薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定
2015年1月19日
このプロトコルは、孤立した組織浴システムとコンピュータベースのデータ取得を使用して、孤立した平滑筋製剤における等尺性収縮の測定を説明しています。
この手順の全体的な目標は、平滑筋の緊張を測定することです。これは、最初に組織を解剖して準備することによって達成されます。2番目のステップは、隔離されたティッシュバスに組織をマウントすることです。
次に、組織の生存率がテストされ、等尺性収縮測定が行われます。最終的に、単離された組織浴調製物は、受容体機能、受容体シグナル伝達、および平滑筋反応性をテストするために使用されます。一般的に、 この手法の主な利点は、システムの柔軟性、結果を達成する速さ、および組織全体を無傷に保つことです。
この方法は、受容体のシグナル伝達や平滑筋の魂を妨害するために薬物を使用する任意の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます、 ストレスを感じなければならないいくつかの準備があります。再循環式温水浴をオンにして、ティッシュバスシステムを摂氏37度に予熱することが重要です。水は、最も低いバーブ接続部で各コンポーネントに流れ込み、最も高いバーブ接続部で流出する必要があります。
各コンポーネントは接続する必要があります。力変換器は校正する必要があり、実験の少なくとも15分前に電源を入れて温度を平衡状態にする必要があります。次に、ガスを接続するときは、漏れがないかチェックしてから、システムを加圧します。
システムに溶液を充填した後は、必ずプライミングを行い、気泡を取り除いてください。ティッシュバスエアレーターのテストも保証されています。良好な通気は薬物を効果的に分配しますが、実験の直前に組織を不安定にすることはありません。
組織を解剖します。ラットに麻酔をかけた後、ハサミを使用して気胸を作成します。胸郭の下部にある横隔膜に沿って咥えます。
次に、胸郭の底から胸骨まで切り取り、組織を二等分します。脊柱の上の臓器を片付けて、脊柱に直接沿う大動脈を見つけます。次に、大動脈へのすべての接続を切断し、横隔膜のレベルで脊椎に垂直な大動脈を切断します。
次に、大動脈をそっと持ち、背骨から大動脈を解剖します。背骨に隣接する下横隔膜の領域から始めて、心臓に向かって作業します。ただ、大動脈組織を引っ張ったり引っ張ったりすると、すぐに損傷を受ける可能性があるため
、注意してください。PSSを含む解剖皿に大動脈を置きます。.次に、ワイヤーを取り、90度の小さな角度を作ります。一方の端で、ワイヤーの角度のついた端を解剖皿の基礎に固定します。
次に、ガイドワイヤーを大動脈の内腔に慎重にねじ込み、大動脈をワイヤーにスライドさせます。ワイヤーの自由端が見えてきたら、ワイヤーをそっと曲げて土台に押し込み、組織を安定させます。次に、小さな金星のはさみと鉗子を使用して、胸部大動脈が白く、やや繊維状に見えるまで、血管周囲脂肪組織やその他の外部組織を取り除きます。
余分な組織を取り除いたら、ワイヤーからきれいな大動脈を慎重に取り外します。このセクションを、大動脈を3〜5ミリメートル幅のリングに切断して終了します。リーチ大動脈リング。
お風呂の部屋に固定するために、縫合糸付きのティッシュフックを2つ用意しています。1つのフックには、ロッドに取り付けるための小さな結び目のあるループ付きの縫合糸が必要です。もう一方のフックには、10〜14センチの長さの縫合糸が必要です。
結び目を結ぶには、これらの組織フックのペアを各大動脈リングに慎重に取り付けます。フックが絡まらないように注意してください。次に、各ティッシュピースを室温のPSSの皿に移し、ティッシュホルダーをリングスタンドに固定します。
次に、結び目のあるループをロッドのペグに滑り込ませ、長い縫合糸を使用して組織を支えます。次に、ロッドをチャンバーに入れ、ロッドが固定されていることを確認します。次に、残りのフックからの縫合糸を力変換器に結びます。
縫合糸に十分なたるみを残して、力変換器と組織の間の張力をマイクロメーターで調整できるようにします。各チャンバーの各リングについて、このプロセスを繰り返します。次に、パッシブテンションを設定します。
マイクロメーターを使用して張力を2グラムに増やし、組織の張力の増加が止まるのを待ちます。次に、張力をさらに2グラム増やし、再び張力の変化を待ちます。仕上げます。
張力は約3.2グラムになるはずです。各チャンバーの各リングでこのプロセスを繰り返します。すべての受動的な張力を設定した後、組織を1時間平衡化させます。
この間、PSSを15分ごとに交換し、平衡化期間の終了時に薬物を調製するなど、実験のための他の準備を行います。最後にもう一度ティッシュを洗浄し、データを保存し、すべての入力をリロします。次に、テキストプロトコルの詳細に従って、最初のチャレンジを行います。
これらのアクションは、必ずソフトウェアに文書化してください。最初のチャレンジの後、テンションの変化は横ばいになります。次に、チャレンジ薬を洗い流して、組織のトーンがベースラインに達するようにします。
このベースライントーンで組織を約10分間休ませ、この場合は車両で一方の浴槽に、もう一方の浴槽に水を注ぎます。浴中で5ナノモルの濃度に十分なプラゾシンを添加します。ティッシュバスを洗わずに1時間インキュベートします。
その間、フェノールラインは対数曲線に沿って広範囲の濃度で修復します。1時間後、濃度を上げてフェニルラインアゴニストを浴に加え、累積濃度反応を生成します。.各添加後、組織がプラトーに反応するのを待ってから、次の濃度を添加します。
組織のトーンが変化しなくなるまで、または全体の反応曲線が頭打ちになるまで、追加を続けます。むしろ、胸部大動脈は、α 1 アドレナリン受容体拮抗薬 POZ sim で 1 時間インキュベートされ、その後、α one アドレナリン作動薬フェニル ラインを組織浴に加え、フェニル ラインの最大収縮と半最大収縮の累積収縮応答曲線を生成しました。車両のみでは、コントロールティッシュは緑色でマークされています。
半値最大値は、薬物の有効濃度を示します。ラジン処理された組織についても同じ測定値が黒で見られます。このビデオを見れば、孤立した組織浴で平滑筋の機能を測定する方法についてよく理解できるはずです。
概要
このプロトコルは、組織浴システムを用いて、単離した平滑筋の等尺性収縮の測定を概説しています。組織の生存性を維持することの重要性を強調しながら、平滑筋の緊張の調製とテストの詳細を説明しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生理学
- 薬理学
背景
- 等尺性収縮の測定は、平滑筋機能を理解するために重要です。
- 単離した組織浴システムは、制御された実験を可能にします。
- 柔軟性と迅速な結果はこの技術の主要な利点です。
- この方法は受容体シグナリングと平滑筋反応性に関する疑問に対応できます。
研究の目的
- 単離した調製物における平滑筋の緊張を測定すること。
- 平滑筋における受容体の機能とシグナリングを評価すること。
- 薬理学的薬剤が筋肉反応性に与える影響を評価すること。
使用された方法
- ラットの大動脈からの組織の解剖と調製。
- 組織を単離した組織浴に取り付けること。
- 力センサの校正とシステムセットアップ。
- アゴニストに対する等尺性収縮の測定。
主要な結果
- 大動脈リングにおける等尺性収縮の成功的な測定。
- フェニレフリンに対する濃度反応曲線の確立。
- 処置済み組織と対照組織の収縮反応の比較。
- 薬理学的薬剤の効果的な濃度の特定。
結論
- 単離した組織浴は、平滑筋のダイナミクスを研究するのに効果的です。
- この方法は受容体介在性の収縮に関する洞察を提供します。
- 結果は平滑筋を標的とする薬理学的介入に情報を提供できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The isolated tissue bath assay enables precise measurement of smooth muscle contractility, providing critical data for target validation in cardiovascular and metabolic disease programs. By quantifying agonist potency and antagonist efficacy in intact tissue, this method supports mechanistic de-risking of pharmacological interventions before lead optimization. Its reproducibility and scalability make it a valuable tool for early discovery workflows requiring functional validation of vascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates receptor signaling pathways through concentration-response analysis of contractile agonists.
- Operational Value: Enables functional validation of targets such as adrenergic receptors in a physiologically relevant tissue context.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by quantifying drug effects on tissue tone and contractile response.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible isometric contraction data suitable for compound screening cascades.
- Standardization: Supports development of standardized protocols for evaluating vascular reactivity across laboratories.
- Scalability: Compatible with various tissue sizes, enabling cross-species extrapolation from rodent to large animal models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models vascular smooth muscle function in hypertension and atherosclerosis research.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical efficacy by maintaining tissue integrity and physiological responsiveness.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical candidate selection based on functional contractility data rather than binding affinity alone.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated tissue bath functions as a discovery-stage assay that informs target selection and lead identification by providing functional readouts of receptor-mediated smooth muscle responses.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about receptor function and signaling in native tissue environments.
- Screening: Delivers EC50 and Emax values that enable rank-ordering of compounds by potency and efficacy.
- Analytics: Produces concentration-response curves that support quantitative comparison of pharmacological agents.
- Translational Research: Maintains physiological relevance to support extrapolation to disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for evaluating vascular targets across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into receptor-mediated contractions, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible outputs through computer-based data acquisition and analysis.
- Strategic Value: Improves prediction of clinical translatability by assessing drug effects in intact tissue.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on functional vascular activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, mounting, and viability testing.
- Dependent on force transducers, analog-to-digital converters, and temperature-controlled perfusion systems.
- Necessitates standardized solutions (e.g., PSS) and equilibration protocols to ensure data consistency.
- Must account for tissue-specific contractile properties when extrapolating across models.
- Limited to ex vivo tissue viability windows, requiring timely experimentation post-dissection.
