Name: 高精細フーリエ病理の改善に向けて赤外（FT-IR）ヒト組織切片の分光イメージングを変換する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶ赤外分光イメージングによる高精度組織解析。ラベルフリーで生化学情報を可視化し、病理診断や疾患進行の追跡に応用可能な革新的手法を習得する。

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私たちは、財政的支援のためにイリノイ大学シカゴ校の病理学部に感謝したいと思います。組織学および可視イメージングサービスは、研究副学長の支援を受けて設立されたイリノイ大学シカゴ校のリサーチリソースセンター-研究組織学および組織イメージングコアによって提供されました。また、Agilent Technologies社、特にFrank Weston氏には、IRレンズの追加提供と支援に感謝いたします。

1. FT-IR顕微鏡を設定し、組織画像を取得<ol><li>ミクロトームを用いてIR互換性のあるスライドに上のセクション4μmの厚さで、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック。代わりに、セクションクライオスタットを使用してIR互換性のあるスライド上4μmの厚さで液体​​窒素凍結組織。 注：典型的には、連続切片は、ガラススライド上に取得し、特別な（例えば、ヘマトキシリン​​及びエオシン（H＆E）など）、または免疫組織化学的染色で染色される。また、培養細胞株は、IR互換スライド上で成長させることができる。 IR互換スライド（例えば、MirrIRスライド、金）または送信モードイメージングのためのIR透明スライド（例えば、あるBaF 2、のCaF 2）、反射モードイメージングのためのIR反射性スライドすることができる。 </li><li>システムから大気中の水分を除去するために乾燥空気または乾燥窒素ガスのいずれかを使用してFT-IR顕微鏡と分光器をパージする。徹底したPURGを確実にするために画像化する前に、少なくとも45分待ってくださいE。 </li><li>クールFPA検出器の両方（79 K）および液体窒素を用いてFT-IR顕微鏡内部MCT検出器。検出器をほぼ毎6時間クール。 注意！液体窒素は、極低温流体であると冷たい火傷、凍傷と閉鎖された空間で窒息でを引き起こす可能性があります。 </li><li> FT-IRイメージング用の顕微鏡ステージ上のサンプルスライドをマウントします。 </li><li>サンプルに焦点を当て、可視光が「ON」した後、いずれか双眼鏡や（組織のリアルタイム可視画像を提供します）サンプルキャプチャプログラムを使用していることを確認します。 </li><li>そのようなプロの解像度などのバンドルソフトウェアパッケージを開き、「収集」をクリックし、次に「診断」をクリックし、「位置合わせ分光器」を選択します。分光器内部の検出器へのビーム​​経路が阻害されていないことを確認してください。 </li><li> 「イメージングの設定」をクリックします。 </li><li> 「エレクトロニクスのタブでは、土の下で &#39;、適切な「スピード」を選択システムに応じて比率（UDR）」と「フィルタ」の設定をmpling。 注：この例では、設定が、UDR = 4とフィルタ=なしスピード= 2.5 kHzです。 </li><li> 「オプティクス」タブで「ミッドIR源」、「開放絞り」と「100％のビーム減衰器が「選択されていることを確認。 </li><li> 、「オプティクス」タブで、システムを較正「アース」と「検出器」を選択し、「顕微鏡検出器」「左」として、その後、種類に応じて、「光学モード」の下に「透過率」または「反射率」のどちらかを選択するにはスライドが使用されている。 </li><li> 「ランサーコントロール」ウィンドウを開くであろう、セットアップをクリックします。 注：反射モードは、1.12と1.13でと伝送モードは、1.14から1.16の指示に従ってくださいするための指示に従ってください。反射と透過の両方に対して1.17から続行。 </li><li> 反射モードの場合 、中＆＃8216;生の「ランサー·コントロール」をクリックします」。ステージ制御ジョイスティックを使用し、FT-IRインタ​​ーフェロ像（右上画像）のライブビューを見て、スライド上のきれいな場所に移動。 </li><li>約8000カウントに積分時間を調整します。次に、構造と組織片、組織の好ましくはエッジを見つけるために、ステージを移動し、画像の焦点を完璧。焦点を改善するための画像を形成するのに役立つの変更「暖かさ」と「コントラスト」オプションは、これはIRデータには影響を与えません。 1.18から続行。 </li><li> 送信モードの場合 、「生の「オン」ランサーコントロール」クリックで。ステージ制御ジョイスティックを使用し、FT-IRインタ​​ーフェロ像（右上画像）のライブビューを見て、スライドのきれいな場所に移動。 </li><li>約8000カウントに積分時間を調整します。 </li><li>そのmaximuにカウント数を増加させるために底部焦点/コンデンサー目標を調整するM。それは外見でガウスと比較的均一であることを保証するためにランサーコントロールで右下の画像の形状を見る。約8000カウントに再び積分時間を調整します。 NOTE：FT-IRインタ​​ーフェログラム画像の画素のいずれかが白くなる場合は、積分時間を減少させる。 </li><li>構造を持つ組織片、組織の好ましいエッジを見つけ、画像の焦点を完璧にステージを移動します。必要に応じて、焦点を改善するための画像を形成するが、IRデータには影響を与えません助けるために暖かさとコントラストのオプションを変更します。 </li><li>ステージ制御ジョイスティックを使用して、スライドのきれいな場所に移動。 「キャリブレーション」ボタンを押します。 「範囲外（OOR） &#39;を確認した値が50未満であると「ハイフラックス」と「低フラックス」カウント間の差は、少なくとも4000カウントです。 </li><li>二回「OK」を選択します。光学のタブで選択します。 「検出器 &#39;=&#39; MCT &#39;、&#39;マイクロス&#39;=&#39;右の検出器を対処」し、[OK]をクリックし「SETUP」を。この時点で、画面上のFT-IRフェログラムがあるでしょう。 「センターバーストを探す」をクリックします。 「オーケー」をクリックします。 </li><li> 「オプティクス」タブで、「検出器 &#39;=&#39;グランド &#39;、&#39;顕微鏡検出器 &#39;=&#39;セットアップ」を「左」と選択を再度選択。 </li><li>ランサーコントロールで - 画像がきれいな部分に残っていることを確認して、もう一度「校正」をクリックします。 「オーケー」をクリックします。 </li><li>次に、雰囲気、システム及びスライドから吸光度を補正するために、バックグラウンドFT-IR画像を収集する。典型的には4 -1または8 cm -1の組織のための、「エレクトロニクスのタブに移動し、適切なスペクトル解像度を選択します。 </li><li> 「背景」タブに移動し、「共同追加するスキャン」に128を入力します。 「新規ファイル...」ボタンを選択し、適切な倍のバックグラウンドファイルを配置えー。モザイクは1.をクリックし「背景」により1であることを確認するための「イメージング」タブを確認し、終了し、どこにファイルを保存するように確認するためにスキャンを待つ。背景FT-IR画像上の領域をクリックして、スペクトルを確認してください。 </li><li>サンプルの大規模なモザイク画像を撮影するには、「イメージング」タブを選択し、あなたが取得したいモザイクサイズにXとYのフレーム数を挿入します。 </li><li> 「セットアップ」をクリックして、ランサーコントロールに関心領域を見つけるために、ライブIRビューを使用します。モザイクを取った場合、関心領域の中央にライブフィードをセンタリング。 「オーケー」をクリックします。 「エレクトロニクスのタブに移動し、共同追加するスキャン数（組織のための2と16スキャンの間に、通常値）を入力します。 「スキャン」をクリックします。 </li><li>それは集中見えることを確認するには、画面上で収集FT-IR画像を確認してください。その場所からIRスペクトルを起動するには、画像をクリックし、それがノイズに許容可能な信号を持つように見えることを確認してください。アックイサンプルの可視画像再。 </li><li>画像を保存して、そのようなENVI-IDLとして、必要な形式にエクスポートします。 </li></ol> 2.高精細機能のFT-IR顕微鏡の適応注：ほとんどのFT-IRシステムは、客観約15X倍率と0.5の開口数（NA）が装備されている。高精細モードの画像に、IR互換36Xまたは74X対物レンズは、回折制限された画像処理機能を与えるために使用することができる。 <ol><li>反時計回りに外して、システムの15X目標を削除します。 </li><li>その場所に36Xや74Xの目的のいずれかでねじ込みます。使用前に目的の位置を合わせます。サンプルに十分近い目標をもたらすために使用したレンズ延長チューブ。 </li><li>新しい目標の下で組織を置き、双眼鏡やサンプルキャプチャー·プログラムのいずれかを使用して可視光を使用して焦点を合わせる。 注：高精細イメージングは​​、送信モードで行う必要があります。の非常に近い作動距離SEの目標（1-2 mm）で、焦点の非常に浅い深さはサンプルに触れることなく目的を下げるために時間を割いて、ゆっくりと慎重に焦点が必要です。 </li><li> 1.6から1.11の指示に従ってください。 注：かなり集中することがより困難と検出器に到達するはるかに少ない光であることに起因して、以下のプロトコルを1.14に基づいて調整される。 </li><li>送信モードでは、「生」をクリックします。 （理想的にエッジで）ステージ制御ジョイスティックを使用し、FT-IRインタ​​ーフェロ像（右上画像）のライブビューを見て、組織および焦点に移動する。 注：これは、したがって（これらのオプションはなしIRデータには影響している）を中心向上させるために画像を形成を助けるために「暖かさ」と「コントラスト」オプションを調整、困難な場合がある。 </li><li>いったんステージ制御ジョイスティックとスライドのきれいな部分へのライブのIRビューの動きを使用して、焦点を当てた。約8000カウントに積分時間を調整します。対物の焦点を合わせるボトムを調整します最大限にカウント数を増やす。約8000カウントに再び積分時間を調整します。 </li><li>構造を持つ組織片、組織の好ましいエッジを見つけることが、ステージを移動し、画像の焦点を完璧。 </li><li>高解像度で画像をモザイクする場合、正確なモザイクのための距離間で必要な正しい動きを可能にするために、ステージを調整します。ステージ距離の設定を変更するには、ランサーコントロールの「セットアップステージ」に移動し、正しいモザイクを可能にするために、水平および垂直方向の配置設定を調整します。 </li><li>スライドのクリーンエリアにステージ制御ジョイスティックの動きを使用する。 「キャリブレーション」ボタンを押します。範囲外（OOR）値は36Xと74Xの両方の目的のために50未満であることを確認してください。ハイフラックスと低フラックス値の差が74Xの目的のために少なくとも1,000カウントと36Xの目的のために2000カウントであることを確認してください。 </li><li> 1.19から1.27続行。 1.23でのスキャンの数と1.25は、背景画像のための約256スキャンし、組織像のための16から128のスキャンに低減された信号のために調整する必要があります。 </li></ol> 3.可視化と分類IRスペクトルデータセット注：このセクションでは、我々はそのようなENVI + IDLとして地理空間画像処理解析ソフトを用いてスペクトル画像からデータを視覚化して抽出する方法を説明します、しかし、プロセスは、MATLABなどCytoSpecなどのフリーソフトウェアなどの任意の代替ソフトウェアのために非常に似ている、または機器の開発者自身のソフトウェア。 IRデータに対して実行することができるいくつかの異なるスペクトル処理技術がある。 <ol><li>オープン地理空間画像処理·解析ソフトとは、IRデータファイルをロードします。 </li><li> 「スペクトルツール」を選択することにより、IRデータにベースライン補正アルゴリズムを適用し、下にスクロールして「吸収スペクトル」をクリックします。ポップアップメニューを観察し、選択して &quot;ベースラインカレction &quot; 注：ベースライン補正が散乱によるデータからベースラインオフセットスロープを削除します</li><li>スペクトルの定義された領域の下で一定のスペクトルピーク（通常はアミドI（1650センチメートル-1）またはアミドII（1550センチメートル-1））または領域にデータを比率化することにより、スペクトル正規化を実行します。 「吸光スペクトル」メニューオプションの下に「通常のスペクトル」を選択することでこれを行います。 注：スペクトルの違いは、サンプル間の厚さや密度の違いによる実際の生化学的な違いとならないように、スペクトル正規化が行われる。 </li><li> 28、必要に応じてスペクトルからノイズを除去するノイズ低減アルゴリズムを使用する。 注：そのベースライン補正によって利用可能な複数のアプローチがあり、スペクトル正規化とノイズリダクションは、ほとんどのソフトウェアが組み込まれ、自動化アルゴリズムを持つ、達成することができますまた、のために修正しますアプローチの新興数があります。詳細29-42において議論されているスペクトルの収差。しかし、社会はまだ必要とされているこれらのどれに同意しません。 </li><li> （通常は900〜4000 -1からのスペクトル範囲の）画像内で収集全てのIR周波数のリストを確認します。選択された周波数で組織の画像を観察するために特定の生体分子に対応した周波数をクリックします。 <ol><li>例えば、試料中のタンパク質の分布を観察するために1650センチメートル-1バンドをクリックする。別の方法として、サンプル中の核酸の分布を観察するために1080センチメートル-1バンドをクリックしてください。 1650センチメートルを波数-1を使用。 </li></ol></li><li>異なる生体分子成分の可視化を可能にするなど、スペクトルのピーク高さ比、ピーク面積比を計算することによって、追加の画像を作成します。 「スペクトラルツール」をクリックし、「ピーク高さ比」または「計算画像領域」のいずれかを選択イメージを作成する。 </li><li>明視野画像を取得する独立したスライド全体のイメージャシステムを用いて染色されている対応する隣接組織切片をスキャンします。 IR画像と並んで、可視画像プログラムで染色した組織のデジタル画像を持ち出す。 </li><li>右関心領域での画像をクリックして、 &#39;Zプロファイル」を選択します。これは選択されたピクセルのスペクトル情報を提供します。 </li><li>そのような細胞タイプ、疾患の状態を比較するなど、複数のクラスからの複数の画素のIRスペクトルを見てください。 「関心領域」（ROI）ツールを使用して、画像上のマークの特定のピクセル。これを実行するには、画像の上で右クリックして、「ROIツール」を選択します。たとえば、通常、異形成、および癌のクラスの、ラベルに使用するクラスを作成します。 「ポイント」 - その後、「ROIの種類]を選択します。その後のピクセルを選択して、IR画像上の適切なピクセル上に描画するクラスを選択します。平均スペクトルFを導き出すまたは「平均ROI」ツールを使用して、クラスのそれぞれ。 </li><li>ソフトウェアをグラフにプロットすることによって導出スペクトルを比較してください。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

FT-IRは、病理診断の現在の水準の向上に重要な役割を持っている可能性のある、組織切片のラベルフリーの生化学的画像化のための新たなモダリティである。病状のための現在のゴールドスタンダードは、生検をホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋される組織を必要とし、複数回区分し、複数の汚れで染色した。高度な訓練を受けた病理学者は、主観的に視覚的に診断を決定するために、組織構造や細胞形態を評価することがあります。ここでは、セクションの同じタイプから高解像度IR画像を収集し、細胞型および疾患状態の間の化学的相違を調べるために、計算のアプローチのいくつかを議論する方法を示す。 このプロトコル内での重要なステップは、組織は非常に慎重に集中していることを確認するためであるとことは、システムが十分に非常に高品質の分光データを保証するために較正される。システムのセットアップケアは特にcritiです<html> CALは、高倍率の目的で作業する場合。トラブルシューティングを支援するために、以下のリストは、遭遇した潜在的な困難の一部をカバー。 問題：反射撮像低IR強度。ソリューション：反射コーティングスライドの間違った側にあってもよいようにIRスライドの向きを確認してください。 問題：ランサーControlでのLow信号/レッド警告サイン。ソリューション：LN2とクールな検出器。液体窒素はFPA検出器が機能するために必要とされ、定期的に補充されている必要があります。 問題：速度エラー/運動エラー。ソリューション：分光器をリセットし、振動を低減。振動は干渉計で動くミラーが邪魔されることになります。 問題：データ中の水蒸気スパイク。解決策：システム上のパージを増やし、空気からサンプルを保護する。 問題：無効なセンターバースト。解決策：再びセンターバースト検索。 e_content &quot;&gt;問題：透過率の低いフラックス違い、焦点を当てていても解決方法：IR光を試料上の点に集束されていないように底のコンデンサーを調整してこれが発生します。 本稿では、伝送またはトランスフレクモードのいずれかで組織の高精細赤外線画像を取得する方法に焦点を当てている。 FT-IRイメージングの性質は、そのような基板の種類、固定法、試料の厚さ、スペクトル分解能、干渉計ミラーの速度など、これらのパラメータの影響、等のデータ収集を行うことができる多数の修飾が存在することである有​​し最近4,5,17,51広範で詳細に説明されて。 ATRモード10,24,26の撮像を含む、高解像度IRイメージングを可能にするためにナノスケール熱アプローチ52,53を用いた撮像システムに対してなされ得る多数の修飾がある。高解像度IRイメージングの主な制限は、TIのことであるssuesは、（通常は4μmの厚さ）を通過するように入念に準備し、IRのために十分な薄されなければならない。また、送信及び反射FT-IRイメージングは​​、水によるIRの吸光度に乾燥しているサンプルを必要とします。しかし、FT-IRイメージングは​​豊富で詳細な生化学的情報を導出しながら、組織の非常に迅速に画像の大きな領域ができるという点で、他の技術に対して重要な利点を有する。ラベルフリーの方法で生化学的情報を導出する他の同様の技術は、ラマン分光法、ただし、データ取得時に画像を取得するために非常に遅いが挙げられる。新しいラマンイメージング手法は、誘導ラマン散乱（SRS）とコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）を含む出現している。しかしながら、それらは、アクセス制限されたスペクトル範囲又は単一周波数イメージングを有する。 データ収集、空間分解能、および計算手法の利用可能性の速度の進歩は、FT-IRの虚部を製造するのに多大な価値があった病理学の新しいイメージングツールとしての翻訳のためのより実現可能なアプローチをる。空間分解能の最近の進歩に起因従来のFT-IRイメージングシステムを使用して解決可能でない重要な細胞型への組織病理学のために特に重要であった。レディらによる最近の論文。 FT-IRイメージング·システム5の最適な空間分解能を得るために理想的なシステムをモデル化する方法を示した。本論文で提示腎組織の例では、糸球体の構造（ 図3と図5）からの生化学的情報を抽出するために、より高い空間分解能の重要性を示している。将来的には、量子カスケードレーザにおける新たな進歩として非常に明るいIR光源54-57、3Dスペクトルイメージング58、および52,53,59,60が持つ研究のエキサイティングな新しい道を保持するナノスケールのIR技術の分野におけるブレークスルー組織イメージングの将来に大きな意味。 <p cl診断的価値がある付加的な生化学的情報の必要性がある場合のお尻= &quot;jove_content&quot;&gt;我々は肝臓と腎臓病におけるアプリケーションの例を提示している。シカゴのイリノイ大学の病理学部におけるスペクトル病理研究室は、病気の診断や患者の転帰の改善された予測の改善に向けたIRイメージング技術の翻訳に焦点を当てている。 FT-IRイメージングは​​、定量的かつ客観的な情報が必要な病理実際には電流制限の一部を克服することができる。特に、今後は現在の技術では十分な診断感度を提供するか、または限られた情報を提供することができ、現在の病理学の実践の領域を同定することに焦点を当てている。明らかに必要と病理の現在の実務を改善し、高精細なFT-IRイメージングを用いて達成可能で患者の疾患状態について病理学者、より多くの情報を与えるに向かって存在する。

IR分光法は、1930年代以来、何らかの形で利用可能な分析ツールとなっています。しかし、それだけでFT-IRによる組織画像の面積が爆発したこと最後の10年以内になっている。組織画像化のためのFT-IRの進歩は、3つの主要動向によって大部分が駆動されています：1）は、通常、IR感度検出器1の数千を持っている大規模な焦点面アレイ（FPA）検出器の利用可能性データ収集の速度を増加、2、2）高度な処理アルゴリズムの開発及び大規模なハイパースペクトルデータセット3を取り扱うための計算能力、および3）FT-IRイメージングシステムのモデル化は、空間分解能4,5を最大化する。組織17からポイントスペクトルや地図を入手するための手順を詳細にネイチャープロトコル紙に加え、数々の高品質と最近6-16を FT-IR分光法の分野の見直しを非常に大規模な記事がありました。本稿では、protのに焦点を当てます高精細機能を有する改変FT-IRシステムで128×128 FPA検出器を使用して組織の画像を得るためocol。 FT-IRイメージングは​​、長いすべてのピクセルは、生化学豊富な情報を有する画像を得る能力に起因する、細胞および組織のイメージングのための潜在的に望ましいツールであることが示唆されている。 FT-IRイメージングは​​、サンプル中の異なる生体分子を定量的に中赤外線の異なる領域を吸収するという原理に基づいている。これは、「生化学的指紋」の導出が可能になります。このフィンガープリントは、異なる細胞型および疾患状態の間で変化させるために多くの研究で示された。汚れ及び免疫組織化学的マーカーは、診断および治療選択肢を導くために使用される細胞タイプおよび組織構造を可視化し、識別するために使用する必要がある従来の病理学の実践とは異なり、FT-IRからの画像は、組織の固有の生化学に基づいて形成される。現在techniq診断のための染色組織のueが、時間がかかり、面倒で、破壊的であり、FT-IRは、このプロセスは、迅速な非破壊、高度に自動化され、より客観的にする可能性を提供する一方で、病理医の主観的な専門知識を必要とする。また、FT-IRは、従来の染色技術を用いて容易にアクセスできないかもしれない付加的な生化学的情報を得るための新規な経路を提供する。 近年の最も刺激的な進歩の一つは、現在、包括的な疾患の診断のために重要である細胞タイプおよび組織構造の可視化および特徴付けを可能にすることができる高解像度イメージング手法の利用可能性であった。これらの技術の1つは、多くの非常に刺激的な研究が、そのアプリケーション19-25を示すとともに、高解像度画像18を可能にする高屈折率のソリッドイマージョンレンズ（SIL）を内蔵して減衰全反射（ATR）FT-IRである。加えて、それワットとして最近ATR画像に関 ​​連付けられた増加した空間分解能が内皮細胞および乳癌診断26の主要な構成要素を形成乳房組織における筋上皮細胞の可視化および分類を可能にすることができることを実証した。 ATRイメージングは​​非常に有用であるが、この技術は、FT-IR画像を形成する組織と接触するようにSILを必要とする。したがって、その使用は多少の組織の大きな領域を迅速に画像化されなければならない組織病理学のために制限されています。 第二のアプローチは、IRの明るい源としてシンクロトロンを使用する既存のFT-IRシステムに高倍率の対物レンズを結合することによって実証された、それは完全に0.54 xは0.54ミクロンの有効画素サイズのFPAおよび画像を照明することが可能である。私たちは、従来のFT-IRシステム4を使用して解決可能ではなかった乳癌および前立腺組織における主要な構造を視覚化するためにこれが許可された。 IR画像の空間resolutioでこれらの劇的な増加ながらnはエキサイティングであった、その使用は、シンクロトロンを必要とする制限されたままであった。続いて、最適なシステムは、シンクロトロン源を必要とせずに1.1×1.1μmの画素サイズを有する高精細画像処理機能を可能にではなく、伝統的なグローバーのIR源5を用いなかったことを設計した。この記事では、複数のIR目標（15X、36X、および74X）を使用して、対雑音比が許容可能な信号を有する組織の回折限界のIRイメージングを可能にするために、既存の市販のFT-IRイメージングシステムを修正する方法を示しています。 3つの目的を持つ有効画素サイズは5.5 xは5.5ミクロン（15X）、2.2×2.2ミクロン（36X）と1.1×1.1ミクロン（74X）。次に、肝臓および腎臓生検27における疾患検出のための空間分解能の向上の重要性のいくつかの例を与える。

<table><tbody><tr><td>Cary 600 シリーズ FT-IR システム</td><td>Agilent</td><td>複数の構成&nbsp;</td><td>代替のFT-IRイメージングシステムが存在する</td></tr><tr><td>調整可能なReflX対物レンズ 74X/0.65 NA IR</td><td>エドモンド光学系</td><td>66-592</td><td></td></tr><tr><td>調整可能なReflX対物レンズ 36X/0.5 NA 赤外線 エ</td><td>ドモンド光学系</td><td>66-586</td><td></td></tr><tr><td>MirrIRスライド</td><td>ケブリーテクノロジー</td>ズ <td>CFR</td><td>FT-IR反射モード測定用</td></tr><tr><td>フッ化バリウムスライド</td><td>インターナショナルクリスタルラボラトリ</td>ーズ <td>複数のサイズ</td><td>FT-IR透過モード測定用</td></tr><tr><td>フッ化カルシウムスライド</td><td>International Crystal Laboratories</td><td>複数のサイズ</td><td>FT-IR透過モード測定用</td></tr><tr><td>乾燥窒素/乾燥空気ガス</td><td>複数のガス供給者</td><td>複数のサイズ</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>複数のサイズ</td><td>組織の麻痺除去用</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>複数の極低温液体供給者</td><td>複数のサイズ</td><td></td></tr><tr><td>ENVI-IDLソフトウェア</td><td>Exelis-Vis</td><td></td><td>その他のソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>ホールスライドイメージャー</td><td>スキャンスコープ(Aperio)またはナノズーマー(浜松ホマツ)</td><td></td><td>汚れたスライドを画像化するには</td></tr></tbody></table>

高精細フーリエ病理の改善に向けて赤外（ft-ir）ヒト組織切片の分光イメージングを変換する

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

高精細なフーリエ変換赤外（FT-IR）分光イメージングフーリエ生化学的情報が関連付けられている詳細な画像を得るための新たなアプローチである。組織のFT-IRイメージングは、中赤外の異なる領域は、次に存在し、組成物に関連することができる細胞または組織内の異なる化学結合（ 例えば、C = O、CH、NH）によって吸収されるという原理に基づいている生体分子（ 例えば、脂質、DNA、グリコーゲン、タンパク質、コラーゲン）。 FT-IR画像では、画像内の各ピクセルは、細胞型又は疾患の型分類のために利用することができる細胞の生化学的状態に関する情報を与えることができる全体の赤外線（IR）スペクトルを含む。高精細画像処理機能を可能にするために、既存の機器を変更する方法、FT-IRシステムを使用して、ヒト組織からのIR画像を取得する方法、およびどのようにFT-IRイメージを視覚化するために：本論文では、表示されます。次に、FT-IRのいくつかのアプリケーションを紹介病理学のために、例として、肝臓と腎臓を使用。 FT-IRイメージングは​​、疾患プロセスの一部として、生体分子の変化に新たな洞察を与えることに向けて完全に無標識の非摂動経路で細胞および組織からの生化学的情報を得るための新規経路を提供するのにエキサイティングなアプリケーションを保持する。さらに、この生化学的情報は、潜在的に病気の診断の特定の態様の目的と自動分析を可能にすることができる。

FT-IRイメージングは​​、対象のIR周波数に応じて異なるコントラストを与えることができ、組織のIR画像の導出を可能にする。加えて、IR画像において、全ての画素は、細胞型または疾患状態（ 図1）の生化学的特性についての情報を与えることができる別の生体分子に対応する異なるピークが、全体のIRスペクトルを含む。ここでは、しかし、より高度な自動化された分類が上で実行することができるように、ベイズ分類、ランダムフォレスト、人工ニューラルネットワーク、および階層型クラスター分析などの追加のアルゴリズム3,43-50を 、使用して可能で、クラス間のスペクトルシグネチャを比較する方法を示しているデータ。教師付き分類手法は、細胞型又は疾患状態の、自動認識を可能にするために訓練することができる分類器の構築を可能にする。教師なし分類手法は、天然のdif発生を探すために使用することができ組織または生化学的な差異に起因する細胞内のferences。 FT-IRの計測は、透過モードまたは単一目的で収集目的と相まって、照明目的のいずれかを使用して、カセグレン目的を用いた撮像モードにIR不透明な開口を使用して、単一のポイント/マッピングモードでの測定から、過去数十年にわたって進化してきた点灯し、反射モードで収集した（ 図2）の両方をその。最近、透過モードで収集目的は、収集されたIR画像4,5の空間分解能の実質的な増加をもたらすことが、回折限界IRイメージングを可能にするために高倍率及び開口数の対物レンズのために実行を切り替えることができることが実証された。我々は今、例えば、腎臓の糸球体の機能ユニットの細胞型および組織構造を識別できるように、組織のイメージングのための空間分解能の進歩は、社内で適合さ用いて、非常に重要であったFT-IRシステム（ 図3）。 高精細FT-IRイメージングは​​、異常領域を特定し、異なる細胞型の間の生化学的差異を同定するために検査されるべき組織の詳細な画像を可能にする。肝臓組織コアでは、異形成および非異形成性肝硬変（ 図4）の2つの別個の領域に分割する線維症の浸潤、肝細胞及び領域を可視化することが可能である。私たちは、肝疾患の困難なケースで使用するために自動化された診断ツールを作るに向けてこれを利用するために取り組んでいます。 重要なことは、増加した空間分解能は現在、私たちは組織学的変化は明らかである前に、化学的に病気によって修飾することができる特定の構造的特徴を分離できるようにすることができます。例えば、私たちは前に、そのようなボーマン嚢、メサンギウム、糸球体基底膜と筒状基底膜などの腎糸球体構造における生化学的変化を特定することに焦点を当てている<html>病理学者により同定変化（ 図5）を観察することができる。特に、我々は、現在の技術は、成功した介入の初期の十分な様式の変化を識別することができない移植患者における糖尿病性腎症および慢性拒絶反応の進行に関連する変化を同定することに興味を持っている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig1.jpg" /> 肝臓コアから図1のFT-IR画像とスペクトル。（B）3286センチメートル-1及び（C）において同じコアの連続切片のIR吸光度の肝生検と画像から（A）H＆E染色された核の写真2603異なる構造的特徴を強調-1、。標識された重要なピークを有する（D）組織の典型的なIRスペクトル。スケールバー=100μmである。fig1large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig2.jpg" /> 図2の光学模詳述FT-IR顕微鏡の動作モード（A）伝送モードでは、サンプルは、底部対物レンズを通して照射され、試料を通過する光は上部対物レンズによって収集される。 （B）、反射モードでは、トップの目的は、試料を照射し、反射光を収集するために、両方の役割を果たす。底の目的が使用されていない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig3.jpg" /> differenの図3.比較2925センチメートル-1 NAと。（A）15X収集目的= 0.5（5.5 X 5.5ミクロンピクセルサイズ）での腎糸球体のFT-IR画像上のT顕微鏡対物レンズ。 NAと（B）36X集目的= 0.5（2.2×2.2μmの画素サイズ）。 （C）NA = 0.65（1.1×1.1μmのピクセルサイズ）と74X収集目的。スケールバー=50μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig4.jpg" /> 肝臓コアにおける線維症と肝細胞との間に、図4のスペクトルの違い。肝生検から（A）H＆E染色されたコア。 （B）FT-IR（36X客観セットアップ）でスキャンシリアル部コアのイメージ。 （C）議員買上（A）に矢印で示した組織の領域から採取した肝細胞および線維のスペクトル、および（B）。スケールバー=100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52332/52332fig5.jpg" /> 高精細FT-IRイメージングの使用を介して腎組織生検の特徴の図5の分化（A）素酸-シッフは、標識された抽出される特徴を有するセクションを染色した。 （B）同じ組織の連続切片のCH 2非対称伸縮領域（36X客観セットアップ）の高精細FT-IR画像。 （C）は 、化学的にはdifにできるようにする（B）におけるFT-IR画像を用いて抽出した（A）で標識された特長組織の4つの特徴をferentiate。スケールバー=50μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52332/52332fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

フーリエ変換赤外(FT-IR)分光イメージングは、細胞や組織の生化学的データセットを取得するための高速でラベルフリーのアプローチです。ここでは、疾患診断の改善に向けて、組織切片の高解像度FT-IR画像を取得する方法を示します。

高精細フーリエ病理の改善に向けて赤外（FT-IR）ヒト組織切片の分光イメージングを変換する

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

この手順の総合的な目的は、組織サンプルの高精細赤外線画像を取得することです。まず、赤外線対応スライドに組織サンプルを薄切することでこれを実現します。次のステップでは、適切な対物レンズを取り付け、高精細イメージング装置をセットアップします。次に、基質の背景を収集し、組織サンプルをスキャンします。最後のステップは、適切なソフトウェアを使用してデータの処理と可視化を行うことです。最終的に、高精細赤外線イメージングを用いることで、生物学的組織から非侵襲的に生化学情報を可視化し、取得することが可能になります。光顕微鏡などの既存の手法に対する本技法の主な利点は、染料やプローブを使用せずに組織固有の生化学的特性を研究できる点にあります。この手法は、糖尿病性腎症の再発予測や、肝細胞癌による肝疾患の進行度の分類など、病理学分野における重要な疑問への回答に寄与します。従来の組織病理学では得られない膨大な生化学的情報を提供できるため、本技法がもたらす意義は、疾患の診断および予後予測にまで及びます。この手法は診断に使用できるだけでなく、創傷治癒過程における変化の追跡や、胃腸管や脳における幹細胞などの重要な組織学的特徴の特定にも利用可能です。まず、ミクロトームを用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを4 µmの厚さでIR対応スライドに切片作成します。次に、乾燥空気を用いてFTIR顕微鏡および分光計をパージし、システム内から大気中の水分を除去します。その後、液体窒素を用いて、顕微鏡内の焦点面アレイ検出器と内部水銀カドミウムテルル検出器の両方を冷却します。可視光が点灯していることを確認した後、FTIRイメージング用にサンプルスライドを顕微鏡ステージにセットし、サンプルキャプチャプログラムを使用してサンプルに焦点を合わせます。次に、バンドルソフトウェアパッケージを開き、「collect」をクリックします。「diagnostics」をクリックし、ライン分光計を選択します。その後、「imaging setup」をクリックしてシステムをキャリブレーションします。Opticsタブで、detectorにground microscope detector as leftを選択し、次にoptics modeでtransmittanceを選択します。setupをクリックすると、lancer controlのtransmission mode用のlancer controlウィンドウが開きます。ステージコントロールジョイスティックを使用してrawをクリックし、FTIRインターフェログラム画像のライブビューを確認しながら、スライドの汚れのない領域へ移動させてください。この時点で、積分時間を約8,000カウントに調整し、下部コンデンサー対物レンズを調整します。カウント数を最大まで増やす際は、Lancer Controlの右下の画像を確認し、形状がガウス分布であり、比較的均一であることを確認してください。積分時間を調整した後、再度ステージを移動させ、構造を持つ組織部位、できれば組織の端の部分を探します。次に、画像のピントを正確に合わせます。ステージコントロールジョイスティックを使用して、スライド上の汚れのない領域に移動します。選択後、キャリブレーションボタンを押してください。次に、「Optics」タブで、Detectorに「MCT」、Microscope Detectorに「Right」を選択します。その後、「Setup」をクリックしてください。画面にFTIRインターフェログラムが表示されたら、「Find Center Burst」をクリックし、「OK」を選択します。光学タブで、検出器を「ground microscope detector equals left」に再選択します。次に「setup」を選択します。Lancer Controlで画像が引き続きクリーンな領域にあることを確認した後、再度「calibrate」をクリックし、「okay」を選択してください。バックグラウンドFTIR画像を収集するには、「electronics」タブに移動し、通常4または8 inverse centimetersである適切なスペクトル分解能を選択します。組織サンプルの場合は、「background」タブに移動し、「scans to coad」に128と入力します。「new file」ボタンを選択し、バックグラウンドファイルを適切なフォルダに保存してください。「background」をクリックし、スキャンが完了するまで待機した後、ファイルの保存先を確認します。背景のFTIR画像上の領域をクリックし、スペクトルを確認してください。ここで「setup」をクリックし、「lancer control」でライブIRビューを使用します。解析領域を特定するために、「electronics」タブに移動し、コアド（coad）するスキャン回数を入力します。次に、「scan」をクリックします。FTIR顕微鏡を高解像度解析の準備にするには、15倍対物レンズの代わりに高倍率対物レンズをねじ込んで装着します。この時点で、画像処理・解析ソフトウェアを開き、IRデータファイルを読み込みます。「Spectral tools」を選択し、下にスクロールして「Absorbent spectra」をクリックして、IRデータにベースライン補正アルゴリズムを適用します。ポップアップメニューが表示されたら、「Baseline correction」を選択してください。「Absorbent spectra」メニューのオプションにある「Normalized spectra」を選択し、スペクトル正規化を行います。次に、画像内で収集されたすべてのIR周波数のリストを確認します。特定の生体分子に対応する周波数をクリックすると、選択した周波数での組織画像が表示され、さまざまな生体分子成分を可視化することが可能です。「spectral tools」をクリックし、「peak height ratios」を選択してください。IR画像とともに明視野画像を撮影できる別のホールスライドイメージングシステムを使用して、対応する隣接染色組織切片をスキャンします。可視画像プログラムを用いて、染色組織のデジタル画像を表示させます。次に、関心領域の画像上で右クリックし、Zプロファイルを選択して、選択したピクセルのスペクトル情報を表示します。画像上の特定のピクセルにマークを付けるには、画像を右クリックしてROIツールを選択します。ラベル付けするクラス（例えば、糸球体およびボウマン囊クラス）を作成します。次に、ROIタイプとして「ポイント」を選択し、ピクセルを選択するクラスを指定して、IR画像上の適切なピクセルに描画します。平均ROIツールを使用して、各クラスの平均スペクトルを算出します。最後に、プロットによって算出されたスペクトルを比較します。グラフ作成ソフトを用いたFT IRイメージングでは、IR周波数に応じて異なるコントラストを得ることができる組織のIR画像の導出が可能です。各ピクセルは全スペクトルで構成されており、異なる生体分子に対応する個々のピークが、細胞型や疾患状態の生化学的特性に関する情報を提供します。FTIR装置は、不透明なアパーチャを用いたシングルポイントのマッピングモードによる測定から、CASAグレイン対物レンズを用いたイメージングモードへと進化しました。これは、透過モードにおいて照明用対物レンズと収集用対物レンズを組み合わせるか、あるいは反射モードにおいて照明と収集を単一の対物レンズで行う形式となっています。組織イメージングにおける空間分解能の向上は、細胞型や組織構造の特定が可能になったため、極めて重要な意味を持っています。本症例では、肝組織コアにおいて腎糸球体の機能単位が観察されました。肝細胞、および異形成領域と非異形成性肝硬変領域の2つの異なる領域を分ける浸潤性線維化領域を可視化することが可能です。空間分解能を高めることで、組織学的な変化が顕著になる前に、疾患によって化学的に修飾される可能性のある特定の構造的特徴を単離することができます。ボウマン嚢、メサンギウム、糸球体基底膜、および尿細管基底膜などの腎糸球体構造における生化学的変化は、FTIRイメージングによって同定することが可能です。この手順を実施する際は、スキャンを行う前にスライドを完全に脱パラフィンすることを忘れないでください。生化学的シグネチャーと組織形態を相関させるために、同一の組織切片を用いて、従来の免疫化学的分析などの他の手法を行うことができます。本技術は、組織イメージング分野の研究者が、組織内の微小な細胞型や構造の生体分子状態を探索するための道を切り拓いた最初の開発事例です。このビデオを視聴することで、組織サンプルの高精細なFTR画像を取得し、基本的なスペクトル分析を行うための基礎的な理解を深めることができます。液体窒素の取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は、耐凍結手袋や保護ゴーグルなどの安全対策を必ず講じてください。

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