で結ば力変換器になります10〜4センチメートルロングピース縫合糸である、一方のフックは、ガラスやステンレス製の棒への取り付けが可能に絹の小さな結び目ループを持っていることを確認してください。 図3を参照してください。 NOTE：大動脈をフックに固定されると、組織は組織浴に装着する準備ができている。 図3を参照してください。 </li><li>繰り返しは、第二組織浴室において第二大動脈リングをマウントするために、2.14から2.15繰り返します。 </li></ol>バースの3組織の配置<ol><li>このシステムでは、組織浴自体が静止していることに注意してください。この時、温め、曝気PSSで組織浴を記入し、溶液がtemperaturに来てできるようにするE。 </li><li>絹縫合糸で、ステンレス鋼ロッドにペグに組織標本上のフックの1つを結びつける。組織浴室にこのエンドを置きます。リングスタンドにロッドを接続し、バッファに浸漬組織を維持するために、PSSで満たされた染色皿の中もう一方の端を置く。 図3を参照してください。 <ol><li>組織浴室においてロッドと組織を置き、組織が完全にPSSに浸漬され、ロッドが安全であることを確認してください。 図3を参照してください。 </li><li>力変換器に他の縫合糸を結ぶと組織と力変換器との間に縫合糸のたるみを残すようにしてください。 注：このたるみは、マイクロメータを調整することにより、削除されます。 図3を参照してください。 </li></ol></li><li>第二大動脈リングと組織浴室のためのこれらの手順を繰り返します。 </li></ol> 4.パッシブテンションを設定する注：各組織は、平滑筋細胞は最適値に応答する時の長さ（ロー）を有するLLY。予備実験は、個々の組織タイプのために実行する必要があり、この長さは、検査されるべき実現する最適な延伸張力を決定する。ラット胸部大動脈は4グラムの最適な受動的なストレッチのテンションを持っています。 <ol><li> 2グラムに張力を高め、プラトーに到達するために組織を待つためにマイクロメータ/ラック＆ピニオンを使用してください。高原に達すると、テンションに別の2グラムを高め、高原に組織を待つ。 注：2グラムの初期張力が設定され、プラトーに達した後、大動脈輪では、組織はその後〜1.6グラムに緩和すべきである。 2グラムの第2の適用は、組織が再びリラックスし、緊張が低下しているから〜3.6グラム、に組織をもたらすだろう。従って、トータルテンションを4g加えた後、ソフトウェアは、張力の約3.2グラムを示すべきである。 </li><li>第二大動脈リングと組織浴室のためのこれらの手順を繰り返します。 </li></ol> 5.平衡医薬品メイキング<ol><li>のための組織を平衡化する組織への受動的な張力を付与した後60分。 </li><li>平衡相の間に、組織ごとに15〜20分洗浄する。組織槽を排出し、温め容器からPSSにPSSを交換してください。 注：この時間の間に、組織は、受動的な緊張の喪失によって示されている、リラックスします。 </li><li>この時間の間、そのように薬剤ストックのごく容積が所望の濃度を達成するために必要とされ、浴中の実際の濃度よりも少なくとも1,000倍より濃縮する必要が実験のための薬剤を調製する。 </li></ol> 6.最初のチャレンジ<ol><li>平衡期間の終わりに、組織を最後に1回洗浄し、データを保存し、再ゼロすべての入力。 </li><li>組織が応答する（アクティブ収縮の原因となる化合物）アゴニストを選択してください。 注：ラット胸部大動脈では、動脈平滑筋を積極的に原因の神経支配にαアドレナリン受容体作動薬に収縮する交感神経系による組織。アドレナリン作動薬は、アドレナリン作動薬が弛緩を引き起こすことを考えると、腸組織において有用ではない。この場合には、アセチルコリン（コリン作動性受容体）などの受容体アゴニストを使用することができる。フェニレフリンおよびアセチルコリン両方の代替は、第1のチャレンジなどの高カリウム（K）などの非受容体アゴニストを使用することである。平滑筋では、高K間接的オープンカルシウムチャネルに動作し、したがって、平滑筋の完全性の一般的な指標と見なされる。 <ol><li>組織浴に10 -5 Mのフェニレフリンを追加することによって、最初の課題やウェイクアップ挑戦を実行します。 50ミリリットルの組織浴にこの濃度を達成するために、10 -2 Mのフェニレフリン溶液50μlを加える。 注：PSSの50ミリリットルに50μlを1 / 1,000に希釈され、最終的な濃度が1,000倍株式未満、または10 -5 Mである組織浴C内のボリュームとボリュームの一貫性の維持管理の知識hamberは、最終薬物濃度を決定するために重要である。 </li></ol></li><li>データの勾配がゼロになったときに、組織浴に10 -5 Mのフェニレフリンを追加し、ピーク収縮を可能にし、その後プラトー。ポスト実験解析を支援するために、各実験イベントを記録するようにしてください。 </li><li>高原の後、新しいPSSと組織浴室を空にして再充填することによって徹底的に作動薬を洗い流す。同様にこれらのイベントを記録するようにしてください。 注：経験則は、浴中のアゴニストの濃度は、各洗浄で10倍に減少することである。なお、以上の3〜4回の洗浄が戻ってダウンしてその平衡ベースライントーン（テンション）に組織を持参する必要があるかもしれない。 </li><li>先に進む前に〜10分間のベースラインのトーンでの組織残りをしましょう​​。 </li></ol> 7.実験 NOTE：プラゾシン、αアドレナリン受容体アンタゴニストは、濃度応答受信シフトする組織浴室に導入されるオンセ曲線フェニレフリン（PE）へ。これは明白な拮抗作用である。 <ol><li> 1バスに、プラゾシンを溶解したビヒクル（H 2 O）を添加する。別に、プラゾシンの適切な濃度を追加します。この例では、5×10 -9 Mまたはバスで5 nMの濃度を達成するために、他に1バス、プラゾシンの10 -5 Mの濃度の25μlに車両の25μlを添加する。 注記：車両の添加は、この例では、不要と思われる一方で血管作用である可能性がある他の車両使用時に、そうすることが必須である（ 例えば、DMSO、エタノール、酢酸塩）。それは血管作動性であるために少し証拠が存在する場合でも対応する車両を追加します。 </li><li>浴中の車両/プラゾシンのままにして、1時間のために組織を洗っていません。 <ol><li>組織が平衡化されていますが、作動薬（PE）の複数の濃度を準備。 例えば、&lt;応答を誘発しない濃度（より広い範囲の濃度を含む/ em&gt;の10 -9 M PE）最大応答（ 例えば、10 -4 M PE）を上回る濃度に。濃度-応答曲線は自然対数であるため、10 -1 Mのストック溶液から連続希釈を介してPE（10 -6〜10 -1 M）の6つの別々のストック溶液を作る。各濃度のために必要なボリュームがすべて風呂（ すなわち &gt; 300μl）をするために必要なトリプル総量よりも若干大きくなっていることを確認します。 </li></ol></li><li> 表1に記載されるように、作動薬の追加に進みます。 注：この実験は、PEに累積濃度応答曲線を生成します。各反復は、物質の量は、既に浴に添加考慮する。彼らはもはや収縮を増やす、または全体の曲線がプラトーするまで追加は発生しません。 <ol><li>組織のしきい値に達するまで、個別に各薬物濃度を追加する。 </li><li>変化が発生しない場合、次の濃度を追加シリーズ; 表2を参照してください。 注：これらの追加のタイミングが使用される作動薬に依存します。例えば、ノルエピネフリンおよびフェニレフリン収縮が急速に発達し、数分以内にプラトー必要があります。これとは対照的に、エンドセリン-1収縮はゆっくり開発し、近くに45分間プラトーない場合があります。他の実験限り、このような曲線の構築後の組織で行うことができる（1）物質の洗浄うち。 （2）それは、組織が正常な収縮挙動に戻り、以前の刺激に影響されないことを実証することができる。 </li></ol></li></ol> 8.データ解析<ol><li>前と介入後すぐにデータを保存してください（ 例えば、ウェイクアップまたはフル曲線）。 </li><li>検索してデータ分析を支援する各組織浴室/入力チャネル、のための組織ベースラインを設定。 </li><li>ベースラインが設定されると、各濃度について最大応答を見つけ、ちゃんを記録ベースラインからのGE。順次濃度のそれぞれを通って移動し、ベースラインシフトを記録。 </li><li>得られたデータをグラフ。すべてのグラフのプログラムでこれを行います。 注：グラフパッドプリズムは薬理学者のために設計され、これはここに提示され、実験のタイプに最適です。 </li></ol>

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著者は開示するものは何もありません。

研究ツールとしてアイソメトリック力の測定は、150年以上の歴史ですが、それは収縮組織2における受容体の特徴付けのためのプロトタイプ的な技術であり続けている。この技術のパワーは、その単純さと汎用性である：アンタゴニストの存在下または非存在下でのアゴニストの濃度を増加させることにより誘発応答を記録することによって、情報の無数の各薬剤の薬理学的特徴との受容体について導出することができるそれは3-5にバインドします。このタイプの実験を使用してもアンタゴニストの非競合的性質に対する競争力、ならびに受容体の不均一性および非特異的薬剤効果6-8についての情報を集める。したがって、この単離された組織浴実験の簡単な順列で、アゴニスト誘導性の筋収縮を媒介する受容体の比較的完全な薬理学的プロフィールを生成することができる。 作動作用の面では、目所定の組織におけるアゴニストの電子相対効力（E MAX）及び効力（EC 50）を計算し、同じ組織1内の他のアゴニストの応答と比較することができる。我々の実験では、ラット胸部大動脈は、車両または組織浴にα1アドレナリン作動薬のフェニレフリンを添加し、収縮を生成する前に、1時間のためのα1アドレナリン受容体アンタゴニストプラゾシン（5 nM）のいずれかと共にインキュベートした。2プレゼント修正された結果を図図1の。緑の応答は、PEによって達成される最大収縮にマークされている最大、などして、その応答を引き起こしたPE濃度に関連したとしてマーク½最大収縮としてマーク。これらの値を特定する半最大（50％）応答またはEC 50値を達成するアゴニストの有効濃度を識別している。 残念ながら、アゴニスト依存パラメータを使用して、受容体結合特性が9を複雑になることが決定するために、一人でね。アンタゴニスト解離定数（pK aはB）の-log 10モルアンタゴニストの-log 10：理想的には、レセプターアンタゴニストを使用する追加の実験は、薬物と受容体との間の相互作用を定義するための鍵である2つの重要なパラメータの計算を可能にする濃度-応答曲線（pAの2）10の2倍の右方向シフトを誘発するのに必要な濃度。 K BとのpA 2ゲインそれらはアゴニスト独立した値であり、さらに異なる組織11との間で一定のままであることから、その有用性の両方。 図2のデータから、pK aはBは以下の式を用いて計算することができ、他の場所で計算されたEC 50値に基づく。 プラゾシン= 2×10 -8 Mの非存在下でのEC 50 前でのEC 50プラゾシンのSENCE = 7×10 -6 M 次式でK Bについて解く： ログイン（DR-1）= [B]ログ- K Bを記録 ここで： [B] =アンタゴニストの濃度は、5×10 -9 M.ログ（5×10 -9 M）= -8.3 DR =非存在下での拮抗薬/ EC 50の存在下でのEC 50値の用量比。右方向へのシフトがある場合、この値は1よりも大きくなる。このように： ドクター= 7×10 -6 M / 2×10 -8 Mまたは700×10 -8 M / 2×10 -8 M = 2分の700 = 350 [B]とDRのために代入すると： （350-1）のログ= -8 -ログK B 2.54 = -8 - KBを記録 のpK B = 10.54 プラゾシンのこの値は、プラゾシンは、α1アドレナリンRECEPTと対話するときに得られた値と一致しているフェニレフリンに収縮を仲介するアドレナリン受容体は、α1アドレナリン受容体であることを示唆または12,13、。 いくつかのステップは、これらの実験の成功に不可欠である。組織は、組織の生存率の低下を防ぐために、解剖後にPSSに残る必要があります。任意の等角筋標本は、受動張力14,15に対して最大の力を発生させる最適な長さ-張力の関係を有する。このプロトコルに記載した実験のために、最適な受動的張力が以前に簡単に組織への受動的張力を0.5gずつを加算することによって決定した。組織は、トーンなしで始まるべきであり、その後、平衡の30分後、組織を活性のトーンを生成したKClを最大濃度（80 mM）を、でチャレンジした。次に、組織を洗浄し、ベースライントーンに戻した。ベースラインで15分後、受動的張力の別の0.5gを入れ、このプロセスのプラトーまで繰り返すアクティブテンションが追加の受動的なテンションで達成された。予備実験では、受動的な張力の4gの合計は、大動脈環に最大活動張力の発生を達成するために決定されたので、テンションのこの総量は、前平衡にリング上に配置される。手続き的に、それは前に受動張力付与をゼロにするのがベストですが、実験前にいつでも行うことができます。過ストレッチ組織、実験や解剖の任意の時点で、否定的に組織の生存と実験の成果に影響を与えます。このステップは、過剰なストレッチの最も尤度を持つように、浴中に組織を配置する際にこれが最も肝要である。数と期間における適切な洗浄は、再現性の効果のために必要とされる。第二の課題は、あまりにも早く組織がベースラインテンションに戻ってきた最初のチャレンジの後、または前に、異常な応答になります。可逆拮抗薬/阻害剤を研究した場合、組織はinhibiとして、さらに、アゴニストの前に洗浄されるべきではないター濃度が低下する。 孤立した組織浴アッセイに注目すべき長所と短所があります。 短所：組織は、フック上のリングの外科的除去または配置時の損傷の程度が異なることがあります。内皮細胞は、大動脈リングの内側のライニングであるため、この細胞層を損傷しないように、注意がフック上のリングの配置に注意する必要があります。組織はまた、組織浴中で生存可能である、時間の明らかに異なる長さを有していてもよく、これは、決定されなければならない。ていないすべての組織が同じである。この線に沿って、組織がタイムコントロールは、すべての実験のために必要な制御になるように一日を通して彼らの応答性に変更されることがあります。この良い例が、一般的な8時間の実験中に100パーセントによって収縮最大に向上させたモルモット気管です。水に難溶性である薬物は、PSSに析出することができる。最後に、累積ANDアゴニストに対する受容体脱感作が発生した場合、アゴニストは異なる結果になる可能性がある薬剤の非累積加算。アンジオテンシンIIは、迅速なタキフィラキシーを示しているそのような薬剤である。 利点：組織浴実験の主な利点の1つは、リアルタイムであることである。一つは、それが繰り広げられると急速に結論と計画の次のステップを作ることができるように実験を参照してくださいだけでなく、実験中にトラブルシューティングを行うことができます。実験を行うのは一日かかります。複数の組織は、典型的には、動物自身の対照としての役割を果たすことができるように、1つの動物から調製することができ、それは、実験に強度を付加する。薬剤に対する組織の比較的純粋な応答を試験するように、一つは、他の要因から組織を単離することができる。そのような組織浴システムのようなインビトロ実験はまた、 インビボでの実験と比較して、少量の薬物の使用を可能にする。 ここに説明した基本的な実験計画をすることができます広範囲に追加のパラメータの記録または他の外部刺激の導入を可能にするように変更。例えば、電極の添加は、神経支配する神経16,17の電場刺激を可能にする。熱またはpHプローブを添加して、収縮反応に対する温度及びpHの効果も18,19を計測することができる。同様に、酸素は、低酸素症誘発性効果を評価するためにN 2で部分的にまたは完全に置換することができる。また、このビデオで使用される等尺収縮性測定の同じ基本的な原理は、等尺性張力の発生および細胞内カルシウム20の変化の同時測定を可能にするシステムを開発するために使用することができる。システムは、それが迅速に応答中に組織試料を凍結すること存在するため、シグナル伝達はまた、容易に、研究され、シグナル伝達経路系の活性を生化学的に検証することができるようになっている。 EQUのバリエーションこれを行うために使用することができipmentは膨大である。このシステム全体を構築または自動のどちらか一方は、複数の異なる企業から購入することができる。このプロトコルで使用される組織浴および組織ホルダーは、社内のミシガン州立大学の機械工場によって手吹き（組織浴）と手を構築（保有者）であった。

薬理学の規律は、150年以上にわたって孤立した組織浴システムを使用しています。このシステムの汎用性は、高血圧、心不全、糖尿病、胃腸疾患、膀胱のような疾患または障害を有する個体の数百万を扱った治療法の基礎を形成し、この知識を、受容体および受容体シグナル伝達を特徴づけるために、世界中の科学者を可能にした機能障害、喘息、および嚥下障害、わずか数名に。それは組織が組織として機能することを可能にするようにこの日に、孤立した組織浴は、医薬品開発や基礎研究の重要な側面のまま。このJoveのレッスンでは、正式なプロトコルは、受容体の特徴付けを可能とする等尺性収縮を測定孤立した組織浴実験からのデータを利用して視覚と仮想実験を実証するために共有されている。 この技術の主な利点は、組織が生きていることである身体に関連する生理的な結果（収縮または弛緩）との全組織としてND機能し、。なお、ステップ（薬物 - 受容体相互作用、シグナル伝達、セカンドメッセンジャーの生成、平滑筋の興奮性の変化、および組織機能の変化）の合成である。他の技術は、これらの各手順の検討（薬物親和性のバインディング例えば放射性リガンド、セカンドメッセンジャーの測定）を可能にしているが、孤立した組織浴技術は、すべてのこれらのステップ1の統合が可能になります。もう一つの利点は、組織機能を保持する細胞の設定VS組織において、より意味のある重要な薬理学的変数の計算を可能にするということです。それは、検査薬は全体として体内でどのように動作するかに近づく。

<table><tbody><tr><td>LabChart ソフトウェア</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab (4 チャンネル)&nbsp;</td><td>AD機器</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge (4チャンネル)</td><td>AD機器</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>グラスアダプタケーブル</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>Grass Force-displacement Transducer</td><td>Grass Instrument Co</td><td>FT03</td><td>FT03 Grass</td></tr><tr><td>Transducer Cable</td><td>Grass Instrument Co</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td>BNC to BNC Cable</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>ティッシュバス</td><td>マルチソース&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理的塩溶液</td><td></td><td></td><td>PSS</td></tr><tr><td>編組シルク縫合</td><td>ハーバード装置</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>リングスタンド</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr> シリコン<tr><td></td><td></td>タイゴンチューブ<td>で手作り</td>の<td>解剖皿</td></tr><tr><td></td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>ホースクランプ</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml マッスルバス</td><td>エバハートグラス ブロー</td><td>イング カスタム</td><td></td></tr><tr><td>250 ml ウォーミング チャンバー</td><td>エバハートグラス ブロー</td><td>イング カスタム</td><td></td></tr><tr><td>ガス分散チューブ</td><td>エース グラス</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>マイクロメータ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カスタム スタンド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3本爪クランプ</td><td>VWRインターナショナル</td><td></td><td>タロン</td></tr><tr><td>Sコネクタ</td><td>VWRインターナショナル</td><td></td><td>タロン</td></tr><tr><td>ティッシュフック</td><td>ハンドメイド</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>組織解剖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ実体顕微鏡 MZ6</td><td>ライカ</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>ステレオマスター顕微鏡 光ファイバー光源</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>文化 ペトリ皿</td><td>パイレックス</td><td></td><td>7740 ガラス</td></tr><tr><td>シルガード シリコーン エラストマー</td><td>ダウ コーニング</td><td></td><td>シルガード 170 キット</td></tr><tr><td>バンナス はさみ</td><td>ジョージ・ティーマン &Co</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>スプリンター&固定鉗子</td><td>ジョージ・ティーマン&共同</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

単離組織浴アッセイは、無数の収縮組織における濃度と反応の関係を評価するための古典的な薬理学的ツールです。 この技術は100年以上にわたって実施されてきましたが、このアッセイの汎用性、シンプルさ、再現性は、薬理学者と生理学者の両方にとって不可欠なツールであり続けるのに役立ちます。 ティッシュバスシステムは、さまざまな形状とサイズで利用でき、科学者はマウス腸間膜動脈のような小さなサンプルからブタ回腸のような大きなサンプルまで、大きくないにしても評価することができます。単離されたティッシュバスアッセイの中心となるのは、等尺性収縮の濃度依存性変化を測定する能力と、アンタゴニストまたは阻害剤の濃度を上げることによって収縮性アゴニストの有効性と効力をどのように操作できるかです。 一般的な原理は比較的似ていますが、最近の技術の進歩により、コンピュータベースのデータ記録および分析ソフトウェアを組み込むことにより、組織浴アッセイの汎用性がさらに向上しています。 このビデオでは、孤立した平滑筋(この場合はラット胸部大動脈輪)の等尺性収縮を測定するための分離組織浴の機能を示し、この手法で作成できる知識の種類を共有します。 大動脈組織の解剖と調製、組織浴への大動脈環の配置と実験前の適切な組織平衡、組織の生存率のテスト、実験デザインと実施、およびデータの定量に関する詳細な説明が含まれています。 大動脈は等尺性力変換器に接続され、そのデータは、これらの実験で使用するために特別に設計された市販のアナログ-デジタルコンバーターとブリッジアンプを使用して取得されます。このシステムに付属するソフトウェアを使用して、実験を視覚化し、取得したデータを分析します。

アゴニズムの観点から、相対的な有効性（E MAX）と所定の組織におけるアゴニストの効力（EC 50）を計算し、同じ組織1内の他のアゴニストの応答と比較することができる。我々の実験では、ラット胸部大動脈は、車両またはその前（ 図1）を組織浴にα1アドレナリン作動薬のフェニレフリンを添加し、収縮を生成する一時間α1アドレナリン受容体アンタゴニストプラゾシン（5 nM）のいずれかと共にインキュベートした。 図2のプレゼントは、 図1の結果を変更しました。緑の応答がPEによって達成される最大収縮が最大、などして、その応答を引き起こしたPE濃度に関連したとしてマーク½最大収縮としてマークマークしている。これらの値を特定する半最大（50％）またはEC応答を達成するアゴニストの有効濃度を識別している<s&gt; 50値UB。これはdonegraphicallyシグモイド曲線についてロジスティック関数を使用してこのexample.ComputerソフトウェアでカーブフィッティングおよびEC 50値の計算のために使用することができた。 生成して、これらの結果を解釈するには、濃度 - 応答曲線を作成するためにアゴニストの両方の低濃度および高濃度を使用することが重要である。安定なベースラインと最大プラトーを示すために十分なポイントがない場合、EC 50及びE MAXのみを推定することができる。これは、この例では、グラフィカルに行われた。シグモイド曲線についてロジスティック関数を使用しているコンピュータソフトウェアは、カーブフィッティングおよびEC 50値の計算のために使用することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> 図1：二重壁に配置された組織のリングを表す組織バース回路図漫画、水ジャケット組織BA目。バッファの流入および流出は、チャンバの底部に一体化三方ガラスコックによって調節される。 O 2 / CO 2は、PSSやガスの漏れを防止するためのガスケットで封止されているエアレーターを通してバブリングされる。再循環入力が適切な循環を維持し、温度調節不全を引き起こす空気ポケットの形成を防止するために、出力を下回っている。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> 図2：ラット胸部大動脈+内皮は、上の図は、4つの別々の実験（異なる動物と異なる色で表されるように異なるセットアップ上の別の研究者によって行われます）PE誘発収縮をシフトするプラゾシンの能力をテストすることを示している。プラゾシン（5 nM）を明確に並列にPE誘発収縮曲線を右方向にシフトした。 図3：ラット胸部大動脈+内皮グラフィカル不在（車両）におけるPEのEC 50値の推定とアンタゴニストの存在（プラゾシン）。。グリーンライン（グループC）は、唯一のマークされます。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> ソルト </td><td> MW（G /モル） </td><td> 5リットル </td><td> FINAL mMの </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> （グラム） </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136.1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム•7H20 </td><td> 246.5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td> 84.21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td>ブドウ糖</td><td> 180.16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> 表1：正常な生理的塩溶液（PSS）レシピ本実験で用いた重炭酸塩緩衝化PSSの内容。。全ての塩の分子量および所望の濃度を達成するためのdH 2 Oを5 Lの添加量も含まれる。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> お風呂での濃縮 </td><td> アゴニストの添加は風呂に加えられた </td></tr><tr><td> 1×10 -9 M </td><td> 50ミリリットル1×10 -6 M </td></tr><tr><td> 3×10 -9 M </td><td> 100ミリリットル1×10-6 M </td></tr><tr><td> 1×10 -8 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -5 M </td></tr><tr><td> 3×10 -8 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -5 </td></tr><tr><td> 1×10 -7 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -4 M </td></tr><tr><td> 3×10 -7 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -4 M </td></tr><tr><td> 1×10 -6 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -3 M </td></tr><tr><td> 3×10 -6 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -3 M </td></tr><tr><td> 1×10 -5 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -2 M </td></tr><tr><td> 3×10 -5 M </td><td> 100ミリリットル1×10 -2 M </td></tr><tr><td> 1×10 -4 M </td><td> 35ミリリットル1×10 -1 M </td></tr></tbody></table> 表2：組織バース添加アゴニスト濃度プロ各浴に添加されるアゴニストの量。perly累積濃度 - 応答曲線を構築する。所望の浴濃度は、アゴニストの漸増濃度の連続的な量を添加することによって達成される。各添加を考慮にバス内にすでに存在するアゴニストの濃度を取ります。これは、アゴニストの単一濃度の増加ボリュームを使用することから生じるであろう組織浴中の体積の増加を最小限にするために行われる。

このプロトコルは、孤立した組織浴システムとコンピュータベースのデータ取得を使用して、孤立した平滑筋製剤における等尺性収縮の測定を説明しています。

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

この手順の全体的な目的は、平滑筋の緊張度を測定することです。まず組織を解剖し、調製します。次に、その組織を単離組織バスに固定します。次に、組織の生存能を試験し、等尺性収縮を測定します。最終的に、この単離組織バス標本を用いて、受容体機能、受容体シグナル伝達、および平滑筋の反応性を試験します。一般的に、この手法の主な利点は、システムの柔軟性、結果を得るまでの迅速性、および組織全体を完全な状態で維持できる点にあります。この手法は、受容体シグナリングや平滑筋に干渉する薬剤を用いるあらゆる分野において、重要な疑問を解決するのに役立ちます。いくつか強調しておくべき準備事項があります。循環式温水バスを起動し、組織バスシステムを37°Cに予熱することが不可欠です。水は各コンポーネントの最も低いバーブ接続部から流入し、最も高いバーブ接続部から流出する必要があります。各コンポーネントを接続してください。力変換器は校正済みである必要があり、また、温度を平衡状態にするため、実験の少なくとも15分前に電源を入れておく必要があります。次に、ガスを接続する際に漏れがないかを確認し、システムを加圧してください。溶液でシステムを満たした後、必ずプライミングを行い、気泡を取り除いてください。組織バスのエアレーターのテストを行うことも推奨されます。適切なエアレーションは、薬物を効果的に拡散させますが、実験直前に組織を不安定にすることはありません。組織を解剖します。ラットを麻酔した後、はさみを用いて気胸を誘発させます。肋骨下端の横隔膜に沿って切開します。次に、肋骨の下端から胸骨にかけて切開し、組織を二分します。脊柱上の臓器を取り除き、脊柱に沿って直接走行している大動脈を確認します。ここで、大動脈へのすべての接続を切断し、横隔膜のレベルで脊柱に対して垂直に大動脈を切断します。次に、大動脈をそっと保持し、脊髄から大動脈を剥離します。脊髄に隣接する横隔膜の下部領域から開始し、心臓に向かって進めます。大動脈組織を引っ張ったり、強く引いたりすると、直ちに組織を損傷させる可能性があるため、注意してください。大動脈をPSSを含む解剖皿に入れます。次に、ワイヤーを用いて小さな90度の角度を付けます。ワイヤーの角度がついた端を、解剖皿の底部に固定します。次に、ガイドワイヤーを大動脈の内腔に慎重に挿入し、大動脈をワイヤーに沿ってスライドさせます。ワイヤーの自由端が見えたら、それを軽く曲げて台座に押し込み、組織を固定します。続いて、小型の静脈剪刀とピンセットを用いて、胸部大動脈が白くやや繊維状に見えるまで、血管周囲脂肪組織およびその他の不要な組織を除去します。余分な組織を除去した後、洗浄した大動脈をワイヤーから慎重に外します。大動脈を幅3〜5 mmのリング状に切断して、この工程を完了します。これで大動脈リングが完成します。組織をバスチャンバー内に固定するため、縫合糸付きの組織フックを2つ用意します。一方のフックには、ロッドに取り付けるための小さな結び目のあるループ状の縫合糸を付けてください。もう一方のフックには、10から14 cmの長さの縫合糸が必要です。結紮を行うために、これらの組織フックを各大動脈リングに注意深く取り付けます。この際、フックが絡まないように注意してください。次に、リングスタンドに固定した組織ホルダーを用い、各組織片を室温のPSSが入ったディッシュに移します。次に、結び目を作ったループをロッドのペグに通し、長い方の縫合糸を使って組織を保持します。その後、ロッドをチャンバーに入れ、ロッドが固定されていることを確認します。これで、残りのフックから力トランスデューサーに向けて縫合糸を結びつけます。力変換器と組織の間の張力をマイクロメーターで調節できるよう、縫合糸に十分な余裕を持たせてください。各チャンバーの各リングに対してこの工程を繰り返します。次に、受動的張力を設定します。マイクロメーターを使用して張力を2gまで上げ、組織の張力の上昇が止まるまで待ちます。次に、さらに2g張力を上げ、再び張力の変化が止まるまで待ちます。これで完了です。張力はこの時点で約 3.2 grams になるはずです。各チャンバーの各リングでこのプロセスを繰り返します。すべての受動的張力を設定した後、組織を1時間平衡化させます。この間に、15分ごとにPSSを交換し、平衡化期間の終了時に使用する薬剤の調製など、実験のその他の準備を行います。組織を最後に一度洗浄し、データを保存してすべての入力をゼロに戻します。その後、テキストプロトコルの詳細に従い、初回チャレンジを行います。これらの操作を必ずソフトウェアに記録してください。初期の負荷後、張力の変化はプラトーに達します。その後、負荷薬剤を洗浄し、組織の緊張をベースラインまで戻します。組織をこのベースラインの緊張状態で約10分間静置します。一方のバスには溶媒（本ケースでは水）を、もう一方のバスにも同様に加えます。バス内の濃度が5 nMになるように、十分な量のプラゾシンを添加します。洗浄を行わず、組織バスを1時間インキュベートします。その間、フェノールリンを対数曲線に沿って広範囲の濃度で調製します。1時間後、累積濃度反応を生成するために、濃度を段階的に上げてフェノールリンアゴニストをバスに添加します。各添加後、次の濃度を添加する前に、組織の反応がプラトーに達するまで待ちます。組織の緊張度が変化しなくなるか、あるいは反応曲線全体がプラトーに達するまで、添加を続けてください。一方、胸部大動脈をα1アドレナリン受容体拮抗薬のPOZ simで1時間インキュベートした後、組織バスにα1アドレナリン作動薬のphenyl rineを添加し、phenyl rineの最大収縮および半最大収縮に関する累積収縮反応曲線を 作成しました。溶媒のみを投与した対照組織は緑色で示されています。半数最大値は、薬剤の有効濃度を示しています。ラジン処理した組織の同様の測定値が黒色で示されています。このビデオを視聴することで、単離組織浴における平滑筋機能の測定方法について十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

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