Name: 全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶ 気道および鼻腔の3D器官型組織モデルを用いたタバコ煙反復暴露の影響評価法。繊毛拍動頻度測定とマイクロアレイ解析により、呼吸器毒性学における動物実験代替法の有効性を示す。

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著者は、原稿の彼らのレビューのためにモーリス·スミスとマルヤTalikkaに感謝したいと思います。

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+3402%3A+Tobacco+and+tobacco+products+--+Atmosphere+for+conditioning+and+testing%22">ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing</a>. , International Organization for Standardization. (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

この研究は、フィリップモリスインターナショナルによって資金を供給された。

ここでは繰り返さCS暴露の影響を評価するために、人間の器官の気管支および鼻組織モデルの適用可能性を実証した。動物実験の代替として、露光システムの数は、インビトロでのエアロゾル暴露の毒性評価のために開発された（ 例えば 、Vitrocell、Cultex、ALICE、等）。これらの露出モジュールはまた、本研究では等大気汚染物質、浮遊微小粒子、ナノ粒子の毒性学的評価のために利用することができ、我々は、大規模実験との間の低い変動性を考慮し、同時に48の異なるサンプルまで収容することができVitrocellシステムを使用しトリートメント。 インビトロでのすべてのエアロゾル暴露のために、組織培養の汚染の危険性は、その緩和の実験を通して組織培養物の慎重な取り扱いが要求される大きなリスク残る。 電子天秤の間にリアルタイムで粒子沈着を測定するxposure実験は、露光システムから生成されたCS用量は期待に適合していることを監視することができます。段取りオンライン測定を正確に露光する前には、 例えば 、critialなぜなら微量天秤（cm 2）との面積の差により、さらに0にスケールを設定し、測定された粒子の沈着の精度を確保するため組織培養インサート（0.33 cm 2）を 、我々は、培養インサートの領域に最終的な計算を調整する：天秤上の堆積のわずか33％が、培養インサートの実際の堆積を反映する。 タイトジャンクショ​​ンのバリア機能を確認すると、上皮層の破壊を評価するためにTEERの測定は、私たちがここで報告された、実装するための比較的簡単な手順である。気管支および鼻組織モデルは、粘液産生散在杯細胞を含有してので、頂端洗浄TEER measの前に実行される必要があるurement。粘液層の存在およびその厚缶バイアスTEERの測定のばらつきは、CS暴露の影響をinterferringのでアピカル洗浄が重要である。この概念はのどぐろしたCaco-2細胞の透過性、粘液産生杯細胞株HT29 23との共培養によって影響された同僚によって報告されたものと一致している。粘液は、右露光前頂端洗浄CSに対する組織反応を妨害する可能性があるため、事前のTEER測定を洗い流される必要がある。したがって、測定は3日間の曝露の前に行われ、露光前、右されていません。 我々は、活性は軽度にしかCSによって増加したが、CYP1A1 / CYP1B1活性がCS曝露後の器官培養モデルから測定することができることを示した。この弱い信号のために、例えば、CYP1A1 / 1B1の基質（ すなわち 、ルシフェリン-CEE）のより長いインキュベーションによって増幅することができる24時間後（データは示さず）。本研究におけるCYP活性測定の限界の一つは、CYPタンパク質のレベルまたは酵素活性に変化が影響を受けないことを保証するために、将来の研究のために考慮することができる細胞数に正規化が存在しないことであるタンパク質レベルまたは細胞数のいずれかの変化によって。 私たちは、CS曝露が鼻および気管支組織モデルの両方に繊毛運動を阻害したことを報告した。同様の観察は、多様な哺乳動物および非哺乳動物のモデル12で行った。繊毛運動の測定のために、組織は同様の方法で処理し、処理されることを保証することは培​​地交換が実施される場合、例えば、それは、すべてのサンプルに適用されるべき、重要である。 Suttoらは、pHが、周波数24を破って、哺乳動物の毛様体に影響を与えたことを報告した。したがって、異なるcompunds /混合物で処理した細胞との間の拍動頻度を比較した場合、pHは調整は、繊毛運動測定のばらつきを最小限にするために考慮されるべきである。繊毛運動の周波数は温度の低下と共に低下するとまた、測定を行う際の温度も重要である。本研究で使用した温度、CO 2、及び湿度制御が装備これらの変更、ステージトップインキュベーターによるばらつきを最小限にすることができる。それにもかかわらず、我々は、CS曝露後の気管支組織中の周波数を破っ繊毛の繊毛運動は、露光後の非常に乱れた権利であることを示唆している、高度に可変（ すなわち一つのインサートが増加し、他のインサートの減少）であったことを観察した。対照的に、我々は、鼻組織の反応の感受性と一致していることを示唆し、CS曝露後鼻組織に測定可能な繊毛運動周波数が存在しないことを観察した。これは、鼻組織のように解毒する低い能力を有することを示した以前の出版物と一致している気管支25と比較した。 最後に、CSに曝露された器官の気管支および鼻組織モデルからの遺伝子発現プロファイリングは、生体異物代謝にCSの影響を実証することを示した。興味深いことに、CSに曝露しビトロモデルにおける器官気管支及び鼻内異物代謝において観察された変化は、以前の刊行物15に詳細に説明するように喫煙者におけるインビボの状況と似ている。遺伝子発現解析のために、ロボティック機器を使用するハイスループット分析を可能にする。また、自動ロボットハンドリングはさらに、遺伝子発現の結果の一貫性及び精度が向上する。それにもかかわらず、組織サンプルの迅速な収集はRNA抽出中にRNAの分解を避けるために重要であった。ここで説明するRNA処理とトランスクリプトームアプローチはまた、 インビボでの組織サンプルに適用することができる。

肺は、汚染物質やタバコの煙(CS)の成分など、さまざまな毒物を含む可能性のある吸入空気に直接かつ常にさらされています。これらの毒物への曝露が呼吸器組織に与える影響を研究することは、in vivo 曝露に似た方法で行われた場合に最も有益です。従来の2D浸漬細胞培養(例:正常なヒト気管支上皮細胞(NHBE))と比較して、3D器官型組織モデルは、in vivoでのヒト気道上皮の形態学的、生理学的、および分子的側面をよりよく再現します1,2:3D組織モデルには、in vivoで観察された細胞タイプの多様性が含まれていますには、分化した上皮細胞、繊毛細胞および非繊毛細胞、杯細胞、および基底細胞が含まれます。それらは機能的なタイトジャンクションを持ち、粘液線毛表現型1-3を示します。さらに、培養物は、通気性のある多孔質膜上で、空気と液体の界面で増殖させることができ、頂端側でエアロゾルに直接さらすことができます(一方、基底側は培地に浸されます)3-5。Dvorakたちは、気管支組織モデルの遺伝子発現プロファイルが、ヒトの気管支ブラッシングから得られたものと類似していることを報告した3。さらに、Mathisらは、これらの組織モデルのCSに対する応答が、喫煙者から得られた気管支上皮細胞と非喫煙者から得られた細胞との間に観察された差と類似していることを示しました6。最後に、気管支組織モデルは最大数ヶ月間培養できるため4,5、試験項目の長期曝露の影響を調べるために使用できる可能性があります。
細胞毒性評価は、化学的損傷後に測定される、または特定の化合物または混合物の毒性を評価するための一般的なパラメータです。例えば、膜の完全性は発光アッセイによって測定することができ、細胞培養7に対する用量依存的な細胞傷害性効果の測定を可能にする。ただし、毒性の低い濃度での化合物の病態生理学的影響を評価するには、他のパラメーターを測定する必要があります。例えば、経上皮電気抵抗(TEER)アッセイを用いて決定された組織完全性は、タイトジャンクションの機能を確保し、上皮層8,9の破壊を監視する。毛様体拍動周波数により、呼吸器組織に対するCS関連の影響を測定することもできます。上気道と下気道に接する繊毛内層の正常な鼓動頻度は、気道感染症から保護するために重要です10。呼吸器上皮の繊毛円柱状上皮細胞の各々は、散在する杯細胞11によって放出された粘液中に閉じ込められた感染性病原体または吸入粒子状物質を排除するために、特定の頻度で200〜300本の繊毛が鼓動している。CSには、毛様体打診12を阻害する可能性のある化学物質が含まれており、気道の保護が低下します。この研究は、毛様体拍動が器官型組織モデルで測定できることを示しています。このアプローチにより、上皮細胞が器官型組織培養において正常な機能を示すかどうかの評価が可能になります。CSはまた、気道での生体異物代謝応答を活性化して、タバコの煙成分を代謝します13。組織モデルの第I相異種代謝酵素であるCYP1A1およびCYP1B1の活性を測定できます。さらに、以前に報告されたように、全体的な遺伝子発現は、器官型気管支組織モデル6,14,15で測定することができる。トランスクリプトームデータとネットワークベースのシステム生物学的アプローチを活用して、CSが生体異物代謝に与える影響を評価します15。
器官型の3D気管支および鼻組織モデルをin vitro曝露システムを使用して主流のCSに曝露し、この曝露に対する組織の反応を測定するために使用された方法論は、新鮮な空気への曝露(制御)と比較して詳細に説明されています。

<table><tbody><tr><td>MucilAir-ヒト線維芽細胞-気管支上</td><td>皮S&aacute;rl, ジュネーブ, スイス</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Culture Medium</td><td>Epithelix S&aacute;rl, Geneva, Switzerland</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F reference cigarette</td><td>ケンタッキー大学</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>30-port carousel smoking machine SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CiliaMetrixカメラとソフトウェア</td><td>La Haute & Eacute;cole de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMIL microscope&nbsp;</td><td>ライカ、ヘールブルッグ、スイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED光源</td><td>Titan Tool Supplies、バッファロー、NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チョップスティック電極 STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>ルシフェリン検出試薬&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNAライザー装置&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Agilent 2100 バイオアナライザー&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip ハイスループット 3'IVT Express キット</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp;</td><td>アフィメトリックス</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

全体タバコ煙への器官型3d気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

タバコの煙(CS)は肺の生物学に大きな影響を与え、慢性閉塞性肺疾患や肺癌などの肺疾患の発症を引き起こす可能性があります。疾患発症の根底にあるメカニズムを理解するためには、CS曝露が肺組織に直接及ぼす影響を調べることが重要になります。しかし、このアプローチは、肺組織のサンプリングが複雑で侵襲的であるため、疫学研究で実施することは困難です。あるいは、組織培養モデルにより、肺組織への曝露の影響の評価を容易にすることができます。この目的のために、正常なヒト気管支上皮(NHBE)細胞培養などの水中2D細胞培養が伝統的に使用されてきました。ただし、in vivo曝露状況と同様に、直接煙に曝露することはできません。最近開発された3D組織培養モデルは、気液界面(ALI)で培養できるため、in vivoの状況をよりよく反映できます。それらの基底面は培地に浸されています。一方、それらの頂端側は空気にさらされています。さらに、異なる種類の細胞を含む器官型組織培養物は、in vivoでの組織の生理機能をよりよく表しています。この研究では、in vitro曝露システムを利用して、ヒトの器官型気管支および鼻組織モデルを主流のCSに曝露することを実証します。毛様体拍動頻度とシトクロムP450s(CYP)1A1 / 1B1の活性を測定して、CSが組織に及ぼす機能的影響を評価しました。さらに、CSによる変化を分子レベルで調べるために、ばく露後の組織から遺伝子発現プロファイルを作製しました。CYP1A1/1B1活性のわずかな増加は、空気ばく露組織と比較して、CSばく露組織で観察されました。.ネットワークおよびトランスクリプトミクスに基づくシステムバイオロジーアプローチは、喫煙者から得られた気管支および鼻上皮細胞で観察されたものと同様のCS誘発性生体異物代謝の変化を実証するのに十分堅牢でした。

以下に記載された結果では、器官、組織、初代ヒト上皮細胞、健康、禁煙、白人ドナーから単離され、線維芽細胞15を使用して再構成しただった。 3D気管支及び鼻の組織モデル 体外気管支及び鼻の器官のモデルでは 、細胞レベル、人間の気道上皮（ 図2）に似ている。 CS暴露 器官気管支及び鼻組織モデルを繰り返し、空気 - 液体界面で主流CSに曝露することができる。ここに示された結果のために使用される煙曝露実験手順は、 図1に示されている。 繊毛運動の記録 繊毛の鼓動は、ビデオに示すように、空気に露出した組織で記録した。 CS露光は繊毛運動頻度の減少に関連した強いピークは周りを観察露出した偽および暴露前4ヘルツのCS曝露（ 図3）の後にはもはや観察されない。この低減された周波数は、粘液と感染性物質22を除去することが少ない効率的な鼓動繊毛になるだろう。 TEER及びCYP1A1 / 1B1活性の測定 TEERは、組織がまだ機能していることを確認するために、最後の曝露の48時間後に測定した。 CYP1A1 / 1B1活性を図1に示すように、露光の終了の48時間後に測定した。CS曝露組織におけるTEER値は、煙の大 ​​きな細胞毒性効果がないことを確認した空気に露出した組織と比較して有意差はなかったこの濃度で。 48時間の露光後に、組織のCYP1A1 / 1B1活性がわずかに露出（ 図4）は、以下の組織防御機構の適度な増加を示し、増加した。 遺伝子発現プロファイルおよびネットワークベースのシステムは、双方向異物代謝の変化のCS曝露の影響を研究する学問のアプローチ 組織は48時間の露光後の時点で採取した。次いで、マイクロアレイ分析、遺伝子発現CS-のプロファイルと空気曝露組織を生成するために実施した。生体異物代謝にCS暴露の影響は、遺伝子発現プロファイルから、15以前報告されたように活用ネットワークベースのシステム生物学のアプローチを用いて調べた。ネットワークベースのシステム生物学のアプローチを使用して、生体異物の代謝ネットワークモデルにおけるバックボーンノードのレベルでのCS曝露の影響がうまく（ 図5） のin vitroおよびin vivoの間でデータセットに相関していたことを示している。対照的に、各個々の遺伝子発現の変化のレベルで、貧弱な相関は、インビトロ （空気曝露対CS曝露）およびインビボ （非喫煙者対喫煙者）との間で観察された。 図1.器官気管支組織モデルへのCSの反復暴露の概略手順略語：。CYP、チトクロームP450の。 CS、たばこの煙。 TEER、経上皮電気抵抗。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> 図2.器官気管支及び鼻上皮組織培養モデル。漫画気管支（A）を説明し、気液界面での鼻（B）組織培養インサート。以前に15報告されているようにin vitroモデルは、ヘマトキシリン＆エオシン染色された細胞の先端層に示す繊毛細胞（気管支用のC、鼻用D）を含有していた。モデルは、重要である線維芽細胞と共培養した<html>上皮細胞（矢印）の増殖および分化のために。気道系統マーカーの染色：以前に15報告されているようにP63（鼻用気管支ためのE、F）およびMUC5AC（気管支用のGは 、鼻用H）が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> 図3繊毛拍動頻度。繊毛ビート周波数（CBF）は、露光前後大気曝露および培養物中で測定した。 （2挿入から代表的な結果がレプリケート1（R1）として示され、2（R2）を複製している）CBFがCS暴露後に見られた減少した。 広告/ 52325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; 図4. CYP1A1 / CYP1B1活性の測定とTEER。左pannelsは気管支（A）におけるCYP1A1 / CYP1B1の活動を示し、鼻（B）は、組織モデル。右のパネルは、気管支（C）および鼻（D）組織モデルにおけるTEER測定を示す。 ±SDが示されていることを意味します。略語：CS、たばこの煙。 CYP、チトクロームP450。 TEER、経上皮電気抵抗。 RLU、相対luminescenseユニット。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> 異物代謝の文脈におけるCS暴露の影響評価のために、図5のネットワーク·ベースのシステム生物学アプローチ。遺伝子発現レベルの変化は、生体異物の代謝ネットワークモデルのバックボーンノードの活性化（A）を計算するために使用された</<html> strong&gt;の前の出版物15で報告されたように。右の図は、NPAアプローチを使用して &quot;、差動ネットワークバックボーン値」としても知られ、バックボーンノードの定量化の概念を示す図である。青色の楕円は、バックボーン·ノードの活性を表す（ すなわち 、機能層）および緑色ボールの遺伝子の発現を表す（ すなわち 、転写層）。曝露後の48時間での器官型気管支組織におけるCS曝露の影響は、（ 試験管内で、空気に露出対CS-露光）下甲（GSE16008をburshingことで気管支鏡検査と鼻上皮によって収集されたヒト気管支上皮に喫煙のものと比較した）（ インビボ、喫煙者対非喫煙者）（B）。インセット、 インビトロおよびインビボのデータセット中の間の遺伝子発現の変化の相関。略語：CS、たばこの煙。 NPA、ネットワーク摂動振幅。ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

このプロトコルの目的は、人間の器官型の3D気管支および鼻組織モデルを、気液界面で主流のタバコの煙（CS）にさらすことです。次に、組織に対するCSの影響を、シトクロムP450活性アッセイ、繊毛拍動測定、およびシステム生物学的アプローチを使用して調査します。

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

この手順の全体的な目標は、器官型 3D 気管支および鼻組織培養モデルがタバコの煙全体に繰り返し曝露された場合の影響を評価することです。これは、まず、気液界面で器官型、気管支、鼻の組織培養モデルを培養することで達成されます。第2のステップは、喫煙機でエアロゾルを生成し、実験デザインに従って組織培養物を曝露システムで露光することです。次に、培養物の毛様体拍動頻度と組織の完全性を測定することにより、曝露の影響を評価します。最後のステップは、マイクロアレイ技術を使用してエアロゾルによって誘発されるトランスクリプトーム交換を測定することです。最終的には、ネットワークベースのシステム生物学アプローチを使用して、タバコの全煙が組織培養に与える影響を示します。呼吸器毒性学における既存の方法のこれらの技術の主な利点は、アプローチが動物実験の代替法を見つけるための規制当局の要件と一致していることであり、非液体界面で成長した細胞に対する短期間のタバコの煙曝露の影響の評価を可能にし、人間の気道で発生する条件を模倣します。実験を開始するには、滅菌済みの24ウェルプレートの各ウェルに0.7ミリリットルの予温培地を追加します。次に、ティッシュパッケージを取り出し、組織培養インサートを新たに調製した24ウェルプレートに移します。組織培養物をインキュベーターで維持し、培地交換中は2日ごとに培地を交換します。光学顕微鏡で組織を検査し、汚染がなく、媒体の漏れがないことを確認します。曝露実験の3日前に、組織培養物の頂端側を200マイクロリットルの培地で洗浄します。次に、in vitroシステムの気候室と培養ベースモジュールを37°Cに予温します。温めた後、培養ベースモジュールに1行あたり17.5ミリリットルのメディアを入れます。インキュベーターから組織を取り出し、組織培養インサートを培養プレートからin vitro曝露システムの培養ベースモジュールに移します。次に、栽培ベースモジュールをガラスの蓋で覆います。主流のタバコの煙またはcsにさらされるために、組織を気候室に移します。校正済みの30ポートカルーセル喫煙機を使用してタバコの煙を生成します。タバコを標準まで吸いますが、長さは約35ミリメートルで55ミリリットルです。2秒以上、1分に2回、ポンプ排気時間は8秒以上をパフします。主流のタバコの煙は蓄積され、in vitro曝露システムに放出されます。ティッシュを6〜7分間さらします。組織を培養プレートに戻した後、インキュベーターに1時間戻します。組織培養プレートをインキュベーターから取り出し、室温で30分間ボンネットの下に置いて、CLIAの鼓動を安定させます。安定化後、cliometricsソフトウェアに接続された光学顕微鏡で組織を観察します。次に、繊毛の鼓動の頻度を記録し、1分間、48時間、3秒ごとに周波数を測定します。曝露後、ヒト気管支上皮組織の頂端側に200マイクロリットルの培地を加え、組織に触れることなく、基礎培地と新たに添加した培地に箸電極を挿入して組織抵抗を測定します培養の頂端側。測定後、真空ポンプに接続されたパスターピペットを使用して、組織培養物の頂端側から培地を静かに取り出し、組織をインキュベーターに戻します。シトクロムP four 50酵素活性を測定するには、事前に調製したLuciferおよびCEE基質で新しいプレートを調製し、インサートをそのプレートカバーに移し、組織インサートを一晩インキュベートします。インキュベーション後、各組織インサートから50マイクロリットルの培養培地を室温で96ウェル不透明白色ルミノメータープレートに移します。次に、50マイクロリットルのLucifer検出試薬を各ウェルに加え、プレートを室温で20分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、ルミノメーターで発光を測定します。インキュベーターから3D器官型組織インサートのプレートを採取し、プレート上の各インサートを冷たいPBSで3回洗浄し、洗浄の合間に過去のピペットでPBSを吸引します。最後の洗浄後、PBSを吸引し、プレートを覆ってインサートが乾燥するのを防ぎます。次に、プレートから各インサートのインサートメンブレムを切り取り、メンブレンがブレード上に平らになるまで押し込みます。組織をブレードから均質化チューブに移し、チューブに蓋をねじ込みます。次に、それを振って渦巻き、ドライアイスの上に置きます。均質化装置でサンプルを解凍し、6, 000 RPMで45秒間粉砕します。室温で5分間放置した後、140マイクロリットルのクロロホルムをサンプルに加え、再び15秒間ボルテックスします。ホモジナイジングチューブからサンプル全体を位相ロックチューブに移します。サーモシェーカーに置き、室温で1400RPMで2分間振とうします。その後、室温で2分間放置します。振とうが完了したら、12, 000 G.新しい2ミリリットルのチューブに上清を移すで、摂氏4度で15分間チューブを回転させます。続いて、RNA沈殿洗浄、懸濁液、精製を行います。抽出されたRNAは、品質チェックされます。量と完全性を評価するには、リキッドハンドリングシステムとターゲット合成を準備します。抽出したRNAを配置します。プレートと必要なすべての試薬とラボは、ロボットに装着されます。まず、RNA濃度が正規化されます。その後、増幅から標識、精製、フラグメンテーションまでの次のステップでデッキを交換します。次に、ハイブリダイゼーションミックスを断片化して標識したA RNAの33マイクロリットルに加え、サンプルを変性させ、アレイを200マイクロリットルのプレハイブリダイゼーションで予め湿らせます。ハイブリダイゼーション洗浄および染色キットから混合します。次に、チップを摂氏45度、60RPMに設定したハイブリダイゼーションオーブンに10分間入れます。プレハイブリダイゼーションバッファーを取り外し、サンプルの200マイクロリットルをロードします。アレイをオーブンで摂氏45度、回転数60rpmで16時間インキュベートします。チップからカクテルを吸引し、マイクロアレイに250マイクロリットルの洗浄バッファーaを充填します。ソフトウェアを開き、ソフトウェアのメニューバーからfluidicsを実行します。対象のモジュールと、各モジュールの素数 4 50 プログラムを選択します。チップのバーコードをスキャンして各モジュールに適切なチップを割り当て、チップを流体システムに配置します。最後に、スキャナーが暖かいことを確認します。次に、チップをスキャナーの自動ローダーにロードし、マイクロアレイをスキャンします。鼻組織のCELIA鼓動周波数またはCBFは、空気またはタバコの煙またはcsにさらされる前後に測定されました。CBFと鼻組織は、csへの曝露後に遅くなりました。CLIAの鼓動頻度が低いと、粘液や感染性病原体を除去する効率が低下します。マイクロアレイ解析は、器官型、気管支、および鼻組織モデルにおけるCS曝露の影響を研究するために実施されました。ばく露後48時間。この CS の in vitro 影響を、気管支鏡検査と鼻上皮ブラッシングによってそれぞれ収集されたヒト気管支上皮組織に対する喫煙の影響と比較しました。ネットワークベースのシステム生物学は、in vivoデータセットとin vitroデータセットのバックボーンノード間に正の相関を示しています。この手順を試みる際には、これが新しく発展している研究分野であることを覚えておくことが重要です。一方には、十分に特徴付けられた有料エアロゾル曝露プラットフォーム、もう一方には、特定のアーキテクチャ、生化学的および機械的な手がかり、および組織または標的臓器に関連する微小環境の細胞細胞相互作用を最もよく模倣する3次元組織培養モデルで構成される可能性のある関連する実験システムの2つの主要なコンポーネントがあります。調査中です。

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