高精細フーリエ病理の改善に向けて赤外（FT-IR）ヒト組織切片の分光イメージングを変換する

フーリエ変換赤外(FT-IR)分光イメージングは、細胞や組織の生化学的データセットを取得するための高速でラベルフリーのアプローチです。ここでは、疾患診断の改善に向けて、組織切片の高解像度FT-IR画像を取得する方法を示します。

この手順の全体的な目標は、組織サンプルの高解像度赤外線画像を取得することです。これは、最初に組織サンプルを赤外線対応スライド上に切片化することによって達成されます。2番目のステップは、適切な対物レンズを設置して高解像度イメージング装置をセットアップすることです。

次に、基質の背景を収集し、組織サンプルをスキャンします。最後のステップは、データ処理と視覚化に適切なソフトウェアを使用することです。最終的に、高解像度赤外線イメージングは、摂動のない方法で生体組織から生化学情報を視覚化および取得するために使用されます。

光学顕微鏡のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、染料やプローブを使用せずに組織の固有の生化学を研究できることです。この方法は、糖尿病性腎症の再発の予測やHEPA車骨形成による肝疾患の進行の分類など、この分野の病理学に対する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味するところは、従来の組織病理学では得られない膨大な量の生化学的情報を提供することを考えると、疾患の診断と予後にも及びます。

ただし、この方法は診断に使用できます。また、創傷治癒の過程の変化を追跡し、消化管や脳の幹細胞などの主要な組織の特徴を特定するためにも使用できます。フォーマルで固定されたパラフィンの最初のセクションは、ミクロトームを使用してIR適合スライドに4マイクロメートルの厚さで組織ブロックを埋め込みました。

これに続いて。FTIR顕微鏡と分光計を乾燥空気を使用してパージし、システムから大気中の水を取り除きます。次に、焦点面アレイ検出器と内部のテルル化水銀カドミウム検出器の両方を液体窒素を使用して顕微鏡で冷却し、可視光がオンになっていることを確認した後、FTIRイメージング用の顕微鏡ステージにサンプルスライドをマウントし、サンプルキャプチャプログラムを使用してサンプルに焦点を合わせます。

次に、バンドルソフトウェアパッケージを開き、[収集]をクリックします。[診断]をクリックし、ライン分光器を選択します。次に、[イメージングセットアップ]をクリックしてシステムをキャリブレーションします。

光学タブで、左のように地上顕微鏡検出器として検出器を選択し、光学モードで透過率を選択します。[セットアップ]をクリックすると、ランサーコントロールの送信モードのランサーコントロールウィンドウが開きます。ステージコントロールジョイスティックを使用してRAWをクリックし、FTIRインタフェログラム画像のライブビューがスライドのきれいな領域に移動するのを確認します。

この時点で、積分時間を約 8, 000 カウントに調整し、下部コンデンサーの対物レンズを設定します。カウント数を最大まで増やすには、ランサーコントロールの右下の画像の形状を監視して、外観がガウス分布であり、比較的均一であることを確認します。積分時間を調整した後、再度、ステージを動かして、構造のある組織片、できれば組織のエッジを見つけます。

次に、画像のピントを完璧に合わせます。ステージコントロールジョイスティックを使用して、スライドのきれいな領域に移動します。選択後、キャリブレーションボタンを押します。

さて、光学系タブで、検出器がMCTと等しい、顕微鏡検出器が右に等しいことを2回選択します。次に、[セットアップ]をクリックします。FTIRインタフェログラムが画面に表示されたら、[find center burst]をクリックしてOKをクリックします。

光学系タブで、検出器を [地上顕微鏡の検出器] を [左] と再度選択します。次に、[セットアップ] を選択します。画像がランサーコントロールのきれいな領域にあることを確認したら、もう一度[キャリブレーション]をクリックしてOKをクリックします。

背景のFTIR画像を収集するには、[エレクトロニクス]タブに移動し、適切なスペクトル解像度(通常は4〜8逆センチメートル)を選択します。組織の場合は、背景タブに移動し、スキャンで128を入力してcoadします。[新しいファイル] ボタンを選択し、背景ファイルを適切なフォルダーに配置します。

[背景]をクリックしてスキャンが終了するのを待った後、ファイルの保存場所を確認します。背景の領域、FTIR画像をクリックし、スペクトルを確認します。この時点で、[セットアップ]をクリックし、ランサーコントロールでライブIRビューを使用します。

関心のある領域を見つけるには、[エレクトロニクス]タブに移動し、コード化するスキャンの数を入力します。次に、[スキャン]をクリックします FTIR顕微鏡を高解像度分析用に準備するには、15 x対物レンズの代わりに高倍率対物レンズをねじ込みます。この時点で、画像処理および解析ソフトウェアを開き、IRデータファイルをロードします。

スペクトルツールを選択してIRデータにベースライン補正アルゴリズムを適用し、下にスクロールして吸収性スペクトルをクリックします。ポップアップメニューが表示されたら、「ベースライン補正」を選択します。スペクトルの正規化を実行するには、吸収性スペクトルのメニューオプションで正規化されたスペクトルを選択します。

これに続いて、画像内で収集されたすべてのIR周波数のリストを確認します。特定の生体分子に対応する周波数をクリックして、選択した周波数で組織の画像を観察し、さまざまな生体分子成分を視覚化できる画像を作成します。スペクトルツールをクリックし、ピーク高さ比を選択します。

IR画像と一緒に明視野画像をキャプチャする別のホールスライドイメージャーシステムを使用して、対応する隣接する染色組織切片をスキャンします。可視画像プログラムで染色された組織のデジタル画像を表示します。次に、関心領域で画像を右クリックし、[Zプロファイル]を選択して、選択したピクセルのスペクトル情報を提供します。

画像上の特定のピクセルをマークするには、画像を右クリックしてROIツールを選択します。ラベルを付けるクラス (Meum クラスや Bowman のカプセル クラスなど) を作成します。次に、ROIタイプのポイントを選択し、これに続いてピクセルを選択するクラスを選択し、IR画像上の適切なピクセルに描画します。

平均 ROI ツールを使用して、各クラスの平均スペクトルを導き出します。最後に、プロットして導出されたスペクトルを比較します。グラフ作成ソフトウェアでは、FT IRイメージングにより、IR周波数に応じて異なるコントラストを与えることができる組織のIR画像の導出が可能になります。

すべてのピクセルは、細胞の種類や疾患状態の生化学的特性に関する情報を提供できるさまざまな生体分子に対応するさまざまなピークを持つスペクトル全体で構成されています。FTIR機器は、不透明な開口部を使用したシングルポイントマッピングモードでの測定から、透過モードでの収集対物レンズと組み合わせた照明対物レンズ、または反射モードでの照明と収集の両方を行う単一の対物レンズを使用したCASA粒子対物レンズを使用したイメージングモードに進化しました。組織イメージングの空間分解能の進歩は、細胞の種類や組織構造を同定できるようになったため、非常に重要になっています。

この場合、腎臓糸球体の機能単位が肝臓組織のコアで観察されました。肝細胞と、異形成と非異形成性肝硬変の2つの異なる領域を分割する浸潤性線維症の領域を視覚化することが可能です。空間分解能の向上により、組織学的変化が明らかになる前に疾患によって化学的に修飾される可能性のある特定の構造的特徴を分離することができます。

ボーマン嚢、meum、糸球体基底膜、管状基底膜などの腎臓糸球体構造の生化学的変化は、FTIRイメージングを通じて同定できます。この手順を試行するときは、この手順に従ってスキャンする前にスライドを完全に削除することを覚えておくことが重要です。従来の免疫化学分析のような他の方法は、生化学的特徴と組織形態を相関させるために、同じ組織切片に対して実行できます。

私たちの最初の開発であるこの技術は、組織イメージングの分野の研究者が、組織内の小さな細胞タイプと構造の生体分子状態を探索する道を開きました。このビデオを見れば、組織サンプルの高解像度FTR画像を取得し、基本的なスペクトル分析を行う方法の基本を理解できるはずです。液体窒素での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、クライオセーフグローブや安全ゴーグルなどの安全対策を常に講じる必要があることを忘れないでください。