化学物質安全性のスクリーニングおよびシステム生物学データの生成のために発生毒性アッセイベースのヒト多能性幹細胞

この手順の全体的な目標は、ヒト胚性幹細胞とトランスクリプトーム研究に基づく2つのin vitro発生毒性試験システムについて説明することです。これは、まずマウス胚性線維芽細胞上でヒト胚性幹細胞を培養することによって達成されます。2番目のステップは、ヒト胚性幹細胞に3つの胚葉すべての細胞を生成できるエンブリー体を形成させるか、それらを神経外胚葉前駆細胞に分化させることです。

次に、胚体または神経外胚葉前駆細胞を、分化中に異なる濃度で目的の化合物で処理します。最後のステップは、細胞の生存率を評価し、RNAを単離することです。最終的には、トランスクリプトームマイクロアレイ解析を使用して、目的の化合物で処理された細胞のRNA発現の変化を未処理の対照細胞と比較して示します ヒトネオニコチノイド幹細胞とDNAマクロ領域に基づいて、ヒトに関連する発生毒性の影響をモニタリングできるin vitro方法論を確立しました。

この方法論は、製薬および化学業界が潜在的な薬物や環境毒物の安全性スクリーニングに適用できます。この方法は、化学物質が超初期の神経発達に及ぼす影響など、発生毒性の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、幹細胞培地サプリメントを室温で解凍し、400ミリリットルの基礎幹細胞培地に100ミリリットルを加えます。

次に、基底膜マトリックスを氷上で解凍し、次に補充した量のマトリックスを24ミリリットルの冷却dmmに加えます。メーカーが推奨するF 12基礎培地は、穏やかにピペッティングして溶液を混合し、次いで混合物の2ミリリットルを12の別々の6センチメートルプレートに加える。プレートを室温で1時間インキュベートし、マトリックスがプレートをコーティングします。

次に、培地を取り出し、2ミリリットルの幹細胞培地を追加します。次に、ヒト胚を含むインキュベーターから4つのコンフルエントプレートを取り出します。ステレオスコープ下で付属のintextプロトコルに記載されているように調製されたマウス胚性ファイバーブラストフィーダー層で増殖したH nine細胞は、1ミリリットルのピペットチップを使用して、プレートから分化したコロニーを除去します。

未分化コロニーは明確に定義された境界を持ち、細胞はコンパクトですが、分化した細胞は境界から増殖し始め、その細胞のサイズが大きくなります。培地を吸引し、細胞を4ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、ステレオスコープの8で2ミリリットルの幹細胞培地を追加します。

コロニーを26ゲージの針でそれぞれ6〜9個に切り、1ミリリットルのピペットチップで塊をこすり落とします。カットしたコロニーを50ミリリットルのファルコンチューブにそっと集め、200Gで5分間ペレット化します。次に、スナットを吸引し、細胞を12ミリリットルの幹細胞培地に再懸濁します。

20マイクロリットルの細胞懸濁液をスライドガラスの上に置き、顕微鏡下で凝集体の数を数えます。懸濁液の濃度を1ミリリットルあたり150塊に調整し、次に2ミリリットルの懸濁液を各6センチメートルプレートに追加します。プレートを前後左右に動かして細胞を均一に分散させ、その後、プレートを細胞培養インキュベーターで隔日でインキュベートします。

培地を慎重に交換する 分化したコロニーを除去した後、Vbo 96ウェルプレートの各ウェルに40マイクロリットルの滅菌5%ブロック共重合体溶液を加え、室温で45分間インキュベートします。コロニーを含むコンフルエントプレートをインキュベーターから取り出し、1ミリリットルのピペットチップを備えた実体顕微鏡で分化したコロニーを取り出します。次に、プレートから培地を吸引し、細胞を4ミリリットルのPBSで穏やかに洗浄します。

次に、各プレートに2ミリリットルのランダムな微分培地を追加します。継代ツールを使用して、H nine細胞コロニーを均一なサイズの塊に切断します。細胞スクレーパーで塊をこすり落とし、50ミリリットルのファルコンチューブ遠心分離機に穏やかに集めます。

コロニーは200Gで5分間凝集し、次いでスナットを吸引し、細胞およびランダム分化培地を1ミリリットル当たり1000凝集で再懸濁する。次に、Vボトム96ウェルプレートからブロック共重合体を吸引しますマルチチャンネルピペットの助けを借りて、各ウェルにコロニー懸濁液を100マイクロリットル追加し、プレートを摂氏4度で4分間遠心分離することにより、V字型ウェルの底に凝集塊を凝集させます400G.次に、より広いボア200マイクロリットルの先端を使用してインキュベーターにプレートを4日間置きます。96ウェルプレートから胚体を取り出し、滅菌済みの122ミリメートル四方プレートに入れます。

次に、10ミリリットルの滅菌血清ピペットを使用して、胚体を正方形のプレートから15ミリリットルのファルコンチューブに移します。胚体が2分間落ち着くのを待ってから、スナットを吸引し、5ミリリットルのPBSで胚体を洗います。再度、胚体が落ち着くのを2分間待ってから、上清を吸引します。

今回は、胚体を5ミリリットルのランダム分化培地に再懸濁します。次に、胚体を10センチメートルの細菌学的プレートに移し、さらに10ミリリットルのランダムな分化を追加します。中程度。プレートを摂氏37度、CO25%で水平シェーカーでインキュベートします。

50 RPMでは、代表的な胚体が5日目、9日目、および14日目に表示されます。1日おきに培地を慎重に交換し、15ミリリットルすべてを新鮮なランダムな区別に置き換えます。中程度。分化に対する薬物効果を評価するには、付属のテキストプロトコルに記載されているように、5日目に10日間、培地への薬物の追加を開始します。

滅菌ピペットを使用して、10センチメートルプレートから胚体を15ミリリットルのファルコンチューブに集めます。彼らが2分間落ち着くのを待ってから、上清を吸引します。それらを5ミリリットルのPBSで洗浄し、ヌクレアーゼフリーの1.5ミリリットルチューブに移します。

彼らが落ち着いてスナットレイズを吸引できるようにします。胚体を1ミリリットルのトリオール試薬に懸濁し、溶液を24ゲージの針に1ミリリットルの注射器で約15回通して細胞を破壊します。次に、各サンプルに200マイクロリットルのクロロホルムを追加します。

内容物を短時間ボルテックスし、その後、12, 000Gでサンプルを遠心分離し、摂氏4度で摂氏4度で、他の層を乱すことなく1.5ミリリットルのチューブに上清を収集します。次に、冷やした70%エタノールを等量上清に加え、内容物を振って穏やかに混合します。700マイクロリットルの混合物をミニスピンカラムに移し、メーカーの指示に従って、最終溶出ステップでRNAを精製します。

スピンカラムに22マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を適用し、チューブを12, 000Gで1分間遠心分離します。次に、コレクションチューブを取り外し、RNAを氷の上に置きます。H nine細胞のコンフルエントT 25フラスコ1個につき1ミリリットルの予熱ディスクスペースを追加し、フラスコを摂氏37度で9分間インキュベートします。

次に、2ミリリットルのプレウォームを追加します。変位した処理細胞まで培地を洗浄し、5ミリリットルのピペットで5回ピペットで静かに上下させます。細胞溶液をファルコンチューブに移します。

次に、フラスコを9ミリリットルの洗浄培地で洗浄し、細胞と一緒にチューブに加えます。PTは、500 G.Thenで3分半の間、その細胞を収穫し、スナットを取り外し、洗浄培地の10ミリリットルで細胞を再懸濁します。細胞を再び500Gで3分半PTし、次いでsup被覆液を除去し、細胞をヒト胚性幹細胞培地の4ミリリットルに再懸濁し、細胞懸濁液の0.5ミリリットルおよび新鮮な培地の4.5ミリリットルを、有糸分裂的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞を含む新鮮なPBS洗浄T25フラスコに加える。

フラスコの媒体は毎日交換してください。10cmの皿にPBS中の0.1%ゼラチンをコーティングし、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、培地を除去してヒト胚性幹細胞を採取し、細胞が分離している間にT 25フラスコに1ミリリットルのアクタを追加します。

6.6ミリリットルのコールドメディアを330マイクロリットルの凍結基底膜マトリックスに加えます。40 μmのセルストレーナーで溶液をろ過し、ろ過した溶液1ミリリットルを使用して、6ウェルプレートの各ウェルを覆います。細胞は、ヒト胚細胞をアキュテインと30分間インキュベートした後、コーティングされたプレート上に播種され、1.5ミリリットルのヘス培地を添加して反応を停止します。

フラスコから細胞をこすり落とし、さらに8ミリリットルのヘス培地を追加します。40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して10ミリリットルのピペットフィルターセルで穏やかにピペッティングしてシングルセル溶液を作製し、次いで細胞を3分間遠心分離する500Gで、S上清を除去し、細胞を再び500Gで3分間10ミリリットルの培地スピンセルに再懸濁する。岩石阻害剤Y 2 7 6 3 2を含有する10ミリリットルのHessS培地に細胞を最終濃度10マイクロモルで懸濁する。

次に、ゼラチンでコーティングされたディッシュプレートから上清を取り除き、ゼラチンでコーティングされたディッシュ上の細胞懸濁液を取り除き、摂氏37度で正確に1時間インキュベートします。このステップの間に、hypoplastは人間の胚性幹細胞が自由なままであるゼラチンで覆われた版に落ち着く。浮遊時間は、長いインキュベーションが幹細胞の凝集をもたらし、短いインキュベーションは、線維芽細胞が付着したときにこれらの線維芽細胞の一部のみを除去するため、非常に重要です。

プレート内の培地を使用して、非接着性幹細胞をプレートからやさしく洗い流します。プレートを10ミリリットルのヘス培地で再度洗浄し、細胞をプールし、細胞を500Gで3分間遠心分離し、得られたS上清を除去し、10マイクロモルの岩石阻害剤Y 2、7、6、3、2、および10ナノグラム/1ミリリットルのファイバーブラスト成長因子2を含む約4ミリリットルの馴化培地に細胞を再懸濁する。次に、細胞をトリアンブルーと混合し、ヘモサイトメータープレートでカウントしました。

地下室の前のプレート上の平方センチメートルあたり18, 000セル。メンブレンコーティングされたプレートは、ウェルあたり1.5ミリリットルの培地で細胞を覆い、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。24時間後、培地をリフレッシュします さらに24時間後、培地を新鮮な調整培地に変更し、1ミリリットルあたりわずか10ナノグラムの線維芽細胞成長因子を補充します 2 72時間。

細胞を播種した後、培地をノックアウト血清補充培地に交換します。この時点は、分化の 0 日目と呼ばれます。次の3日間、毎日新鮮な培地で細胞をリフレッシュします。

4日目と5日目に培地を交換する場合は、25%Nの2つの補充培地と75%ノックアウト血清の補充からなるものを追加します。培地は6日目に分析のために細胞を回収します。胚体は、さまざまな研究に使用できます。

これは、メチル水銀の濃度の変化が細胞の生存率に及ぼす影響を示す細胞毒性試験の例です。このグラフから、14日間のばく露後、点24マイクロモルが10%の細胞死を引き起こし、1.61マイクロモルの濃度が50%の細胞死を引き起こしたと判断されました。3つのメチル水銀処理群の胚体から単離されたRNAをマイクロアレイ上で実行し、さまざまなバイオマーカーを調べました。

ポイント25マイクロモル水銀にさらされたものは赤で示されています。1マイクロモルのメチル水銀に曝露されたものは青色で示され、コントロールRNAは緑色で示されています。この主成分分析マップは、メチル水銀の1マイクロモル濃度に曝露されたときに276を超える遺伝子が2倍以上修飾されたすべての中で、各治療グループの遺伝的特性が他のグループと有意に異なることを示しています。

これらの遺伝子のうち30個は、ポイント25マイクロモルの低濃度グループによっても修飾されました。このヒートマップでは、1 マイクロモル治療グループで修飾された遺伝子のうち 233 個がダウンレギュレーションされた遺伝子であり、治療によってアップレギュレーションされたのは 43 個のみであることがわかります。トリアゾールや発生アリを扱う作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には、セプティゴーグル、耐薬品性ハンドグローブの着用、ヒュームフードでのすべてのトリオール関連作業の実行などの予防措置を常に考慮する必要があることを忘れないでください。

この手順に従います。他の方法は、染色、フェロス形成、これはあなたのチューブ形成を混合する可能性があり、表現型の固定のような追加の質問に答えるために行うことができます。